一种用于检测prv的荧光定量pcr试剂盒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种特异性检测猪伪狂犬病病毒（PRV）感染的荧光定量PCR快速检测试剂盒及其应用，所述试剂盒包括用于扩增猪伪狂犬病病毒gE基因保守区域的特异性引物对和特异性的TaqMan荧光标记探针，其中，所述特异性引物对的上游引物序列为5’-GAGGACGACGGGCTGTAC-3’，特异性引物对的下游引物序列为5’-GGACATCAACAGGCGGTTG-3’，所述TaqMan探针的序列为5’-TGGGTCCATTCGTCACTTCCG-3’，且TaqMan探针的5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记本身不发光的荧光淬灭基团BHQ1。本发明的试剂盒可用于快速定性定量检测PRV感染、鉴别检测PRV?gE基因缺失疫苗毒株和/或PRV野毒株。
【专利说明】—种用于检测PRV的荧光定量PCR试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于病毒核酸检测领域，具体涉及一种特异性检测猪伪狂犬病病毒(PRV)感染的荧光定量PCR快速检测试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002]伪狂犬病(Pseudorabies, PR)又称为Aujeszky氏病，由疱疫病毒科α -疱疫病毒亚科伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus, PRV)引起的一种急性传染病，其中，猪、牛、羊等多种家畜及野生动物为该病毒的主要感染对象，并表现发热、奇痒、脑脊髓炎等感染症状。伪狂犬病最早于1902年报道于匈牙利，自此广泛流行于世界各地。我国在1947年首次报道该病以来，迄今为止，相继20多个省份开始流行该病(李素莲.对伪狂犬病基因缺失疫苗株研究的思考[J].四川畜牧兽医，2001，3 (28):27-29.)。猪是伪狂犬病病毒的主要宿主及传染源，健康阴性猪与病猪、带毒猪直接接触均可感染该病。妊娠母猪感染伪狂犬病病毒通常会引起流产、木乃伊胎、死胎和产弱仔；哺乳仔猪感染伪狂犬病病毒则多发为神经症状，呈化脓性脑炎；保育猪及育肥猪感染伪狂犬病病毒则多发为呼吸系统症状；成年猪感染伪狂犬病病毒则多为隐性感染；2周龄以内仔猪感染伪狂犬病病毒的发病死亡率可达100%。目前，伪狂犬病病毒感染已经成为严重危害养猪业的重大疾病之一，并给全球养殖业尤其是养猪业造成了巨大的经济损失。
[0003]目前，常用于检测PRV的方法包括血清学实验、体内潜伏病毒的激活与检测技术、组织块培养及共培养技术、核酸杂交技术和PCR技术等。其中，血清学试验方法存在费时、费力、准确率低等缺陷；组织块培养及共培养技术中的病毒分离具有敏感、特异等优点，但存在耗时较长(约3周)，操作繁琐等缺陷。虽然分子生物学的常规方法在某些方面可以弥补前述检测方法的不足，但存在假阳性、环境污染、重现性不高等缺陷，从而限制了其推广应用。近年来，新兴的实时荧光定量PCR技术在普通PCR技术的基础上，在扩增反应体系中加入一对特异性引物和一条特异性的荧光探针或荧`光染料，利用能够实时监测的荧光PCR仪来检测病原体靶核苷酸序列，该技术不但克服了传统PCR技术存在的缺点，且具有结果直观可靠、特异性强、灵敏度高、快速简单等优点，可以直观地从分子生物学水平检测到病毒核酸的存在，已成为临床上检测和诊断疾病的重要技术。并且，实时荧光定量PCR技术在检测伪狂犬病方面已用于检测PRV感染猪和潜伏感染猪，还能快速检验区分猪伪狂犬病病毒野毒和疫苗毒，甚至可以定量检测感染PRV的感染量(万超，温国元，潘兹书等.快速检测伪狂犬病毒荧光定量PCR技术建立及应用[J].中国病毒学，2006，21 (5) =485-489.;赵丽，崔保安，陈红英等.鉴别伪狂犬病病毒野毒与疫苗毒荧光定量PCR方法的建立[J].生物工程学报，2008，24 (7):1149-1154.)。
[0004]实时荧光定量PCR技术包括染料法和探针法两种，其中，染料法是利用能与双链DNA结合的染料(如SYBR Green)结合到双链DNA产物内部，再根据检测到的荧光信号实现定量检测的目的，但存在无法区分引物二聚体及非特异产物信号的缺陷；探针法是在常规的PCR基础上加入一条特异性的荧光探针(如TaqMan探针)，根据探针两边标记的报告荧光基团和荧光淬灭基团之间产生的荧光共振能量转移原理，释放的荧光信号强度与扩增产物的量呈正比关系而实现定量检测。
