专利名称：不需厌氧培养箱辅助的厌氧微生物培养方法
技术领域：
本发明涉及一种生物工程技术领域的方法，特别涉及一种不需厌氧培养箱辅助的厌氧微生物培养方法。
背景技术：
目前，厌氧微生物的培养一般需要使用厌氧培养箱。这种厌氧培养箱需要耗费大量的纯氮气或二氧化碳来驱除箱内存在的空气，且氧分压仍达不到许多绝对厌氧微生物的环境要求，实验操作需带上长臂手套在箱内进行，极不方便。
经对现有技术的文献检索发现，Joblin等在《Current Microbiology》(《现代微生物学》，2002年45卷46-53页)上发表了题为“Degradation of FreshRyegrass by Methanogenic Co-Cultures of Ruminal Fungi Grown in thePresence or Absence of Fibrobacter succinogenes(“在琥珀酸拟杆菌存在或缺乏时瘤胃真菌产甲烷共培养对鲜黑麦草的降解”)的论文，提出一种通过厌氧培养箱辅助制作厌氧培养瓶来培养厌氧微生物的Hungate滚管方法，该方法利用刃天青作为氧化还原状态指示剂，利用半胱氨酸和硫化钠除去瓶内氧气，该方法的不足在于(1)刃天青在高温灭菌时会遭到破坏，颜色会由蓝色变为浅粉红色，色差弱，当培养基溶液本身有颜色时，不能有效显示色差变化，因而不能指示瓶内是否存在微量氧气；(2)在室温状态下(如20℃)，硫化钠与氧气的反应速度很快，往往培养基分装和加瓶盖作业未完成，添加的硫化钠就已经耗尽，随后进入瓶内的氧气不能除去；(3)硫化钠是一种强碱，具有强腐蚀性，与水中溶解氧反应会生成硫化氢，对许多厌氧微生物具有毒害作用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种不需厌氧培养箱辅助的厌氧微生物培养方法，使其通过利用高温稳定的指示剂及安全无毒、在室温下反应速度较慢、在高温下反应速度较快的除氧剂，有效除去培养基中的溶解氧，同时满足分装和加瓶盖的时间要求，并克服了硫化钠的氧化产物对微生物的腐蚀毒害作用。
本发明是通过如下技术方案实现的，本发明具体包括如下步骤(1)配制好培养基溶液后，加入亚甲基兰作为氧化还原状态指示剂，溶液中有溶解氧时显蓝色，溶液中没有溶解氧时显无色；(2)在室温状态下，向上述培养基溶液中加入除氧剂，摇匀溶解后，立即将该培养基溶液开始分装于培养瓶内，加盖胶塞和瓶盖，分装和加瓶盖作业时间控制在30分钟内；(3)通过注射器针头穿过胶塞，向经步骤(2)处理后的培养瓶中通入氮气1-2分钟，同时排气，交换培养瓶内溶液上方的空气；(4)将经步骤(3)处理后的培养瓶于121℃高温蒸汽灭菌20分钟，冷却后备用。
步骤(1)中所述的培养基溶液是指各种微生物培养溶液，包括液体培养基溶液和固体培养基溶液；所述的亚甲基兰，其加入的量为培养基溶液的0.0001％-0.0005％(w/v)。
步骤(2)中所述的室温状态是指室内温度不超过37℃；所述的除氧剂由食品中能允许使用的除氧剂组成，包括维生素C及其钠盐，异维生素C及其钠盐，半胱氨酸及其盐酸盐，以及它们按照不同比例组成的复合物，该除氧剂安全无毒，室温下反应速度较慢，高温下反应速度较快；所述的除氧剂，其加入的量为培养基溶液的0.02-0.1％(w/v)。
步骤(3)中所述的胶塞是指能自动闭合针头穿入孔的胶塞，包括丁基胶塞，橡胶塞等；所述的氮气，是纯度为99.999％的高纯氮气。
