专利名称：一种兔抗人t淋巴细胞免疫血清的制备方法
技术领域：
本发明属于生物制剂原料制备方法领域，具体涉及到抗人T淋巴细胞免疫血清的制备方法。
背景技术：
抗人淋巴细胞免疫球蛋白(ATG)为一种生物免疫抑制剂，能与患者T淋巴细胞结合后，激活补体，抑制或除去人体内T淋巴细胞，临床上主要用于组织器官移植排异反应、急性再生障碍性贫血、自身免疫性溶血性贫血、原发性血小板减少性紫癜及其他恶性免疫疾病的治疗，市场需求量每年不低于200万支，具有广阔的市场前景。
目前，国内ATG的制备方法为使用人胸腺淋巴细胞作免疫原，免疫猪后得到抗人淋巴细胞免疫球蛋白制品原料血清，该原料经提纯、精制等工艺后成为猪抗人淋巴细胞免疫球蛋白制剂。该方法采用的人胸腺淋巴细胞取自医院6个月以上引产的死婴，随着国家计划生育政策的改革与完善，人民计划生育意识的提高，非正常分娩情况逐渐减少，细胞来源已经相当困难，原料不足已成为限制生产规模扩大的瓶颈。目前国内抗淋巴免疫球蛋白产品主要依赖进口，而国外产品的市场价格为4000元/支，超过国内同类产品价格的两倍以上。因此，无论从国内患者治疗成本的角度还是从中国生物产业的发展角度考虑，都应该大力发展自主品牌产品，而解决这一问题，首要问题在于解决免疫原料来源困难的问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有制备方法存在的原料来源困难的缺点，提供一种新的兔抗人T淋巴细胞免疫血清的制备方法。
为实现上述目的，本发明的方法包括1、细胞分离机采人外周血T淋巴细胞；2、0.85％生理盐水洗涤离心3次去除血小板；3、Hank’s缓冲液稀释，采用密度梯度离心法离心2-3次；
4、用小鼠抗人CD3单克隆抗体免疫磁株法去除B淋巴细胞，分离到T淋巴细胞；5、T淋巴细胞的传代培养5-6代；6、收集T淋巴细胞计数并检查活率；7、分三次进行动物免疫，采血并分离血清；8、按《中华人民共和国药典三部》的检测方法相关检测。
本发明的优点在于1、应用本发明的方法可以走出胸腺原料不足的瓶颈，扩大生产规模。
2、外周血T淋巴细胞培养制备的免疫原，在进行免疫时所需要的免疫量低于胸腺细胞的免疫量，能显著降低生产成本。
3、应用本发明的方法纯化的T淋巴细胞收率达到87％以上，纯度达到95％以上，以其作抗原制备的兔抗人T淋巴细胞免疫血清在细胞毒、玫瑰花环抑制实验等效价测定中，结果均超过了《中华人民共和国药典三部》规定所需达到的效价，而在抗人红细胞抗体与抗人血小板抗体等杂抗体的检测中，结果均低于中国生物制品规程中所要求的水平，该方法节省了大量的人力物力，大大降低了生产成本。
具体实施例方式
实施例一采用人胸腺T淋巴细胞免疫兔制备免疫血清。
收集6个月以上流产胚胎，无菌条件下进行胸腺分离，将离体胸腺用Hnak’s缓冲液洗涤后轻轻研磨，分散胸腺细胞并去除脂肪，收集胸腺细胞并计数，按1×106每毫升接种，培养基中加入可诱导胸腺细胞分化成成熟T淋巴细胞的各种细胞因子，待胸腺细胞中95％以上分化成成熟T淋巴细胞时开始收集细胞并计数，将成熟T淋巴细胞接种于含有各种刺激因子的外周血培养基，细胞接种量为1×106每毫升，培养并进行传代，共传6代，收集T淋巴细胞免疫新西兰兔，免疫分3次进行，免疫时间为70天，三次免疫剂量分别为5×107、1×108、1×108个细胞，采集免疫血清进行细胞毒实验、玫瑰花实验以及抗红细胞抗体滴度、抗血小板抗体滴度检测，检测结果见表1。采集检测合格的动物血清，混合后重新进行以上指标的检测，检测合格样品-20℃冻存备用。
表1常规方法制备的免疫血清检测指标
实施例二采用本发明方法进行兔抗人T淋巴细胞免疫血清的制备。
1、采血前对志愿献血员进行HBV、HCV、AIDS、梅毒等项目的检测，采用美国百特公司生产的CS-3000Plus Amicus机采集淋巴细胞，用Hank’s缓冲液洗涤后1000rpm、4℃离心10min，弃上清液，共洗涤离心3次。