[0005]实时荧光定量PCR技术的优越性对我国大型集约化养猪业中水平净化PRV具有十分重要的意义。但是，实验室人员在使用实时荧光定量PCR技术时，通常需要分别购买荧光染料和酶体系，并花费大量时间用于设计合适的引物探针和优化反应体系等工作，且在目前的临床检测或科研实践中，尚没有开发出一种通过简单操作即能实现快速检测PRV的试剂盒产品，且实时定量PCR检测技术的准确性、特异性、灵敏度和重现性等方面均存在不能满足现实需要的问题。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种特异性检测猪伪狂犬病病毒感染的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于扩增猪伪狂犬病病毒gE基因保守区域的特异性引物对和特异性的TaqMan荧光标记探针，其中，所述特异性引物对的上游引物序列为5 ’ -GAGGACGACGGGCTGTAC-3 ’ (SEQ ID NO:1 )，特异性引物对的下游引物序列为 5’ -GGACATCAACAGGCGGTTG-3’ (SEQ ID NO:2)，所述 TaqMan 探针的序列为5’-TGGGTCCATTCGTCACTTCCG-3’ (SEQ ID NO: 3)，且 TaqMan 探针的 5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记本身不发光的荧光淬灭基团BHQl，优选用于扩增猪伪狂犬病病毒gE基因保守区域的特异性引物对的数量为至少一对，更优选特异性的TaqMan荧光标记探针的数量为至少一条。
[0007]本发明的优选技术方案中，所述特异性引物对和特异性的TaqMan探针被包括在PCR反应液中，其中，所 述PCR反应液是由IXPCR Buffer、0.5mmol/L的dNTP混合物、
0.1 μ mol/L的TaqMan探针、0.2 μ mol/L的上游引物、0.2 μ mol/L的下游引物和适量的无菌双蒸水组成。
[0008]本发明的优选技术方案中，所述试剂盒还包括DNA提取试剂、Taq DNA聚合酶、阳性质控品和阴性质控品的任一组份或其组合。
[0009]本发明的优选技术方案中，所述的阳性质控品为含有猪伪狂犬病病毒gE基因保守序列的T载体质粒。
[0010]本发明的特异性检测猪伪狂犬病病毒感染的荧光定量PCR的主要技术原理:实时荧光定量PCR技术通过在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中产物量的变化。
[0011]本发明的目的在于提供本发明的荧光定量PCR试剂盒用于快速定性定量检测猪伪狂犬病病毒的方法中的应用，优选用于鉴别检测PRV gE基因缺失疫苗毒株和PRV野毒株的任一种或其组合。
[0012]本发明的目的在于提供本发明的荧光定量PCR试剂盒用于检测待检样本中是否存在猪伪狂犬病病毒DNA的方法中的应用。
[0013]本发明的目的在于提供本发明的荧光定量PCR试剂盒用于快速定性定量检测猪伪狂犬病病毒的方法中的应用，优选用于快速定性定量检测猪伪狂犬病病毒的感染或猪伪狂犬病病毒感染早期的任一种或其组合，更优选用于定量检测猪伪狂犬病病毒拷贝数。
[0014]本发明的目的在于提供一种利用荧光定量PCR技术特异性检测猪伪狂犬病病毒(PRV)感染的方法，包括下述步骤:
[0015]I)提取待测样品中的病毒DNA ；
[0016]2)利用本发明的荧光定量PCR试剂盒检测步骤I)获得的待测样品中的病毒DNA
量，即得。
[0017]本发明的优选技术方案中，利用荧光定量PCR技术定性检测猪伪狂犬病病毒(PRV)感染的方法的结果判定如下:1)待测样本Ct值< 35，且曲线有明显的指数增长期，测定结果有效，报告待测样本阳性；2)待测样本35 < Ct值< 40时，若重复一次的Ct值仍小于40，且曲线有明显的指数增长期，报告待测样本阳性；3)检测不到待测样本的Ct值或Ct值为40，则PRV的DNA含量< IO1Copies/^ L (低于检测下限)，报告待测样本阴性。
[0018]本发明的优选技术方案中，利用荧光定量PCR技术定量检测猪伪狂犬病病毒(PRV)感染的方法包括如下步骤:根据各待测样本和已知起始拷贝数的PRV阳性定量标准品的Ct值，计算出待测样本的起始拷贝数。
