检测vte易感基因的基因芯片、其制备方法、用途及试剂盒的制作方法

专利名称：检测vte易感基因的基因芯片、其制备方法、用途及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因分析检测技术，具体涉及基因芯片技术，更具体涉及适用于检测 肺栓塞-深静脉血栓(VTE)形成遗传性易感者的基因检测芯片。
背景技术：
肺栓塞(Plumonary embolism, PE)是一种严重危害人类健康的肺血管疾患，其中 99%的栓子是血栓性质的，也称为肺动脉血栓栓塞症(pulmonary thrombo -embolism, PTE)。血栓的90%来源于腹腔、盆腔和下肢深静脉血栓形成(deep venous thrombosis, DVT) [1。因此，PE和DVT是静脉血栓症(venous thromboembolismVTE)的两个不 同阶段的临床表现2]。凝血功能亢进、血流停滞、静脉壁损伤是静脉血栓形成的三个 条件。到目前为止，西方仅少数几个国家报道了群体研究中DVT和PE的估计发病率。 在欧美国家，总人群VTE年发病率为0.1Q/。，并随着年龄增大逐渐增高，从15岁以下 人群的5/10万至85岁以上人群的1%[3，4]。据报道，中国台湾地区PE发病率约为欧美 国家的2/3，尽管我国内地PE缺少大规模的流行病学研究，但推测应与台湾类似。近 年来，我国PE诊断例数报道在逐年大幅升高，这已引起有关部门的高度重视。凝血功能亢进、血流停滞、静脉壁损伤是静脉血栓形成的三要素。围手术期因这 三要素叠加而造成的VTE在院内发生率高于院外，发生率高的是骨科、妇产科、普外 科、泌尿外科等科室的术后患者。术后发生PE的高峰时段为手术后1周内。VTE是 普通又复杂的疾病，谓之普通是在于临床常见，如下肢DVT,临床医生大多见过，习 以为常；谓之复杂，在于腹腔、盆腔静脉丛的DVT在临床则难以发现和诊断，甚至有 的VTE首次发现时已经到了PE阶段。术后发生的致死性PE，往往事先未能发现一丝 预兆，尸检的结论使医师们认识到了 VTE发生发展的复杂性，即使一个动态过程，是 一个全身性疾病。尽管腹腔、盆腔、双下肢深静脉发生DVT占全身深静脉系统的90% 以上，但全身静脉均有发生的可能性。影响和决定VTE的发生有诸多因素，包括机体 的内因和外因的作用，其中内因是发生疾病的基础，外因是促进发生的条件。年轻人 发生的VTE多时由于遗传性易栓至机体凝血、纤溶系统平衡功能的失衡，而手术或术后制动过度则是促其发生的外在条件。肺栓塞的临床表现呈多样化，较为复杂，.轻者仅引起轻微的呼吸急促，重者发展 为循环呼吸衰竭、甚至猝死，因此它的诊断和治疗相当棘手，死亡率很高。在西方国 家，肺栓塞的病死率占全部疾病死亡原因的第三位，仅次于肿瘤和心肌梗死。美国每 年约有5万 20万的患者死于PE，其中11%在发病1小时内死亡。我国阜外医院连 续卯0例尸检资料证实，肺段以上肺栓塞占心血管疾病的11。/。[5]。国外资料显示，未 经治疗的肺栓塞死亡率高达25% 30%，而得到及时诊断和治疗后，死亡率可降至 2% 8%[6]。因此，肺栓塞的早期识别与合理治疗对其预后影响至关重要。值得一提的 是，80n/。的PE患者发生在30y。的特定人群中。因此，在同样外部环境和创伤条件下， 其内部因素的研究十分必要。肺栓塞是一种高发病率、高死亡率、高误诊率的严重心肺疾病。近年来，众多学 者提出了PE和DVT是由于遗传和减环境异常造成的一种多基因、多因素疾病m。1965 年，Egeberg等率先报道了第一个反复发生静脉血栓的抗凝血酶m缺陷症家系，为常 染色体显性遗传，患者的AT-III含量仅为正常人的50n/。。此后，国内外学者陆续报道 或发现肺栓塞患者中存在其它大量的基因突变、基因多态性和基因的差异表达。现已 证实凝血因子V基因Leiden突变、凝血酶原基因G20210A突变、活性蛋白C抵抗、 蛋白C基因缺陷、蛋白s基因缺陷、抗凝血酶m基因突变、纤溶酶原遗传缺陷、纤 溶酶原激活抑制物基因多态性以及多态性所致高同型半胱氨酸血症、抗磷脂抗体综合 症、血管紧张素转换酶(ACE)基因插入/缺失多态性等与PE相关^121。在欧美国家， 主要以凝血因子V基因Ldden突变、凝血酶原基因G20210A突变、基因多态性所致 高同型半胱氨酸血症等多见，而我国则多见于活性蛋白C抵抗、蛋白C基因缺陷、蛋 白S基因缺陷、抗凝血酶III基因的突变等。在我国，PE相关基因研究落后于西方发 达国家，PE的发病机制研究滞后于国外，致使我国PE的诊断、治疗和预防水平尚落 后，大量国民因此病致伤、致残、死亡，特别是手术后发生的PE致死的患者屡见不 鲜。因此，研究检测中国汉族人群的PE及DVT相关基因的意义在于早期预防和早期 预测。早期预防方法通常包括药物和机械方法。药物预防方法有低剂量肝素、低分子 肝素和口服抗凝药。机械预防法(在出血风险大于预防用药受益的患者首选)目前使 用的有间断性下肢气囊泵和分级加压弹力袜。上述预防方法均可明显降低PE的发生 率。但是上述早期预防方法只能防止围手术期(也称手术全期，包括术前、术中及术 后)发生肺栓塞，再加上该疾病又缺乏临床特异性表现，因而对于那些不处于围手术期的人来说，是几乎无法做到早期预防的。