专利名称：滇桂艾纳香药材的快速繁殖方法
技术领域：
本发明涉及一种通过组织培养技术的植物再生方法，尤其是一种专用于滇桂艾纳香快速繁殖及栽培的方法。
背景技术：
滇桂艾纳香经专家鉴定为菊科艾纳香属植物Bloumea megacephala(Randeria)Chang et Tseng，又名华艾纳香、管芽，是广西桂西制药有限公司主打产品滇桂艾纳香颗粒的主要原料，全草入药，产品具有活血化瘀、止血调经的作用，用于治疗瘀血阻滞，月经过多，经期过长，产后恶露不绝等妇科血症治疗总有效率达96％以上，产品年销售收入超6000万元，是一种经济价值极高的植物。
滇桂艾纳香药材对生长环境要求苛刻，适于在冬季≥-2℃，夏季≤35℃，温暖，雨水充沛的亚热带区域生长，喜阴喜湿，忌过强光照，栽培相当困难，迄今为止民间未有栽培历史。自1994年滇桂艾纳香颗粒药剂批量生产以来，滇桂艾纳香药材原料来源于野生的药材资源，年需求量达2000吨以上。经过多年的采掘，野生药材资源已逐步减少，而且药材的质量不稳定，不能满足已扩大的生产需求，需要进行大面积的人工栽培作为药材原料的来源。目前，野生滇桂艾纳香主要通过种子繁殖，由于该药材的种子胚组织发育不良，兼受季节、生长环境等因素的影响，种子的繁殖率低，发芽率低于5％，不能满足大面积人工栽培的需要；此外，由于是有性杂交繁殖，因而使后代产生遗传变异，造成质量不稳定，不利于药品生产过程的质量控制。通过种子繁殖法进行育种，繁殖速度慢，成活率低，难以满足大规模种植的要求，因此急需繁殖率高，速度快的的繁殖方法进行种苗生产。
经检索，迄今为止，国内未见有关于滇桂艾纳香相关育种及栽培研究的报道，国外也无相关的研究记录。
发明内容
本发明的目的是提供一种滇桂艾纳香组培苗繁殖的有效方法，增殖培养形成的种苗可直接用于大田种植，生产滇桂艾纳香药材，速度快，效果好，成活率高。
在本发明中，我们采用了植物组织细胞繁殖法和扦插繁殖法进行人工繁殖，属于无性繁殖，得到的药材遗传相对稳定，再配合统一、规范的栽培技术，生产出的药材质量稳定，符合药品生产企业的要求。经研究，该药材通过扦插的方式繁殖，经处理后，发芽率可达到70～80％，移栽成活率可达90％；采用植物细胞组织培养的方法，可在短时间内使滇桂艾纳香组培苗增殖迅速，其繁殖系数能达到4.0～6.0，移栽成活率也可达90％以上。通过以上两种方法进行育苗，不但可以获得大量的种苗，而且种苗移栽后，生长迅速，成活率高。
本发明所提供的滇桂艾纳香药材的繁殖方法有2种，分别为植物组织细胞培养繁殖法和扦插繁殖法。
将从野外采集的滇桂艾纳香外植体，其中包括滇桂艾纳香的茎尖、嫩茎、老茎、叶片、花苞、种子，将各部位洗净灭菌，通过植物细胞组织培养快速繁殖法和扦插繁殖法使滇桂艾纳香迅速增殖，培育种苗，所获得的种苗直接用于大田生产。
1、植物组织细胞培养繁殖法植物细胞组织培养快速繁殖法是将从野外采集的滇桂艾纳香外植体，其中包括滇桂艾纳香的茎尖、嫩茎、老茎、叶片、花苞、种子各部位洗净灭菌，洗净灭菌，切取适当规格的外植体接种于添加了植物激素和糖类的培养基上，进行愈伤组织的诱导、试管苗的诱导、试管苗的快速增殖培养、试管苗的壮苗培养、试管苗的生根培养，最后进行炼苗移栽，获得试管种苗。
植物细胞组织培养快速繁殖法所用的培养基为MS培养基，植物激素为BA、NAA、Met、KT、2，4-D其中的一种或多种激素联合使用，糖类为蔗糖，琼脂含量为3～7g/L，pH值4～7，各阶段培养条件为温度25～28℃，光照1000～1200Lux，光照时间为10～12h/d。