[0019]为了清楚地表述本发明的保护范围，本发明对术语进行如下界定:
[0020]本发明所述的阳性质控品为利用基因克隆的方法插入了一段猪伪狂犬病病毒gE基因保守序列的T载体质粒，其插入序列为SEQ ID N0:4。
[0021]本发明所述的阴性质控品`为健康猪血清的稀释液。
[0022]本发明所述的Ct值(cycle threshold, Ct)是指PCR扩增过程中扩增产物的突光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数，Ct值与模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，模板DNA量越多，荧光到达阈值的循环数越少，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，再根据检测获得的待测样品的Ct值，即可由标准曲线计算待测样品的起始拷贝数。
[0023]除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。
[0024]与现有技术相比，本发明具有下述有益技术效果:
[0025]1.本发明优化了特异性检测猪伪狂犬病病毒(PRV)感染的荧光定量PCR试剂盒的组成，包括优化了用于扩增猪伪狂犬病病毒gE基因保守区域的特异性引物对和特异性的TaqMan荧光标记探针，还优化了包括特异性引物对和特异性的TaqMan探针的PCR反应液组成，所述的试剂盒具有检测定量准确性高、特异性良好、假阳性率低、灵敏度高、检测快速等优点。
[0026]2.本发明的特异性检测猪伪狂犬病病毒(PRV)感染的荧光定量PCR试剂盒的检测下限为IO1Copies/μ L的病毒量，具有检测灵敏度高的优点。
[0027]3.本发明的特异性检测猪伪狂犬病病毒(PRV)感染的荧光定量PCR技术中所用的TaqMan探针的5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记了本身不发光的荧光淬灭基团BHQ1，降低了背景荧光信号，提高了信噪比，显著提高了实验结果的精确性。
[0028]4.本发明的特异性检测猪伪狂犬病病毒(PRV)感染的荧光定量PCR技术在整个扩增和检测过程均在同一个封闭管内进行，有效避免了气溶胶污染而造成的假阳性，具有操作简便、自动化、快速(整个检测过程仅需1-1.5小时)、准确等优点。[0029]5、与病毒分离、免疫荧光和常规PCR等技术相比，本发明的特异性检测猪伪狂犬病病毒(PRV)感染的荧光定量PCR技术显著提高了检测效率，并具有操作简便、自动化、快速(整个检测过程仅需1-1.5小时)、准确等优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1实施例1中第I组引物和探针的扩增曲线，其中，A、B、C、D分别是稀释10倍、100倍、1000倍、10000倍的猪伪狂犬病病毒野毒株DNA，E是猪细小病毒DNA、F是猪圆环病毒II型DNA、G是猪伪狂犬病病毒gE基因缺失疫苗株DNA、H是水对照，图2-图6中的相关说明与此相同，又称“下同”。
[0031]图2实施例1中第2组引物和探针的扩增曲线。
[0032]图3实施例1中第3组引物和探针的扩增曲线。
[0033]图4实施例1中第4组引物和探针的扩增曲线。
[0034]图5实施例1中第5组引物和探针的扩增曲线。
[0035]图6实施例1中第6组引物和探针的扩增曲线。
[0036]图7本发明特异性检测猪伪狂犬病病毒(PRV)感染的荧光定量PCR技术特异性的动力学曲线，其中，A是阳性质控品、B是猪伪狂犬病病毒野毒株、C是猪细小病毒、D是猪圆环病毒II型、E是猪伪狂犬病病毒gE基因缺失疫苗株、F是阴性质控品。
[0037]图8本发明特异性检测猪伪狂犬病病毒(PRV)感染的荧光定量PCR技术灵敏度的动力学曲线，其中，A-F分别为16UO5UO4UO3UO2UO1拷贝数的检测动力学曲线，G是阴性质控品。
[0038]图9本发明特异性检测猪伪狂犬病病毒(PRV)感染的荧光定量PCR技术灵敏度的标准曲线。
【具体实施方式】
[0039]为了便于理解本发明，特例举以下实施例。其作用应被理解为是对本发明的进一步的解释和说明，而非用于限制本发明的范围。
[0040]实施例1猪伪狂犬病病毒(PRV)荧光定量PCR检测引物和探针的筛选
[0041]1、引物和探针的设计