可见目前最关键最重要的任务是应寻找到 一种快速有效的早期预测方法。20世纪90年代以来，随着分子生物学和DNA重组技术的发展，特别是人类基因 组计划的逐步开展，致病基因的研究可为PE发病机制的研究提供新的思路和方法。 然而目前，国内外对PE的病因学研究仍多集中于病理生理水平，较少有基因水平的 实验研究，尤其是mRNA的差异表达。基因芯片(genechip)是近几年"在高科技领域内出现的最具时代特征的重大科技 进展之一。基因芯片又称DNA芯片、DNA微点阵(DNA Microarray)，是指采用原 位合成或直接点样的方法，将许多特定的寡核苷酸片段或DNA片段作为探针，有规 律地排列固定于硅片、玻璃片或其它介质，然后运用碱基配对原理与待测的标记样品 进行杂交，再通过激光共聚焦荧光系统等对芯片进行扫描，并利用计算机系统对每一 个探针上的荧光信号作出检测和比较，通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分 子的数量，从而迅速得到所需要的信息[13。就基因芯片的本质而言，与Southern blot 和Northern blot是相同的，只是许多探针同时固定于一张芯片上，相同实验条件下同 步完成多种不同分子的检测。由此可见，基因芯片技术是以一种系统、整体的方法进 行研究，打破了 "一种疾病， 一种基因"的陈旧模式，整体宏观地研究生物体基因的 表达和功能。因此，基因芯片技术具有高通量、高敏感性、研究效率高、速度快、样 品需求量相对小等其它生物技术不可替代的优越性，可以全面、综合、系统地分析多 因素疾病，成为后基因组时代生命科学和医学研究强有力的工具，被广泛应用于各种 疾病的基础和临床研究。尽管基因芯片技术显示出如此多的优点，并逐渐被广泛应用，.然而正如前所述， 目前很少有从基因的角度去研究VTE的，更未检索到基因芯片技术的使用。本发明者 通过反复研究，筛选出差异表达基因，从中选取最具代表性的基因，制备而得基因检 测芯片，并且通过荧光标记1个正常对照者mix cRNA探针和9个患者cRNA探针， 将它们与基因芯片杂交证实该芯片的可靠性，从而完成了本发明。因此，本发明第一个目的是提供一种检测VTE易感基因的基因芯片。本发明第二个目的是提供所述基因芯片的制备方法。本发明第三个目的是提供一种检测VTE易感基因的方法。本发明第四个目的是提供一种检测VTE易感基因的试剂盒。发明概述本发明第一方面提供一种检测VTE易感基因的基因芯片，包括固相支持物和固定在所述固相支持物上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包含序列表中SEQIDNO.l、SEQ ID N0.2、 SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示序列。本发明提供的基因芯片还可以包括从SEQ IDNO.5至SEQ ID NO. 11所示序列中的一种或几种或全部。本发明提供的基因芯片还可以包括从SEQ ID N0.12至SEQ ID NO. 15所示序列中的一种或几种或全部。本发明提供的寡核苷酸探针的5'端还包含一段0-25聚的碱基寡聚T。 本发明第二方面提供上述基因芯片的制备方法，包括芯片的点制和封闭。 本发明第三方面提供一种检测VTE易感基因的方法，包括以下步骤1) 制备样品cDNA;2) 以所得cDNA为模板，合成荧光标记的cRNA;3) 将所得标记产物与本发明的基因芯片杂交；4) 检测基因芯片的杂交信号。 其中步骤2)还包括标记产物的纯化。本发明第四方面提供一种检测VTE易感基因的试剂盒，包括本发明的基因芯片和 使用说明书。发明详述本发明者根据众多学者提出的PE和DVT是由于遗传和/或环境异常造成的一种多 基因、多因素疾病的观点[7]，从基因的角度对VTE进行研究，即以基因芯片——选用 美国Agilent公司提供的44K人类全基因组oligo芯片(型号G4112A)为研究平台， 旨在利用其高通量、大规模、高度平行性和快速高效等特性，通过对肺栓塞患者和正 常对照组血浆mRNA水平的检测比较，大范围地观察各个基因表达的改变，探索肺栓 塞发病相关的敏感基因，筛选出具有共同趋势的差异表达基因。本筛选实验所用的 oligo芯片检测稳定性高、敏感性及特异性强，系统噪声低，重复性好，荧光检测技术 成熟；激光共聚焦扫描具有扫描快捷、敏感，图像质量高等特点，是目前比较先进的 基因表达谱筛选方法[14]。该芯片根据基因独一无二的区段来设计探针，所以比cDNA 芯片检测特异性高，同时比短片断oligo芯片检测敏感性强[15]。在该筛选实验中，采集样品后立即进行RNA抽提，以保证当时RNA表达状态，这是精确定量研究基因表达水平的重要前提。此外，RNA样品中的DNA碎片也会影 响后续的PCR反应，需要彻底纯化。本发明者采用了Qiagen公司的全血总RNA抽提 试剂盒及该公司的RNA纯化试剂盒，抽提和纯化了 RNA,保证了 RNA的质量，这 是芯片实验得以顺利进行的重要保障。该筛选试验采用每一个PE病例组RNA和同一个由正常对照者混合RNA比较， 从而保证了每张芯片结果的可比性，同时也使差异表达基因的筛选基本上排除了个体 差异。