光高粱的检测引物及检测方法

专利名称：光高粱的检测引物及检测方法
技术领域：
本发明属于农业植物检验检疫技术领域，具体地涉及一种利用分子生物学检 测技术快速准确地检测光高粱的检测方法以及用于该方法的检测引物，适合于口 岸检验检疫、农业生产、植物保护等领域使用。(二) 背景技术光高粱(Sorghum.nitidum (VaW) Pers)是世界十大恶性杂草假高粱的近似种， 光高粱最早发现于印度西部，后传播到东南亚、印度尼西亚、澳大利亚等国。光 高粱为多年生，且产生根茎，其形态和染色体大小与假高粱相似。Y.Sun等(1994) 曾认为光高粱应归入Sorghum区组，而DeWet (1978)， Guo (1996)等则建议 将其并入Parasorghum中，近似种的存在为口岸检疫准确快速鉴定假高粱增加了 困难。实际工作中，农产品中夹杂的假高粱等杂草种子的外观特征往往会因运输受 到磨损与变型，同时由于环境、气候、栽培条件的影响、种子成熟度的不同等引 起的个体差异，更为形态鉴定增加了难度，而细胞生物学方法等不仅需要较长的 周期，而且仅依据染色体的形态仍难以鉴定。(三)
发明内容
技术问题本发明的目的在于克服上述现有技术中关于形态鉴定和细胞生物学方法存在 的困难，提出釆用分子生物学方法，针对核糖体序列设计光高粱的特异性引物， 建立光高粱PCR检测方法，以达到快速准确检测鉴定的目的。技术方案目前，未见有光高粱的PCR方法鉴定报道，本引物是针对光高粱的rDNA 的内转录间隔区序列设计的。18S 26S核核糖体DNA(nrDNA)的内转录间隔区 ITS被5.8S分为ITS1和ITS2两部分。ITS区在植物核基因组中是高度重复的。 全部nrDNA重复单位包括4万个拷贝以串联重复(tandemrepeats)方式出现在一个 或多个染色体基因位点上(Regers & Bendich 1987，综述见Hamby & Zimmer 1992)。在被子植物中，ITS区既具有核苷酸序列的高度变异性又有长度上的保守 性，说明这些间隔区的序列很容易在近缘类群间排序，而且丰富的变异可在较低 的分类阶元上(如属间、种间)解决植物系统发育问题。屈良鹄和陈月琴(1999)通 过对不同生物类群的ITS序列(自生物学数据库)的比较得出被子植物大多数科 属的ITS序列的种间差异值为1.2% 10.2%，属间差异值为9.6% 28.8%，这对系统发育研究来说都是较合适的范围。本发明的重点是用于检测光高粱的引物N3/N5以及所述的引物序列的完全 互补链。针对光高粱ITS序列的特异性位点差异，设计了检测光高粱引物N3/N5，建立了光高粱种子的PCR检测技术。 光高粱PCR的检测方法，包括。 检测过程如下 1种子DNA获取单粒种子研磨粉碎，按照以下步骤提取1) 液氮中碾种子于1.5mL离心管中，加入500nL TES,TES由100mM Tris (pH8.0)， 10mMEDTA， 2%SDS组成；2) 加7nL蛋白酶K混匀，置于55'C水浴60 120min,期间混匀几次；3) 调节盐浓度至1.4M，加1/10体积的10%十六垸三甲基溴化铵，置于65 'C水浴10min;4) 加入等体积的SEVGA混匀，SEVGA为氯仿异戊醇==24: 1，不能太 剧烈，以保证DNA的完整性，0'C孵育30min;5) 4°C 13，000r/min离心10min，取上清夜至L5mL离心管中；6) 力卩225pL 5M醋酸铵混匀，(TC孵育30min以上，4°C 13，000r/min离心2min;7) 取上清，加入3pL核糖核酸酶A， 37。C水浴30min，以去除RNA;8) 加0.55体积的预冷异丙醇，-201:放置301^11以上；9)4'C13，000r/min离心15 20min，弃异丙醇，70%乙醇洗2次。室温干燥， 50nLTE或双蒸水溶解，TE为10mMTris， lmMEDTA (pH8.0)。2 PCR扩增利用引物N3 ( 5， 一 GGCGTCAAGGAACACTTATA — 3， ) /N5 ( 5， 一 ACGTCCCTCCTCCCCTCT —3，)；进行PCR扩增，PCR反应总体积为30^1， 包含1Ommol/L三羟基氨基甲烷盐酸盐Tris-HCl; 50mmol/L KC1 (pH8.3); 1.5mmol/L MgC12; dATP， dGTP， dCTP， dTTP浓度为lOOpmol/L;引物浓度 100nmol/L: 0.5U Taq DNA聚合酶(宝生物工程有限公司)。加双蒸水至终体积 为30pl，混匀离心，置于PCR仪进行扩增。扩增反应程序预变性95。C 3min; 然后94。C 30s, 60。C30s, 72。Clmin，循环30次。3琼脂糖凝胶电泳取扩增产物10pL，加入3pL上样缓冲液