本发明对Hungate滚管法进行了改进，利用高温灭菌后仍然稳定的亚甲基兰作为指示剂，并利用室温下反应速度较慢、高温下反应速度较快、安全无毒的除氧剂替代硫化钠，不需要厌氧培养箱辅助进行培养基分装和加瓶盖作业，在分装、加盖、换气后，在高温灭菌过程中，使除氧剂与氧气快速反应除去培养基内的溶解氧。
本发明具有如下优点和有益效果(1)不需要使用厌氧培养箱，操作简便，成本低；(2)加入亚甲基兰经121℃灭菌20分钟后仍然稳定，完全可以指示瓶内溶液的氧化还原状态，克服了刃天青在高温灭菌时，颜色会由蓝色变为浅粉红色，当培养基溶液本身有颜色时，不能有效显示色差等缺点；(3)加入的除氧剂安全无毒，在室温下反应速度较慢，在高温下反应速度较快，既能达到有效除氧目的，又能满足分装和加瓶盖的时间要求，克服了硫化钠与氧气的反应速度太快，往往来不及进行培养基分装和加瓶盖作业，氧化产物对微生物有害等缺点。
具体实施例方式
下面对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1用天然牛胃液培养土壤中的厌氧微生物称取1.0克土壤，加入2ml蒸馏水，涡旋混匀2分钟后，1000转/分离心5分钟，上清液作为待培养的微生物菌悬液备用；取一干净烧杯，加入100ml澄清牛胃液，加入亚甲基兰0.0005克，加入除氧剂0.02克，摇匀溶解后，立即开始分装，将培养基溶液分装于规格为4ml西林瓶内，每瓶2ml，利用西林瓶压盖机盖上丁基胶塞和固定铝盖，分装和加塞固定时间控制在30分钟内，然后通过注射器针头穿过胶塞，通入高纯氮气(99.999％)1分钟，同时排气，交换培养瓶内溶液上方的空气，用常规灭菌锅在121℃下蒸汽灭菌20分钟，灭菌冷却后，通过注射器针头穿过胶塞，将20ul待培养的微生物菌悬液接种入培养瓶内，放入37℃培养箱中进行培养，24小时后，培养瓶内溶液由澄清变为浑浊，表明待培养的微生物已经培养放大，可用于后续的单纯菌株筛选或分子鉴定。
实施例2用天然牛胃液分离土壤中的厌氧微生物单纯菌株称取1.0克土壤，加入2ml蒸馏水，涡旋混匀2分钟后，1000转/分离心5分钟，上清液作为待培养的微生物菌悬液备用；取一干净烧杯，加入100ml澄清牛胃液，加入琼脂2.0克，煮沸溶解琼脂后冷却至60℃左右，加入亚甲基兰0.0001克，加入除氧剂0.1克，摇匀溶解后，立即开始分装，将培养基溶液分装于规格为4ml西林瓶内，每瓶2ml，利用西林瓶压盖机盖上丁基胶塞和固定铝盖，分装和加塞固定时间控制在30分钟内，然后通过注射器针头穿过胶塞，通入高纯氮气(99.999％)1分钟，同时排气，交换培养瓶内溶液上方的空气，用常规灭菌锅在121℃下蒸汽灭菌20分钟，灭菌后冷却至55℃，通过注射器针头穿过胶塞，将20ul待培养的微生物菌悬液接种入培养瓶内，摇匀后立即放入盛有冰水的器皿中匀速滚动，待培养基固化后，放入37℃培养箱中进行培养，24小时后，在培养基内将出现许多形态各异的单菌落，这些单菌落即为单纯菌株，可用毛细管挑取，转入液体培养基中扩大培养。
实施例3产氢厌氧微生物的筛选称取1.0克污泥土壤，加入2ml蒸馏水，在100℃水浴锅中处理45分钟，涡旋混匀2分钟后，1000转/分离心5分钟，上清液作为待培养的微生物菌悬液备用；取一干净烧杯，加入l00ml筛选产氢厌氧微生物的培养基溶液(培养基配方参考文献林明等，“产氢发酵细菌培养基的选择和改进”，《哈尔滨工业大学学报》，2003年第35卷第4期398-402页)，加入琼脂2.0克，煮沸溶解琼脂后冷却至60℃左右，加入亚甲基兰0.0003克，加入除氧剂0.06克，摇匀溶解后，立即开始分装，将培养基溶液分装