实时PCR是最敏感有效、最快捷、可重复性强的检测基因表达方法之一，其中 实时定量RT-PCR最常用，其比Nothern blot具有更高的灵敏度和更少的RNA需求量 [16，17]。因此本发明者采用荧光定量PCR(FQ-PCR)对部分随机抽取的差异表达基因进 行验证，进一步证明芯片实验数据的可靠性和精确性。该筛选实验结果表明芯片基因检出率高，重复基因点的平均变异系数变化小，说 明基因芯片实验的成功。同时，FQ-PCR实验的结果也再次证实了芯片数据的可靠性。本发明者从上述筛选实验中获得了非常宝贵的研究成果，发现有多条血液凝固相 关基因、免疫炎症相关基因、细胞分化凋亡相关基因、细胞生长维持相关基因、细胞 信号和传递类相关基因、细胞骨架和运动基因、离子通道和运输蛋白类基因、转录相 关基因、RNA/DNA结合相关基因等有差异表达，提示PE受许多基因和信号通路调控。 这也和国内外各种研究相符，再次证实PE是一种多个基因、多个因子共同参与和调 节的疾病。在这样的情况下，更需要一种多角度检测手段，在同样的实验条件下，有 效检测VTE易感基因。1.基因芯片的制备本发明者将序列表中SEQ ID N0.1-SEQ ID N0.4、 SEQ ID N0.5-SEQ ID NO.ll所示序列作为寡核苷酸探针固定于固相支持物上，经水化、封闭，获得基因芯片，避光 保存备用。除了 SEQ ID NO.l- SEQ ID NO.ll所示序列外，本发明者还将序列表中SEQ ID NO.12- SEQ ID NO.15所示序列的一种或几种或全部固定于固相支持物上，制成基因 芯片。本发明中所涉及到的SEQIDNO.l-SEQIDNO.15分别代表以下基因序列号基因名称所属类别SEQ IDNO.l蛋白C缺陷PS (PROS1)抗凝缺陷SEQ ID NO.2蛋白C缺陷PC (PROC1)抗凝缺陷SEQ ID NO.3TFPI缺陷抗凝缺陷SEQ ID N0.4异常纤维蛋白原血症G (FGG)纤溶缺陷SEQ ID N0.5凝血酶原G20210A突变(F2)抗凝缺陷SEQ ID N0.6凝血因子V Leiden突变(F5)抗凝缺陷SEQ ID NO.7FVIII (F8)凝血因子活性增加SEQ ID NO.8FXI (Fll)凝血因子活性增加SEQ ID NO.9FVII (F7)凝血因子活性增加SEQIDNO.10FIX (F9)凝血因子活性增加SEQIDNO.llFXII缺陷纤溶缺陷SEQIDN0.12异常纤维蛋白原血症A (FGA)纤溶缺陷SEQIDN0.13异常纤维蛋白原血症B (FGB)纤溶缺陷SEQIDNO.14纤溶酶原缺陷(PLG)纤溶缺陷SE(J ID NO. 15T-PA缺陷(PLAT)纤溶缺陷本发明提供的固相支持物可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼 龙膜，经活性基团(如醛基、氨基、异硫氰酸基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻 片、塑料片等。本发明基因芯片的制备可采用生物芯片的常规制造方法。例如，如果固相支持物采用的是修饰玻片或硅片，探针的5'端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针 配制成溶液，用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后 放置过夜使其固定，就可得到本发明的基因芯片。如果寡核苷酸探针不含氨基修饰， 则其制备方法也可参照王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；LL.Derisi 等，Science, 1997, 278:680和马立人，蒋中华主编的《生物芯片》，北京化学工业出 版社，2000， 1-130。2.基因芯片的检测1)血液总RNA的抽提和纯化本发明者将新鲜采集的血液立即进行RNA抽提血液经抗凝处理后，沉淀获得 白细胞；缓冲液溶解所得白细胞，用抽提试剂盒并按其说明抽提获得血液总RNA。通过琼脂糖凝胶电泳和Lab-on-chip对上述所得血液总RNA进行质量控制。采用纯化试 剂盒并按其说明对所得血液总RNA进行纯化，获得纯化的血液总RNA。2) 荧光标记cRNA的合成将如上所得纯化的血液总RNA在启动子引物作用下，合成cDNA。所得产物与荧 光分子混匀，加入转录反应体系，获得荧光标记的cRNA。采用纯化试剂盒并按其说 明纯化所得荧光标记产物，获得纯化的荧光标记的cRNA。随后对所得产物进行浓度 及插入率的计算。3) 标记cRNA探针与基因芯片杂交待探针片断化后加入杂交缓冲液混匀离心，滴加在固定支持物上，密封于杂交盒 中进行杂交。杂交完毕后使用洗涤缓冲液对杂交后的芯片进行洗漆，晾干备扫描。4) 生物信息学分析杂交结果通过Agilent扫描仪进行扫描获取图像，由图像分析软件Feature Extraction进行定 量分析及标准化处理，获得Ratio值。