具体操作步骤如下(1)愈伤组织的诱导从野外取来的外植体经过消毒灭菌后，接种于MS+BA1.0～2.0mg/L+NAA0.1～0.5mg/L+蔗糖2～3％(质量百分比，以下同)，暗培养15～25天后诱导出愈伤组织；(2)愈伤组织的分化将诱导出的愈伤组织转入分化培养基MS+KT1.0～3.0mg/L+BA1.0～2.0mg/L+NAA0.1～0.5mg/L+蔗糖2～3％，20～30天后愈伤组织开始分化出小芽；(3)试管苗的继代增殖将试管苗转入MS+BA0.5～2.0mg/L+NAA0.1～1.0mg/L+Met0.5～2.0mg/L+蔗糖2～3％增殖培养基上，接种后25～30天从幼芽基部逐渐萌发丛生芽，继代增殖；(4)试管苗的壮苗将增殖培养的试管苗剪分后接到MS+BA0.5～4.0mg/L+NAA0.5～4.0mg/L+Met0.5～2.0mg/L+蔗糖2～3％壮苗培养基上，接种后25～30天获得健壮的试管苗；(5)试管苗的生根将壮苗培养后的无菌苗接种于MS+NAA0.1～0.5mg/L+蔗糖2～3％生根培养基上，接种后25～30天，从苗的基部长出根，成为完整植株。
(6)上述各培养基中琼脂含量为5g/L，pH值5.8，各阶段培养条件为除了愈伤组织的诱导为暗培养，其余各阶段培养为光培养，培养温度为25～28℃，光照1000～1200Lux，光照时间为10～12h/d。
2、扦插繁殖法扦插繁殖方法是将从野外采集的滇桂艾纳香壮枝，截取适当的长度(15～40cm)，进行诱导生根的浸泡处理，然后进行扦插，获得无性繁殖的种苗。
扦插繁殖方法所用的植物激素为NAA，IAA，IBA其中的一种或多种激素联合使用。
具体操作步骤如下(1)壮枝的选取将从野外采回的滇桂艾纳香枝条，选取直径为0.25～0.5cm的枝条，截成15～30cm小段。
(2)扦插前的处理将截取的枝条洗净，在由NAA，IAA，IBA配置成的溶液中浸泡4～8小时，溶液中NAA，IAA，IBA浓度各为0.5～2.5mg/L。
(3)扦插育苗将处理好的枝条插于沙池中，遮阳保湿培养，2周左右在枝条的叶柄基部位置长出嫩芽，继续培养4周左右长出新根，移栽成活率达90％以上。
本发明具有如下优点1.本发明主要利用滇桂艾纳香的茎尖、茎段、叶片、花苞作为外植体进行组织培养，比较全面系统地探索出一套对滇桂艾纳香快速繁殖的最佳培养体系。
2.繁殖速度快，繁殖系数达到4.0～6.0。
3.周期短，一个周期大约2～3个月。
4.移栽成活率高，组培苗地移栽成活率都达到了90％以上。
5.操作方法简单，只需要简单的设施，成本低。利用本发明，其移栽的试管苗可直接用于大田生产。全年皆可进行操作。
6.通过以上植物组织培养技术获得的种苗，遗传特性稳定，不会发生变异，适用于商业化生产。
7.本发明所提供的快速繁殖方法及栽培技术适用于各种类型滇桂艾纳香品种。
具体实施例方式
实施例1①愈伤组织的诱导将灭菌处理后的外植体不同部位接入诱导培养基中，外植体剪取的茎尖约长2cm、嫩茎约长3.5cm、老茎约长3.5cm、叶片大小为1.0×0.6cm2、花苞长度约为1.0cm。外植体接种数量视不同外植体部位而定，一般茎尖为3个/瓶，嫩茎为4段/瓶，老茎为4段/瓶，叶片为10块/瓶，花苞为10个/瓶。诱导培养基的配方为MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖2.0％+琼脂粉0.5％，(其中MS培养基为通用的基本培养基，本发明选用植物激素市场亦有售，2.4-D、NAA为中国医药(集团)上海化学试剂公司生产，6-BA、KT、IBA为Sanland international Inc.生产，IAA为上海生工生物工程有限公司，Met为北京振泰创业科技发展中心生产)培养条件为暗培养，15天后外植体诱导出愈伤组织，愈伤组织的诱导率最高可达93％。