2、用Hank’s缓冲液将淋巴细胞配成合适浓度的细胞悬液，加入适量比重调节液混匀后倒入装有淋巴分离液的试管中，2000rpm、4℃离心15min，共离心2～4次，加Hank’s液反复洗涤，1000rmp、4℃离心10min，至镜检无红细胞，且血小板＜10个/HP。
3、用小鼠抗人CD3单克隆抗体免疫磁株进行T淋巴细胞的分离将填好尼龙毛的注射器高压灭菌后固定在支架上，倒入37℃的细胞培养液清洗2～3次尼龙毛，关上阀门；将要分离的细胞液用预先加温的培养液稀释成适当的浓度，约5.00×107个细胞/ml，将细胞悬液倒入注射器内，使之没过尼龙毛柱，盖上注射器，37℃温育45min至1h；打开下口，缓慢放流(1滴/min)，收集于离心管中，离心即获所需的T淋巴细胞。
4、将T细胞配成1×107/ml的细胞悬液接种于RPMI-1640培养基(50ml/瓶)中，每瓶含有1ml T细胞悬液，于37℃、5％CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养72小时。
5、更换培养基，加入γIL-2，培养条件同上，视细胞生长情况每隔3-5天按合适的比例将细胞传代，培养3周左右收集细胞，用RPMI-1640、1000r/min离心10min，洗涤3～5次后计数。结果表明纯化的T淋巴细胞收率达到87％以上，纯度达到95％以上。
6、采用新西兰兔作为免疫动物，免疫程序为基础免疫采用肌肉注射的方式，抗原中加入完全佐剂，免疫剂量为3×107个细胞；加强免疫采用耳静脉注射的方式，抗原中不加入任何佐剂，两次加强免疫的剂量分别为4×107和3×107个细胞。加强免疫后8-14天后心脏采血于血袋中，3000rpm离心15min，在分浆夹上取出血清即抗人淋巴细胞免疫球蛋白原料，-30℃保存。
7、按《中华人民共和国药典三部》的检测方法作E玫瑰花环抑制试验、细胞毒试验、人红细胞抗体测定、人血小板抗体测定、异常毒性试验、热源试验、人血浆蛋白抗体测定及其他常规病原生物的检测。检测结果见表2。采集检测合格的动物血清，混合后重新进行以上指标的检测，检测合格样品-20℃冻存备用。
表2本发明制备的免疫血清检测指标
本发明技术已实现规模化生产，抗淋巴细胞免疫血清经北京生物制品研究所、武汉生物制品研究所、北京天坛生物制品股份有限公司、华南生物工程有限公司和中泰药业有限公司等用户检测，完全符合他们的生产要求，原料血浆质量深受用户好评。
权利要求
1.一种兔抗人T淋巴细胞免疫血清的制备方法，其特征在于采用人外周血T淋巴细胞培养细胞作为免疫原，兔为免疫动物，免疫程序为基础免疫采用肌肉注射的方式，抗原中加入完全佐剂，免疫剂量为3×107个细胞；加强免疫采用耳静脉注射的方式，抗原中不加入任何佐剂，两次加强免疫的剂量分别为4×107和3×107个细胞。
2.根据权利要求1所述的兔抗人T淋巴细胞免疫血清的制备方法，其特征在于人外周血T淋巴细胞细胞的获得方法为1)细胞分离机采人外周血T淋巴细胞；2)0.85％生理盐水洗涤离心3次去除血小板；3)Hank’s缓冲液稀释，采用密度梯度离心法离心2-3次；4)用小鼠抗人CD3单克隆抗体免疫磁株法去除B淋巴细胞，分离到T淋巴细胞；5)T淋巴细胞的传代培养5-6代；6)收集T淋巴细胞计数并检查活率。
3.根据权利要求2所述的人外周血T淋巴细胞的制备方法，其特征在于免疫磁株分离步骤中，采用条件为37℃温育45～60min。
全文摘要
本发明涉及一种兔抗人T淋巴细胞免疫血清的制备方法，采用人外周血T淋巴细胞培养细胞作为免疫原，兔为免疫动物。免疫程序为1次基础免疫和2次加强免疫，基础免疫抗原中加入完全佐剂，而加强免疫中不加入任何佐剂。所采集的合格血清沉淀免疫效价达1∶512，红细胞抗体效价低于1∶128，血小板抗体效价低于1∶8。应用本发明的方法可以显著降低生产成本，并且能走出胸腺原料不足的瓶颈，扩大生产规模。
文档编号C12N5/08GK101084923SQ20071003518
公开日2007年12月12日 申请日期2007年6月22日 优先权日2007年6月22日
发明者毛智立 申请人:岳阳博康生物技术有限公司