图1是血液总RNA的琼脂糖凝胶电泳结果。图2是血液总RNA经Agilent 2100 Bioanalyzer质控检测结果。具体实施方案下面用实施例对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝非对本发明有任何限制。本领域技术人员在本说明书的启示下对本发明实施中所作的任何变动都将落在权利要 求书的范围内。实验材料主要试剂 令Cy5CTP:(美国PerkinElmer公司)； 今Cy3CTP:(美国PerkinElmer公司); 令DNase/Rnase-free水(美国Invitrogen公司)； 今20% N-Lauroylsarcosine Solution:(美国Sigma公司)； 今20XSSC:(美国Amresco公司)； 今Gasket slide:(美国Agilent公司)； 今Hybridization Chamber:(美国Agilent公司)；今Stabilization and Drying Solution:(美国Agilent公司)；今70%乙醇(Rnase-free):(上海生工生物工程技术有限公司)；今100%乙醇(上海生工生物工程技术有限公司)；今14.5Mp-巯基乙醉(美国Fluka公司)；令焦磷酸二乙酯(DEPC):(美国Sigma公司)；令dNTPs:(美国Promege公司);今乙二胺四乙酸(EDTA),分析纯(安徽合肥工业大学化学试剂厂)； 今TBS-D:含葡萄糖的Tris-缓冲盐溶液(美国Invitrogen公司)； 今PBS:磷酸盐缓冲液(Farco);今0.5M EDTA溶液的配置称EDTA-Na2 37.2g用140ml ddH20溶解，加入10MNaOH 14ml使EDTA-Na2溶解，再用10MNaOH溶液调至PH-8.0，加ddH20定容至200ml，高压灭菌备用； 今芯片杂交中lOXcontroltaiiets的配置低压冻干的control target中加入0.5ml无核酸酶水，漩涡振荡器振荡混匀后，离心5 10秒。-20卩避光保存2月，使用前再次振荡、离心。 今芯片杂交洗液I (6XSSC ， 0.005% Triton X-102)的配置:20XSSC 300ml， 10% Triton X-102 0.5ml，加DEPC水700ml定容至1L，经0.2pm滤过膜过滤后，振荡混匀密封保存于室温。 今芯片杂交洗液II(0.1XSSC ，0.005% TritonX-102)的配置20XSSC5.0ml， 10% Triton X-102 0.5ml，加DEPC水995ml定容至1L，经0.2nm滤过膜过滤后，振荡混匀密封保存于4°C 。 今缓冲液RPE的配置取试剂盒中Buffer RPE 11.0ml加入无水乙醇44.0ml，振荡混匀，密封保存。 今缓冲液RLT的配置取试剂盒中Buffer RLT 45.0ml加入14.5Mp-ME45(Hi1,振荡混匀，密封保存于室温1个月，备用。今50xTAE(电泳缓冲液)242gTris碱，57.1ml冰乙酸，100ml0.5M EDTA，定容到1000ml; 今琼脂糖(Agarose): 50g/瓶，(上海生工生物工程技术有限公司)；今溴化乙锭(EB), 5g/瓶，在100ml双蒸水中加入lgEB，磁力搅拌数小时确保完全溶解，制成溶液，置于棕色瓶中室温保存，(上海生工生物工程技术有限公司)； 今无菌超纯水MilUpore-plus纯水仪自制，高压灭菌待用；今电泳上样缓冲液0.25。/。二甲苯青F,0.25。/。溴酚蓝，40%蔗糖水溶液(TaKaRa)。 试剂盒今QIAampRNA Blood Mini kit (美国Qiagen公司)； 今QIAGEN RNeasyMini kit (美国Qiagen公司)；今Low RNA Input Linear Amplication and Labeling Kit plus (美国Agilent公司)； 今In situ Hybridization kit plus (美国Agilent公司)； 今凝胶回收试剂盒(美国Qiagen公司)。主要仪器 今紫外分光光度计(德国Beckman公司)；今医用净化工作台(苏州净化设备厂)；+ Millipore-plus纯水器(Millipore);令SHANGPINGJA2003分析天平(上海天平厂)；令PHS-25型酸度计(上海雷磁仪器厂)；今C02培养箱(Forma);今电泳仪(美国Bio-Rad公司)；今FR-200凝胶成像分析仪(上海复日科技公司)；今可调微量移液器(德国Eppendorf公司)；今台式冷冻高速离心机(德国Eppendorf公司)；今低温高速离心机(美国Sigma公司)；今UVP杂交炉(美国UVP公司)；今KC4酶标仪(美国BIOTEK公司)；+ Agilent 2100 Bioanalyzer:(美国Agilent公司)；+ Agilent扫描仪(美国Agilent公司)；今UVP紫外交联仪(美国UVP公司)今OmniGrid Microarrayer点样仪(美国GeneMachines公司)；令漩涡振荡器(美国Coleparmer公司)。实施例1基因芯片A的制备1. 点样液组成5pl 50%DMSO， 5^1与识别序列互补的寡核苷酸序列，使寡核苷酸终浓度为 ,M。2. 