②愈伤组织的分化当愈伤组织长到1.0×0.5cm2大小时，剪取愈伤组织接种于分化培养基，分化培养基为MS+KT1.0mg/L+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖2.0％+琼脂粉0.5％，培养条件为，温度为25～28℃，pH值5.8，光照1000～1200Lux，光照时间为10～12h/d，25天后愈伤组织分化出小芽。
③试管苗的继代增殖当滇桂艾纳香的试管苗长到1.5cm时，剪取芽体转入MS+BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+Met0.5mg/L+蔗糖2.0％+琼脂粉0.5％的增殖培养基上，培养条件同前，接种后30天从幼芽基部逐渐萌发丛生芽，平均每个幼芽可分化7～8株左右，再将幼芽剪下转入相同的培养基重复培养，大量繁殖。
④试管苗的壮苗将增殖培养的试管苗剪后接到MS+BA4.0mg/L+NAA4.0mg/L+Met2.0mg/L+蔗糖3.0％+琼脂粉0.5％壮苗培养基上，培养条件同前，接种后25天获得健壮的试管苗；⑤试管苗的生根将壮苗培养后的无菌苗接种于MS+NAA0.5mg/L+蔗糖3.0％+琼脂粉0.5％生根培养基上，培养条件同前，接种后25天，从苗的基部长出浅绿色或白色的不定根，长且多，生根率达到100％。
⑥炼苗移栽将生长势较旺盛的组培苗从培养室取出，放置于炼苗室中，室内温度保持在25℃左右，相对湿度保持在75％左右，避免阳光直射，在室温下放置5～7天后，将培养瓶盖打开进行2～3天炼苗，然后取出小苗，洗净粘在根部的培养基，移栽到装有灭菌基质的营养钵中，浇足水，时时保持基质的湿度，放置于遮阳篷下培养，温度保持在26℃左右。每周浇一次营养液，15天左右长出新根，成活率达到90％以上。
实施例2①无菌苗的诱导将经过灭菌处理的滇桂艾纳香茎段接种到诱导培养基上，诱导培养基配方为MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖2.5％+琼脂粉0.5％，培养条件为，温度为25～28℃，pH值5.8，光照1000～1200Lux，光照时间为10～12h/d，30天后从茎段的腋芽处分化出小芽。
②试管苗的继代增殖当滇桂艾纳香的试管苗长到1.5cm时，剪取芽体转入MS+BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+Met1.0mg/L+蔗糖2.5％+琼脂粉0.5％的增殖培养基上，培养条件同前，接种后20天从幼芽基部逐渐萌发丛生芽，平均每个幼芽可分化7～8株左右，再将幼芽剪下转入相同的培养基重复培养，大量繁殖。
③试管苗的壮苗将增殖培养的试管苗剪后接到MS+BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L+Met1.5mg/L+蔗糖2.5％+琼脂粉0.5％壮苗培养基上，培养条件同前，接种后20天获得健壮的试管苗；④试管苗的生根将壮苗培养后的无菌苗接种于MS+NAA0.2mg/L+蔗糖2.5％生根培养基上，培养条件同前，接种后20天，从苗的基部长出浅绿色或白色的不定根，长且多，生根率达到100％。