,混匀，1.5%琼脂糖凝胶电泳。电泳，EB染色后于凝胶成像仪中成像存 盘。有益效果传统光高粱的鉴定传统的鉴定方法是利用种子形态学特征、细胞生物学特征等。外观形态鉴定 作为能便捷地辨别不同植物的外部特征对不同种植物进行分类而成为口岸检疫 杂草的重要手段之一。但是，由于进口的农产品中因脱落、干燥、储运、装卸等 原因，夹杂的杂草种子的外观特征往往会因此受到磨损与变型，同时由于环境、 气候、栽培条件的影响、种子成熟度的不同等引起的个体差异也是难免的，这样 就给外表形态鉴定带来了困难。而细胞生物学方法等不仅需要较长的周期，而且 仅依据染色体的形态仍难以鉴定。光高粱的特异性检测光高粱的近似种，包括黑高粱(SorghumalmumParodi)、拟高粱(S.propinquum (Kunth.) Hitchc.)、苏丹草(S.sudanense (Piper) Stapf)、 二色高粱(S.bicolor (L.)Moench)以及假高粱(Sorghumhalepense(L.)Pers)。它们的籽实与光高粱极为相似， 但是其危害性及检疫地位各有不同。利用引物可以特异性区分光高粱。一、 验证测试实验内容 光高粱的PCR鉴定二、 测试材料1、 PCR鉴定所用材料假高粱1个，黑高粱1个，光高粱10个，拟高粱1个，二色高梁1个，苏丹 草l个(表l)。表l、 PCR扩增所用材料编号拉丁名来源1中国连云港2澳大利亚澳大利亚4澳大利亚澳大利亚6澳大利亚了澳大利亚8澳大利亚9澳大利亚10澳大利亚11澳大利亚12S.Wco/or(五沙王)中国农科院13南京14美国15澳大利亚三、验证测试实验结果通用引物检测DNA提取效果见图1。 PCR特异引物检测见表2及图2。表2 PCR检测光高粱及其近似种结果样品编号检测结果样品编号检测结果1+9+2+10+3+11-4+12-5+13-<table>table see original document page 8</column></row><table>"+ ":阳性；"—'，:阴性四、结论1、 检测结果与实验材料完全相符。2、 检测时间大大縮短，可以在l个工作日内完成检测；3、 单粒种子的检测，检测的灵敏度大大提高；4、 传统的常规检测方法不能区分形态磨损和成熟度不够的种子，建立的PCR 方法能特异、敏感、准确、快速地鉴定光高粱及近似物种。

图1， ITS通用引物检测DNA提取效果说明使用的DNA标记是Takara生产的DL2000(2000bp; 1000bp; 750bp; 500bp; 250bp;腸p)1 10，光高粱(S.nitidum); 11，假高粱(S.halepense); 12， 二色高粱(S.bicolor); 13，拟高粱(S.propinquum); 14，黑高粱(S. almum); 15，苏丹草(S.sudannese); 16，负对照(negative control)图2，特异引物N3/N5检测样品说明使用的DNA标记是Takara生产的DL2000(2000bp; 1000bp; 750bp; 500bp; 250bp;謹p)，1 10,光高粱(S.nitidum); 11，假高粱(S.halepense); 12， 二色高粱(S.bicolor); 13，拟高粱(S.propinquum); 14，黑高粱(S. almum); 15,苏丹草(S.sudannese); 16，负对照(negative control)图3是特异引物检测光高粱的检测结果M，标准分子标记DL2000 (2000， 1000， 750， 500， 250，薩p); 1 10，光 高粱(S.nitidum); 11，假高粱(S.halepense); 12， 二色高粱(S.bicolor); 13， 拟高粱(S.propinquum); 14，黑高梁(S.almum); 15,苏丹草(S.sudannese); 16,负对照(negative control)*图中上半部为ITS特异引物扩增结果；下半部为ITS通用引物扩增。 图4是本发明的技术路线图本发明的技术路线是将单粒种子提取DNA,利用引物N3/N5进行PCR扩增，以此区分和其它高粱属种子，其中 上游引物N35，- GGCGTCAAGGAACACTTATA -3，； 下游引物N5 5，- ACGTCCCTCCTCCCCTCT -3';具体实施方式