芯片设计点样的顺序为Cy3-T3、 cT3、 DMSO、 SEQIDNO.l、 SEQIDN0.2、 SEQIDN0.3、 SEQ IDNO.4及无关序列。其中第一列Cy3-T3既起到定位的作用，同时也可作为点样 的阳性对照列，通过该列点可以判断点样的成功与否；cT3列是杂交阳性对照列，该 列可显示杂交体系是否合适；DMSO为点样的阴性对照，因为点样液是由DMSO稀释 的，故用DMSO来作为点样的阴性对照，同时它也可作为一个背景的参考；无关序列 为杂交阴性对照，它可指示杂交的特异性的好坏。而中间的SEQ IDNO.l-SEQ ID NO.4为靶点，分别用来识别各SNP位点。它们是人工序列， 3.芯片点制采用Gene Machine公司生产的Omni GridTM微点阵点样仪，按16x8的矩阵点在 载玻片上，即16个靶位点，每个重复8次。点样温度为19-22°C，点样湿度为55-65%。 点样后避光放置4-12小时(可放置过夜)，保持湿度为65-75%，待芯片干燥。芯片干 燥后置于紫外交联仪中，用600MJ强度固定，置室温放置30分钟，然后取出水化过 夜。水化的过程为将芯片置于盛有饱和NaCl溶液的湿盒内，42。C过夜，水化时芯片 放在湿盒内的架子上，不要接触液面。水化可使点在玻片上的寡核苷酸竖立起来，避 免与玻片粘在一起，影响后面的杂交。封闭将水化好的芯片置于封闭液中，在55。C水浴锅中温育约20-30分钟，然后 用无菌去离子水洗3次，置于50ml离心管中于1500rpm离心5分钟，去掉芯片上残 留的水渍。封闭液的体系为BSA0.05g; 20xSSC5ml; 10%SDS lml;加水至最后体 积为50ml。杂交完成后，用0.1MSDS洗片1分钟，片子上下抽动数次。再用水洗1 分钟，然后置于离心管中1500rpm离心5分钟，在离心过程中注意避光。完后，将芯 片避光保存备用。实施例2基因芯片B的制备1. 点样的顺序Cy3-T3、 cT3、 DMSO、 SEQ ID N0.5-SEQ ID NO.ll、无关序列。2. 制备方法同实施例1所述的制备方法。实施例3基因芯片C的制备1. 点样的顺序Cy3-T3、 cT3、 DMSO、 SEQ ID N0.1-SEQ ID N0.15、无关序列。2. 制备方法同实施例1所述的制备方法。实施例4血液总RNA的抽提1.实验前准备1) 试剂采用QIAampRNA Blood Mini kit,整个操作过程为无RNA酶(RNase Free)2) 配置缓冲液RPE和RLT (参见"主要试剂"部分)；3) 采集研究对象(肺栓塞患者和正常对照者)外周新鲜静脉血5ml，置于含有50jil 0.5M EDTA的抗凝管，用于RNA的抽提。2. 收集白细胞取1.2ml血标本加入含有6ml EL缓冲液(buffer EL)的离心管；冰水中孵育1015分钟，漩涡振荡器迅速混匀2次，溶液变清表明红细胞已裂解，必要时延长时间至 20分钟；4。C下400xg离心IO分钟沉淀白细胞后，弃去含有裂解红细胞的上清液；取 600W Buffer RLT加入成团的白细胞中，漩涡振荡充分混匀。3. 抽提总RNA:用移液器将溶解产物加到一个固定在2ml收集管上的QIAshredder自旋柱，全速 离心2分钟使其匀浆化，弃QIAshredder自旋柱，收集匀化的溶解产物；加入等体积 的70%乙醇，用移液器反复轻轻抽吸数次混匀；小心吸取样品(包括所有的沉淀)加 入到一个固定在2ml收集管上的新QIAamp自旋柱，8000xg离心15秒；QIAamp自 旋柱的最大结合能力为700nl，若>70(^1，则连续负荷剩余部分到柱上，并同匕离心； 转移柱子到提供的一干净新的2ml收集管，加入700plBufferRW1至自旋柱上洗柱， 8000xg离心并弃去2mi收集管及流出液；把QIAamp自旋柱转入另-提供的新2ml 收集管，吸取500^1 Buffer RPE至自旋柱，如上方法离心后，弃去2ml收集管；小心 打开QIAamp自旋柱，加入500W Buffer RPE，盖好后，极速(20,000xg， 14，000rpm) 离心3分钟；把柱子转移到一清洁的1.5ml禽心管(Eppendorf管)，并用30 50pl无 RNA酶水洗脱RNA，确保无RNA酶水直接加到QIAamp膜上，8000xg离心1分钟； 重复上一步操作1次。实施例5血液总RNA的质量控制1.琼脂糖凝胶电泳1) 实验前准备配置用DEPC处理的电泳缓冲液50xTAE，高压灭菌后待用；使 用电泳槽前用3°/( 202浸泡15分钟，然后用DEPC水冲洗，倒入适量lxTAE电泳缓 冲液；2) 琼脂糖凝胶电泳称取适量琼脂糖，加入lxTAE电泳缓冲液，制备1%的胶； 用专用6x加样缓冲液(Loadingbuffer)做指示剂，取1(^1上样；电泳(电压100伏) 15分钟；关闭电源，取出电泳胶，在凝胶成像仪上观测、拍照，保存图像；通过目测 28S和18S的亮度比例初步评价总RNA的质量。 一般认为28S:18S2可以初步判定总 RNA质量较好。正常对照组及患者组的全血总RNA经分光光度计检测，OD26o/OD28。达1.68-2.05。 血液总RNA的琼脂糖凝胶电泳结果见图1。