[0042]参考Genebank中公布的我国PRV的基因序列，并结合荧光PCR引物探针设计特点，利用Primer Express及DNAStar软件设计针对PRV保守区片段的引物和探针,将设计的多对引物和探针(见表1)进行筛选试验，将文献(赵丽，崔保安，陈红英等，TaqMan实时荧光定量PCR检测猪伪狂犬病病毒方法的建立与初步应用[J].中国预防兽医学报，2009，31
(2):137-140.)中报道的检测PRV的引物和探针序列(即表1中第6组)作为对照进行比较研究，从中筛选出特异性和敏感性较好的引物和探针。
[0043]表1扩增PRV的弓丨物和探针序列
[0044]
【权利要求】
1.一种特异性检测猪伪狂犬病病毒(PRV)感染的荧光定量PCR快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于扩增猪伪狂犬病病毒gE基因保守区域的特异性引物对和特异性的TaqMan荧光标记探针，其中，所述特异性引物对的上游引物序列为5’ -GAGGACGACGGGCTGTAC-3’，特异性引物对的下游引物序列为5’-GGACATCAACAGGCGGTTG-3’，所述 TaqMan 探针的序列为 5 ’-TGGGTCCATTCGTCACTTCCG-3 ’，且TaqMan探针的5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记本身不发光的荧光淬灭基团BHQ1，优选用于扩增猪伪狂犬病病毒gE基因保守区域的特异性引物对的数量为至少一对，更优选特异性的TaqMan突光标记探针的数量为至少一条。
2.如权利要求1所述的荧光定量PCR快速检测试剂盒，其特征在于，所述特异性引物对和特异性的TaqMan探针被包括在PCR反应液中，其中，所述的PCR反应液是由I XPCRBuffer,0.5mmol/L 的 dNTP 混合物、0.1 μ mol/L 的 TaqMan 探针、0.2 μ mol/L 的上游引物、0.2ymol/L的下游引物和适量的无菌双蒸水组成。
3.如权利要求1或2所述的荧光定量PCR快速检测试剂盒，所述试剂盒还包括DNA提取试剂、Taq DNA聚合酶、阳性质控品和阴性质控品的任一组份或其组合。
4.如权利要求1-3任一项所述的荧光定量PCR快速检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性质控品为含有猪伪狂犬病病毒gE基因保守序列的T载体质粒。
5.权利要求1-4任一项的荧光定量PCR快速检测试剂盒用于快速定性/定量检测猪伪狂犬病病毒的方法中的应用，优选用于鉴别检测猪伪狂犬病病毒gE基因缺失疫苗毒株和猪伪狂犬病病毒野毒株的任一种或其组合。
6.权利要求1-4任一项的荧光定量PCR快速检测试剂盒用于检测待检样本中是否存在猪伪狂犬病病毒DNA的方法中的应用。`
7.权利要求1-4任一项的荧光定量PCR快速检测试剂盒用于快速定性/定量检测猪伪狂犬病病毒的方法中的应用，优选用于快速定性/定量检测猪伪狂犬病病毒的感染或猪伪狂犬病病毒感染早期的任一种或其组合，更优选用于定量检测猪伪狂犬病病毒拷贝数。
8.一种利用荧光定量PCR技术特异性检测猪伪狂犬病病毒(PRV)感染的方法，包括下述步骤:1)提取待测样品中的病毒DNA；2)利用权利要求1-4任一项所述的荧光定量PCR试剂盒检测步骤I)获得的待测样品中的病毒DNA量，即得。
9.根据权利要求8所述的方法，利用荧光定量PCR技术定性检测猪伪狂犬病病毒(PRV)感染的方法的结果判定如下:1)待测样本Ct值<35，且曲线有明显的指数增长期，测定结果有效，报告待测样本阳性；2)待测样本35 < Ct值< 40时，若重复一次的Ct值仍小于40，且曲线有明显的指数增长期，报告待测样本阳性；3)检测不到待测样本的Ct值或Ct值为40，则PRV的DNA含量< IO1Copies/μ L，报告待测样本阴性。
10.根据权利要求8所述的方法，利用荧光定量PCR技术定量检测猪伪狂犬病病毒(PRV)感染的方法包括如下步骤:根据各待测样本和已知起始拷贝数的PRV阳性定量标准品的Ct值，计算出待测样本的起始拷贝数。
【文档编号】C12Q1/68GK103509877SQ201210200972
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2012年6月18日 优先权日:2012年6月18日
【发明者】薛霜, 陈其兵, 朱薇, 李晶梅, 漆世华, 温文生, 谢红玲 申请人:武汉中博生物股份有限公司