1种子DNA获取单粒种子研磨粉碎，按照以下步骤提取1) 液氮中碾种子于1.5mL离心管中，加入500nL TES,TES由100mM Tris (pH8.0)， 10mMEDTA， 2XSDS组成;2) 加7nL蛋白酶K混匀，置于55'C水浴60 120min，期间混匀几次；3) 调节盐浓度至1.4M，加1/10体积的10%十六烷三甲基溴化铵，置于65°C 水浴10min;4) 加入等体积的SEVGA混匀，SEVGA为氯仿异戊醇=24: 1，不能太剧烈， 以保证DNA的完整性，(TC孵育30min;5) 4°C 13，000r/min离心10min，取上清夜至1.5mL离心管中；6) 加225pL 5M醋酸铵混匀，O'C孵育30min以上，4°C 13,000r/min离心2min;7) 取上清，加入3nL核糖核酸酶A, 37。C水浴30min,以去除RNA;8) 加0.55体积的预冷异丙醇，-20°。放置30111111以上；9) 4'C13，000r/min离心15 20min,弃异丙醇，70%乙醇洗2次。室温干燥， 50nLTE或双蒸水溶解，TE为10mMTris, lmMEDTA (pH8.0)。2 PCR扩增利用引物N3( 5， 一 GGCGTCAAGGAACACTTATA — 3， ) /N5 ( 5，一 ACGTCCCTCCTCCCCTCT —3，)；进行PCR扩增，PCR反应总体积为30^1， 包含1Ommol/L三羟基氨基甲烷盐酸盐Tris-HCl; 50mmol/L KC1 (pH8.3); 1.5mmol/L MgC12; dATP， dGTP, dCTP， dTTP浓度为10Onmol/L;引物浓度 100nmol/L; 0.5U Taq DNA聚合酶(宝生物工程有限公司)。加双蒸水至终体积为30nl，混匀离心，置于PCR仪进行扩增。扩增反应程序预变性95'C 3min; 然后94" 30s， 60。C30s, 72。Clmin，循环30次。3琼脂糖凝胶电泳取扩增产物l(HiL，加入3^L上样缓冲液
，混匀，1.5%琼脂糖凝胶电泳。电泳，EB染色后于凝胶成 像仪中成像存盘。光髙粱ITS序列Sorg/j鹏m力-血w ribosomal DNA internal transcribed spacer:GCCTCGGCTC CCACGGCGCC121 TAAGGCGTCA AGGAACACTT AT森TTGCCTT GCACGGCGGA GCGGTCGGCC TGCCTTCCGCTCTCGGCTCTATCCCGCGAAACGTCTGCCT361 GGGCGTCACG CCAAAAGACA CTCCCAACCC ACCCAGAGGG GAGGAGGGAC GTGGTGTTTG421 GCCTCCCGTG CCTCGCGGCG CGGTGGGCCG AAGTTGGGGC TGCCGGCGAA TCGTGTCGGG481 CACAGCACGT GGTGGGCGAC ACCTTAGTTG TTCTCGGTGC AGCGCCTCGG CACGCGGCCGACCGCGACCC 601 CA注上游引物N3 5'-GGCGTCAAGGAACACTTATA陽3，；下游引物N5 5，- ACGTCCCTCCTCCCCTCT -3，；
权利要求
1. 一种用于光高粱检测的特异性引物对的上游引物，其DNA序列是5’-GGCGTCAAGGAACACTTATA-3’。
2、 根据权利要求1所述的引物序列的完全互补链。
3、 一种用于光高粱检测的特异性引物对，其特征在于该引物对DNA序列为 上游引物N3: 5，- GGCGTCAAGGAACACTTATA -3，；下游引物N5: 5，-ACGTCCCTCCTCCCCTCT -3，。
4、 一种利用PCR检测技术检测光高粱种子的检测方法，其特征是利用如权利要 求3所述的特异性引物进行PCR扩增。