其中，泳道A是正常对照组全血总RNA，泳道B-D是患者组全血总RNA。电泳结果可见较清晰的28S、 18SrRNA条带， 且28S条带的宽度基本接近18S的2倍，初步判定总RNA质量较好。2. Lab-on-chip取出400^1 RNA凝胶基质，加入Spinfiter柱子，离心过滤凝胶(1500xg, 10分 钟)；取出130^1过滤胶到1.5mlEppendorf管中，再加入2iilRNA染色液(RNADye Concentrate),在漩涡振荡器上振荡混匀；用RNAZAP清洁操作区，同时在Electrode cleaner中加入350pl ZAP,放入Lab on chip正确位置，合盖清洁探头1分钟；再在另 一 Electrode cleaner中加入350^1 DEPC水，重复上步；取出一新的RNA Chip,吸取9^1 制备的凝胶加入G孔中；将chip放置于水平台上chip priming station,将plunger拉杆 向上拉到lml刻度，再将chip priming station的盖子合上，压紧chip。同时向下推动 拉杆至底部并维持30秒，松开让拉杆自动弹开。从chip priming station上取出芯片，用放大镜检査是否有气泡存在，必要时，重复 上步操作。再在标有G的两个孔中各加入9pl凝胶，在标有入^^的孔中加入5^1 RNA 6000 Nano Marker。同时在12个加样孔中滴加5^1 RNA 6000 Nano Marker;取1^1 RNA 6000 ladder滴加到标有入[^的孔中，再各取liil样品加入12个样品孔中，并将chip 放入IKA漩涡器(IKAVortexer)上，在set-point振幅处振动1分钟；振荡好后的chip 在5分钟之内必须放入Agilent 2100分析仪上，按照软件提示进行RNA电泳操作，评 价RNA质量。部分全血总RNA经Agilent 2100 Bioanalyzer质控检测的结果见图2。RNA质控证 实已经提取到高纯度的总RNA。实施例6血液总RNA的纯化采用QIAGEN RNeasyMini kit进行血液总RNA的纯化，整个过程无RNA酶存 在(RNaseFree)，方法如下取总RNAS100 溶解于100nl RNase-free水中，加入350pl Buffer RLT并充分混 匀；加入25(HU无水乙醇稀释RNA， Tip头充分混匀；将共计700 ^含总RNA的溶液 转入套在2ml离心管内的RNeasy柱子内，k8000xg OlO，OOOrpm)离心15 30秒， 弃去滤过液和离心管；将RNeasy柱转入一新的2ml离心管，吸取500nl缓冲液RPE 到RNeasy Mini柱子内，S8000xg (Sl0,000rpm)离心洗涤15 30秒，弃去滤过液； 再用500nl缓冲液RPE加到RNeasy Mini柱子内，S8000xg OlO，OOO卬m)离心洗涤2分钟，干燥RNeasy硅胶薄膜，弃去滤过液和2ml套管；将RNeasy Mini柱子转入一 新的1.5mlEppendorf管中；吸取40 |il RNase-free水直接加至RNeasy硅胶膜上，同 上离心洗脱l分钟；重复上一步操作l次。实施例7 cDNA的合成1. 实验前准备将5xFirstStandBuffer在65'C中保温3-4分钟，振荡离心后备用。2. 合成cDNA:取400ng总RNA加入1.5ml微离心管中；加入1.2jil T7启动子引物；加入RNase-free 水至反应液总量为11.5jil; 65'C孵育10分钟，使引物及模板变性；放置冰浴5分钟。 如表1配置cDNA合成体系(总体积为8.5^1)，将其加入冰浴的RNA中，混匀；40 t:循环水浴2h; 65。C孵育10分钟；冰浴5分钟后，离心30秒。表1 cDNA合成体系<table>table see original document page 15</column></row><table>应体系，并用Tip混勾；40。C孵育2h。 实施例9荧光探针纯化1. 实验前准备1) 将离心机预冷至4'C;2) ^0^探针纯化采用1^化&3丫@]^1111^，整个过程为无RNA酶。2. 纯化待实施例6所述反应结束后加入20pl无RNA酶水，使离心管溶液总量至100|al; 加入350W缓冲液RLT，并充分混匀；加入250nl无水乙醇，Tip充分混匀；将共计 700^1含cRNA的溶液转入套在2ml离心管内的RNeasy Mini柱子内，13,000rpm离心 30秒，弃去滤过液和离心管；把RNeasy柱转入一新的离心管，吸取50(HU缓冲液RPE 加入柱子内，同前离心30秒，弃上清液；再用50(^1缓冲液RPE于13，000rpm离心洗 涤2分钟，弃滤过液和2ml套管；将RNeasy柱转入了一新的1.5mlEppendorf管中； 吸取30^1无RNA酶水直接加至RNeasy柱的滤过膜上，1分钟后于13,000rpm离心 30秒，保留套管及滤过液；重复上一步操作l次，收集滤过液60^1，弃RNeasy柱。实施例10芯片杂交和洗涤1.