于规格为4ml西林瓶内，每瓶2ml，利用西林瓶压盖机盖上丁基胶塞和固定铝盖，分装和加塞固定时间控制在30分钟内，然后通过注射器针头穿过胶塞，通入高纯氮气(99.999％)1分钟，同时排气，交换培养瓶内溶液上方的空气，用常规灭菌锅在121℃下蒸汽灭菌20分钟，灭菌后冷却至60℃，通过注射器针头穿过胶塞，将20ul待培养的微生物菌悬液接种入培养瓶内，摇匀后立即放入盛有冰水的器皿中匀速滚动，待培养基固化后，放入37℃培养箱中进行培养，24小时后，在培养基内将出现许多形态各异的单菌落，这些单菌落即为单纯菌株，可用毛细管挑取，转入液体培养基中扩大培养。
权利要求
1.一种不需厌氧培养箱辅助的厌氧微生物培养方法，其特征在于，具体包括如下步骤(1)配制好培养基溶液后，加入亚甲基兰作为氧化还原状态指示剂；(2)在室温状态下，向培养基溶液中加入除氧剂，摇匀溶解后，立即将该培养基溶液开始分装于培养瓶内，加盖胶塞和瓶盖，分装和加瓶盖作业时间控制在30分钟内；(3)通过注射器针头穿过胶塞，向经步骤(2)处理后的培养瓶中通入氮气，同时排气，交换培养瓶内溶液上方的空气；(4)将经步骤(3)处理后的培养瓶高温蒸汽灭菌，冷却后备用。
2.根据权利要求1所述的不需厌氧培养箱辅助的厌氧微生物培养方法，其特征是，步骤(1)中所述的培养基溶液为液体培养基溶液或固体培养基溶液。
3.根据权利要求1所述的不需厌氧培养箱辅助的厌氧微生物培养方法，其特征是，步骤(1)中所述的亚甲基兰，其在培养基溶液中的重量体积百分比含量为0.0001％-0.0005％。
4.根据权利要求1所述的不需厌氧培养箱辅助的厌氧微生物培养方法，其特征是，步骤(2)中所述的室温状态是指室内温度小于或等于37℃。
5.根据权利要求1所述的不需厌氧培养箱辅助的厌氧微生物培养方法，其特征是，步骤(2)中所述的除氧剂为维生素C及其钠盐、异维生素C及其钠盐、半胱氨酸及其盐酸盐，或这些物质组成的复合物。
6.根据权利要求1或5所述的不需厌氧培养箱辅助的厌氧微生物培养方法，其特征是，步骤(2)中所述的除氧剂，其在培养基溶液中的重量体积百分比含量为0.02-0.1％。
7.根据权利要求1所述的不需厌氧培养箱辅助的厌氧微生物培养方法，其特征是，所述的氮气，是纯度为99.999％的高纯氮气。
8.根据权利要求1所述的不需厌氧培养箱辅助的厌氧微生物培养方法，其特征是，所述的通入氮气，时间为1-2分钟。
9.根据权利要求1所述的不需厌氧培养箱辅助的厌氧微生物培养方法，其特征是，所述的高温蒸汽灭菌，温度为121℃，时间为20分钟。
全文摘要
一种生物工程技术领域的厌氧微生物培养方法，包括如下步骤(1)配制好培养基溶液后，加入亚甲基兰作为氧化还原状态指示剂；(2)在室温状态下，向上述培养基溶液中加入除氧剂，摇匀溶解后，立即将该培养基溶液开始分装培养基于培养瓶内，加盖胶塞和瓶盖，分装和加瓶盖作业时间控制在30分钟内；(3)通过注射器针头穿过胶塞，向经步骤(2)处理后的培养瓶中通入氮气，同时排气，交换培养瓶内溶液上方的空气；(4)将经步骤(3)处理后的培养瓶高温蒸汽灭菌，冷却后备用。本发明无需使用厌氧培养箱，操作简便，成本低，所用的指示剂经高温灭菌后仍然稳定，所用的除氧剂安全无毒，并能达到有效除氧目的，又能满足分装和加瓶盖的时间要求。
文档编号C12N1/00GK101050422SQ200710038080
公开日2007年10月10日 申请日期2007年3月15日 优先权日2007年3月15日
发明者董德贤, 李荣秀, 陈德兆 申请人:上海交通大学