⑤炼苗移栽将生长势较旺盛的组培苗从培养室取出，放置于炼苗室中，室内温度保持在25℃左右，相对湿度保持在75％左右，避免阳光直射，在室温下放置5～7天后，将培养瓶盖打开进行2～3天炼苗，然后取出小苗，洗净粘在根部的培养基，移栽到装有灭菌基质的营养钵中，浇足水，时时保持基质的湿度，放置于遮阳篷下培养，温度保持在26℃左右。每周浇一次营养液，15天左右长出新根，成活率达到90％以上。
实施例3①壮枝的选取将从野外采回的滇桂艾纳香枝条，选取直径为0.25～0.5cm的枝条，截成15～40cm小段。
②扦插前的处理将截取的枝条洗净，在由NAA，IAA，IBA配置成的溶液中浸泡5小时，溶液中NAA，IAA，IBA浓度各为0.5～2.5mg/L。
③扦插育苗将处理好的枝条插于沙池中，遮阳保湿培养，2周左右在枝条的叶柄基部位置长出嫩芽，继续培养4周左右长出新根，移栽成活率达90％以上。
权利要求
1.一种滇桂艾纳香药材的快速繁殖方法，其特征在于将从野外采集的滇桂艾纳香外植体，其中包括滇桂艾纳香的茎尖、嫩茎、老茎、叶片、花苞、种子，将各部位洗净灭菌，通过植物细胞组织培养快速繁殖法和扦插繁殖法使滇桂艾纳香迅速增殖，培育种苗，所获得的种苗直接用于大田生产。
2.根据权利要求1所述的滇桂艾纳香药材的快速繁殖方法，其特征在于所述的植物细胞组织培养快速繁殖法是将从野外采集的滇桂艾纳香外植体，其中包括滇桂艾纳香的茎尖、嫩茎、老茎、叶片、花苞、种子各部位洗净灭菌，洗净灭菌，切取外植体接种于添加了植物激素和糖类的培养基上，进行愈伤组织的诱导、试管苗的诱导、试管苗的快速增殖培养、试管苗的壮苗培养、试管苗的生根培养，最后进行炼苗移栽，获得试管种苗。
3.根据权利要求2所述的滇桂艾纳香药材的快速繁殖方法，其特征在于植物细胞组织培养快速繁殖法所用的培养基为MS培养基，植物激素为BA、NAA、Met、KT、2，4-D其中的一种或多种激素联合使用，糖类为蔗糖，琼脂含量为3～7g/L，pH值4～7，各阶段培养条件为温度25～28℃，光照1000～1200Lux，光照时间为10～12h/d。
4.根据权利要求1所述的滇桂艾纳香药材的快速繁殖方法，其特征在于所述的扦插繁殖方法是将从野外采集的滇桂艾纳香壮枝，截取15～40cm的小段，进行诱导生根的浸泡处理，然后进行扦插，获得无性繁殖的种苗。
5.根据权利要求3所述的滇桂艾纳香药材的快速繁殖方法，其特征在于扦插繁殖方法所用的植物激素为NAA，IAA，IBA其中的一种或多种激素联合使用。
全文摘要
本发明提供了一种滇桂艾纳香药材的快速繁殖方法，将从野外采集的滇桂艾纳香外植体，其中包括滇桂艾纳香的茎尖、嫩茎、老茎、叶片、花苞、种子，将各部位洗净灭菌，通过植物细胞组织培养快速繁殖法和扦插繁殖法使滇桂艾纳香迅速增殖，培育种苗，所获得的种苗直接用于大田生产。本方法繁殖速度快，周期短，一个周期大约2～3个月。移栽成活率高，组培苗地移栽成活率都达到了90％以上。操作方法简单，只需要简单的设施，成本低，全年皆可进行操作。通过以上植物组织培养技术获得的种苗，遗传特性稳定，不会发生变异，适用于商业化生产。
文档编号C12N5/04GK101040602SQ20071003489
公开日2007年9月26日 申请日期2007年4月25日 优先权日2007年4月25日
发明者包国庆, 韦鹏霄, 岑秀芬, 陈卓, 张明珍 申请人:广西桂西制药有限公司