芯片杂交1) 如表3配置2xcRNA靶(target)溶液(总体积240nl):2) 如表4配置lx杂交(hybridization)反应液(总体积250^1):表3 2xcRNA靶溶液的配置 表4 lx杂交溶液的配置<table>table see original document page 16</column></row><table>轻轻混匀2xcRNA靶溶液，60"C避光水浴30分钟使探针片段化；加入250^1杂 交缓冲液，轻轻混匀离心；将杂交溶液滴加在盖玻片上，小心轻轻地盖上芯片，避免 产生气泡；密封芯片于杂交盒中，6(TC滚动杂交17h。2.芯片洗涤1) 实验前准备配置洗液I、洗液II (见"主要试剂")；2) 洗涤取出杂交完毕的基因芯片于洗液I中洗涤1分钟；取出芯片，将其放入洗液II中洗涤1分钟；最后将芯片放入洗液m(稳定干燥溶液，Stabilization and Drying Solution) 中洗涤30秒，晾干备扫描。实施例ll生物信息学分析1. 基因芯片扫描本实验将9张实施例1所得基因芯片A、实施例2所得基因芯片B采用Agilent 扫描仪进行扫描来获取图像，Imagene软件读取数据，图像为16-bit tiff文件；扫描像 素值10jxm， PMT (%)数值100。2. 芯片数据处理1) 数据读取与标准化处理图像直接使用Agilent系统相应的图像分析软件Feature Extraction进行定量分析及 标准化处理。通过对荧光、背景和标准化方式(Linear &LowesS) [18]等参数的设定， 图像定量和数据标准化处理一步完成，最后以列表等形式输出。输出的数据通常包括 荧光信号、背景信号、标准化后荧光信号与LogRatio值(两种荧光Cy3与Cy5比值 的对数值)等参数。2) 部分参数说明a. 用基因点Cy3信号的前景信号值减去它的背景信号值，得到该基因点的Cy3 信号实际强度值；b. 用基因点Cy5信号的前景信号值减去它的背景信号值，得到该基因点的Cy5 信号值；c. Ratio (Cy3/Cy5):基因点Cy3信号值与Cy5信号值标化后的比值，简称Ratio。3) 固定于本发明所述基因芯片上的核酸分子为VTE差异表达基因的判断标准a. 上调基因9组数据中7组Ratio^2，其余组Ratio》l;b. 下调基因9组数据中7组Ratio《0.5，其余组Ratkx:i。3. 芯片扫描结果芯片A数据见表5，芯片B数据见表6。表5基因芯片A试验数据表<table>table see original document page 18</column></row><table>表6基因芯片B试验数据表<table>table see original document page 18</column></row><table>根据实验数据表明，SEQIDN0.1-N0.4均符合差异表达基因的判断标准；SEQ ID NO.5-NO.ll的数据结果虽有偏差，但是可能受数据方差值的影响，有些许偏差。参考文献[1]王乐民、魏林主编，肺栓塞与深静脉血栓形成[M].北京人民卫生出版社，2001， 17-20。[2] CharleboisD，肺栓塞的早期识别降低死亡率的关键[J]. J CardiovascNurs. 2005; 20(4):254-259。[3] White RH，静脉血栓栓塞的流行病学[J].Circulation;2003; 107: 14-18.[4] Uresandi F， Blanquer J, Conget F，等，肺栓塞的诊断、治疗和随访指南[J]. Arch Bronconeumol. 2004;40(12):580-594。[5]王乐民、魏林主编，肺栓塞与深静脉血栓形成[M].北京人民卫生出版社，2001， 32-33。[6] European Society of Cardiology.急性肺栓塞的诊断和治疗指南.肺栓塞的特遣部队，European Society ofCardiology [J]. Eur Heart J. 2000;21(16):1301-1336。 [7] RosendaalFR,静脉血栓多病因疾病[J]. 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Nucleic Acids Res. 2002;30(4):E15。SEQ匿E LISTING<110〉同济大学附属同济医院 王乐民 郜恒骏<120〉检测VTE易感基因的基因芯片、其制备方法、用途及试剂盒' 〈130〉 CN061022 <160> 15〈170> Patentln version 3.3〈210〉 1〈211> 55<212> 腿<213> 人工合成<德 1tgggagttca tagttttcct tgaatccaac ttttaattac cagagtaagt tgcca 55〈210〉 2<211〉 55<212> DNA 〈213>人工合成<2cagaagacca agaagaccaa gtagatccgc ggctcattga tgggaagatg accag 55<210> 3<211> 55〈212〉 DNA 〈213〉人工合成<400〉 3gtga柳tgg tccgaatggt ttccaggtgg ataattatgg