5、 如权利要求4所述的一种用于光高粱检测的检测方法，其特征是检测过程包 括如下步骤(1)种子DNA获取；(2) PCR扩增；(3)琼脂糖凝胶电泳。
6、 根据权利要求5所述的一种用于光高粱检测的检测方法，其特征是步骤(2) 中PCR反应总体积为30pl，其中包含三羟甲基氨基甲垸盐酸盐Tris-HCl、 KC1、 MgCl2、 dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP、引物和Taq DNA聚合酶；加双蒸水至终 体积为30nl，混匀离心，置于PCR仪进行扩增。
7、 根据权利要求5所述的一种用于光高粱检测的检测方法，其特征是步骤中(3) 中取扩增产物加入缓冲液，混匀，进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。
8、 根据权利要求7所述的一种用于光高粱检测的检测方法，其特征是步骤(3) 中扩增产物为10nL，缓冲液是0.25%溴酚兰，质量体积百分含量40% (W/V) 蔗糖水溶液。
9、 一种用于光高粱检测的检测方法，其特征是检测过程包括如下步骤 (1)种子DNA获取单粒种子研磨粉碎，按照以下步骤提取(a)液氮中碾种子于1.5mL离心管中，加入500nLTES,TES由100mMTris， pH=8.0， 10mMEDTA， 2MSDS组成；(b) 力n 7pL蛋白酶K混匀，置于55"C水浴60 120min，期间混匀几次；(c) 调节盐浓度至1.4M，加1/10体积的10%十六烷三甲基溴化铵，置 于65-C水浴10min;(d) 加入等体积的SEVGA混匀，SEVGA为氯仿异戊醇=24:1，不能 太剧烈，以保证DNA的完整性，0。C孵育30min;(e) 4'C13,000r/min离心10min，取上清夜至1.5mL离心管中；(f) 加225pL 5M醋酸铵混匀，(TC孵育30min以上，4"C13，000r/min离心(g) 取上清，加入3nL核糖核酸酶A， 37。C水浴30min，以去除RNA;(h) 力B0.55体积的预冷异丙醇，-20°。放置301!^以上；(i) 4。Cl3,000r/min离心15 20min，弃异丙醇，70%乙醇洗2次，室温 干燥，50pLTE或双蒸水溶解，TE为10mMTris， lmMEDTA， pH=8.0;(2) PCR扩增；别m a i / 、k 5 GGCGTCAAGGAACACTTATA - 3 、*广抄说利用引物N3/ N5:-进灯PCR扩增，5 - ACGTCCCTCCTCCCCTCT-3PCR反应总体积为3(^1,包含10mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐Tris-HCl、 5Ommol/L并且pH为8,3的KC1、 1.5mmol/L MgCl2、 dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP 浓度为10(Himol/L、引物浓度为10Onmol/L; Taq DNA聚合酶为0.5U;加双蒸水 至终体积为3(HU，混匀离心，置于PCR仪进行扩增；扩增反应程序预变性95 。C 3min;然后94°C 30s， 60°C 30s， 72°C lmin，循环30次；(3) 琼脂糖凝胶电泳取扩增产物IOjxL，加入3pL上样缓冲液混匀，1.5%琼脂糖凝胶电泳，EB 染色后于凝胶成像仪中成像存盘，其中缓冲液是0.25%溴酚兰，质量体积百分含 量40% (W/V)蔗糖水溶液。
10、 根据权利要求1-3任意一项权利要求所述的引物在用于光高粱检测中的 用途。
11、 根据权利要求4-9任意一项权利要求所述的检测方法在用于光高粱检测 中的用途。
全文摘要
本发明涉及一种光高粱的特异性引物及利用该特异性引物的PCR检测方法，克服了现有技术中关于形态鉴定和细胞生物学方法存在的困难，适合于口岸检验检疫、农业生产、植物保护等领域。该PCR检测方法，包括步骤1)种子DNA获取，2)PCR扩增，3)琼脂糖凝胶电泳。
文档编号C12Q1/68GK101245372SQ20071003757
公开日2008年8月20日 申请日期2007年2月15日 优先权日2007年2月15日
发明者印丽萍, 易建平, 伟 王 申请人:印丽萍