aacccagctc aatgc 55〈210〉 4<211〉 55〈212〉 DNA 〈213>人工合成<400〉 4accctgagga tgatttgtag aaaattaact gctaacttct attgacccac aaagt 55<210〉 5<211> 55<212〉 DNA<213> 人工合成〈400〉 5actgac幼ca tgttctgtgc tggttacaag cctgatgaag ggaaacgagg ggatg 55〈210〉 6〈211> 55〈212〉 腿 〈213〉人工合成〈400〉 6gtcctctgaa atgtatgtaa agagctatac catccactac agtgagcagg gagtg 55<210〉 7<211> 55〈212> DNA <213>人工合成<400> 7agtatagtca caatccacaa atgatgcagg tgcaaatggt ttatagccct gtgaa 55<210> 8<211> 55〈212〉 DNA <213〉人工合成〈400〉 8agtgccagaa gagatacaga ggacataaaa taacccataa gatgatctgt gccgg 55〈210〉 9〈211〉 55〈212> DNA 〈213>人工合成<400〉 9attcaaagag actaatagag acac卿gat ggaatagaaa agatg卿gg cagag 55〈210> 10〈211> 55<212> DNA 〈213〉人工合成〈400〉 10agctagtaga gactttgagg aagaattcaa cagtgtgtct tcagcagtgt tcaga 55<210〉 11<211> 45〈212> 腿 〈213>人工合成〈400〉 11tgattccgga ggcccgctgg tgtgtgagga ccaagctgca gagcg 45<210> 12<211> 55〈212> 腿 〈213>人工合成<德 12gaagcttctc tctgcaacct tgaagactat tggtttgaga acttctcttc ccata 55〈210> 13<211> 55<212> DNA 〈213>人工合成〈400〉 13ttctcttgct caccaagaag taacaaaagt atagtUtga cagagttggt gttca 55<210> 14〈211> 55<212> DNA〈213〉 人工合成<德 14gtgatgagaa ataattaatt ggacgggaga cagagtgacg cactgactca cctag 55<210〉 15<211〉 55〈212> 瞧<213〉 人工合成〈400〉 15caggaaagac ggattgcatt agaaatagac agtatattta tetgtcacaag agccc 5权利要求
1. 一种检测VTE易感基因的基因芯片，其特征在于包括固相支持物和固定在所述固相支持物上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包含序列表中SEQ ID NO.1、SEQID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示序列。
2. 如权利要求1所述的基因芯片，其特征在于还包括序列表中从SEQIDN0.5至SEQ ID NO. 11所示序列中的一种或几种或全部。
3. 如权利要求1所述的基因芯片，其特征在于还包括序列表中从SEQ ID N0.12至SEQ ID NO. 15所示序列中的一种或几种或全部。
4. 如权利要求1或2或3所述的基因芯片，其中所述寡核苷酸探针的5'端还包含一段 0-25聚的碱基寡聚T。
5. 权利要求1或2或3所述基因芯片的制备方法，其特征在于包括芯片的点制和封闭。
6. 如权利要求5所述的制备方法，其中所述点制包括点样、固定和水化。
7. 如权利要求5所述的制备方法，其中所述封闭是在含BSA 0.05g、 20xSSC 5ml和 10%SDS lml的封闭液50ml中温孵。
8. —种检测VTE易感基因的方法，包括以下步骤1) 制备样品cDNA;2) 以所得cDNA为模板，合成荧光标记的cRNA;3) 将所得标记产物与权利要求1或权利要求2所述基因芯片杂交-，4) 检测基因芯片的杂交信号。
9. 如权利要求8所述的方法，其中所述步骤2)还包括标记产物的纯化。
10. —种检测VTE易感基因的试剂盒，其特征在于包括权利要求1或2或3所述基因 芯片和使用说明书。
全文摘要
本发明提供一种检测肺栓塞-深静脉血栓易感基因的基因芯片及其制备方法，还提供一种检测肺栓塞-深静脉血栓易感基因的方法及试剂盒。本发明的产品和方法可用于检测肺栓塞-深静脉血栓易感基因，为预测肺栓塞-深静脉血栓发生危险提供必要信息。
文档编号C12Q1/68GK101245371SQ20071003756
公开日2008年8月20日 申请日期2007年2月14日 优先权日2007年2月14日
发明者王乐民, 郜恒骏 申请人:同济大学附属同济医院;王乐民;郜恒骏