专利名称：一种锌指蛋白ZBTB20在胰腺β细胞中特异性基因剔除小鼠模型及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于基因技术领域，更具体地，本发明涉及一种锌指蛋白的功能及其 用途。
背景技术：
3细胞功能障碍是糖尿病最基本的病理生理改变。1型糖尿病(即胰岛素依 赖型)，主要由于自身免疫性疾病引起的P细胞破坏导致了胰岛素的分泌不足； 而2型糖尿病(即胰岛素非依赖型)的P细胞功能损害比较复杂，可表现为胰岛 素I相分泌障碍、胰岛素/胰岛素原比例改变、胰岛素脉冲式释放的丧失以及 f3细胞数目的减少等。虽然这两型糖尿病的病理生理机制不尽相同，但是P细 胞功能的降低是两者共有的关键因素，并且对于2型糖尿病的患者，P细胞功 能的障碍，特别是早期即出现的胰岛素I相分泌障碍尤为重要。由于I相分泌 的胰岛素不足，使负荷后血糖长时间过度升高，这将持续刺激e细胞，使II 相胰岛素分泌增加；长期的高血糖刺激，加重e细胞负担，在超过e细胞自我 调节的情况下，大量未加工好的胰岛素前体物质胰岛素原也随之释放，胰岛素
/胰岛素原比例改变，最终导致e细胞功能失代偿，表现为胰岛素的n相分泌
障碍、脉冲式释放的丧失和e细胞数目的减少等。因此研究P细胞的功能及其 调节机制对于认识胰岛素分泌(特别是I相分泌)障碍产生的原因、阐明糖尿病 的发病机理、以及最终指导糖尿病患者的临床治疗均有重要意义。
胰岛素分泌是P细胞特有的复杂生物学过程，受到多种营养物质(如葡萄 糖、氨基酸)、神经递质和激素等活性物质的调节。生理状态下，胰岛素分泌 包括基础分泌和脉冲式分泌两种方式。基础分泌的主要作用是调节肝脏葡萄糖 输出速度与大脑等器官对葡萄糖需求间的平衡。脉冲式分泌主要发生在进食过 程中，首先I相分泌，主要是e细胞内胰岛素颗粒的快速释放，其峰值位于餐 后2-5分钟，在10分钟内消失，I相分泌在维持葡萄糖内环境的稳定中起重要
作用；大约在餐后10-20分钟，开始出现胰岛素的脉冲式II相分泌，此过程 持续数小时，所分泌的胰岛素除来自e细胞内储存的胰岛素颗粒外，还包括新 合成的胰岛素。葡萄糖是胰岛素分泌最主要的生理性调节因素。通过代谢使P 细胞内ATP/ADP的比值上升，关闭了 ATP敏感的K+通道，引起细胞膜去极化， 电压依赖的Ca2+通道开放，"2+内流增加，最终细胞内升高的Ca2+离子触发了 胰岛素分泌颗粒的释放，即胰岛素的I相分泌；葡萄糖进一步可以激活e细胞 胰岛素基因的表达，使胰岛素合成增多，分泌颗粒持续释放，引起胰岛素的n 相分泌。在葡萄糖刺激的胰岛素分泌过程中，参与e细胞葡萄糖跨膜转运的葡 萄糖转运蛋白GLUT2以及糖分解代谢通路中的关键酶如葡萄糖激酶、6磷酸葡 萄糖异构酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶等都发挥了重要作用，而一些转录因 子如肝细胞核因子丽F-1 a 、 HNF-1 P 、 HNF-4 a和低氧诱导性的转录因子HIF-1 P等则可调节上述重要分子的转录水平。因此这些已知分子直接参与了维持e 细胞的正常生理功能和糖尿病发生的病理过程。
尽管如此，目前本领域对e细胞功能调节和糖尿病发病机理的认识依然比 较粗浅，存在许多空白。
发明内容
本发明的目的在于提供一种锌指蛋白ZBTB20的功能及其用途。 本发明的另一目的在于提供基于所述锌指蛋白ZBTB20为靶点，筛选对于 促进哺乳动物胰腺e细胞胰岛素释放有效的物质的方法。
在本发明的第一方面，提供一种锌指蛋白ZBTB20或其激动剂的用途，用 于制备促进哺乳动物胰腺e细胞胰岛素释放的组合物。
在另一优选例中，所述的锌指蛋白ZBTB20或其激动剂提高哺乳动物胰腺 e细胞对葡萄糖感受能力，从而促进胰岛素释放。
在另一优选例中，所述的组合物还用于防止哺乳动物糖耐量受损。
在另一优选例中，所述的锌指蛋白ZBTB20选自
(i) SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列；或
(ii) 将SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、 缺失或添加而形成的，且能够促进哺乳动物胰腺e细胞胰岛素释放的由(i)衍
生的蛋白。
在本发明的第二方面，提供一种锌指蛋白ZBTB20的用途，用于筛选促进
哺乳动物胰腺e细胞胰岛素释放的物质。
在本发明的第三方面，提供一种筛选促进哺乳动物胰腺e细胞胰岛素释放的
潜在物质的方法，所述方法包括
(a) 将候选物质与含有锌指蛋白ZBTB20的体系接触；
(b) 观察候选物质对于锌指蛋白ZBTB20的表达或活性的影响；
其中，若所述候选物质可促进锌指蛋白ZBTB20的表达或活性，则表明该 候选物质是促进哺乳动物胰腺P细胞胰岛素释放的潜在物质。
在另一优选例中，步骤(a)包括在测试组中，将候选物质加入到含有锌 指蛋白ZBTB20的体系中；和/或
步骤(b)包括检测测试组的体系中锌指蛋白ZBTB20的表达或活性，并与 对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的含有锌指蛋白 ZBTB20的体系；
如果测试组中锌指蛋白ZBTB20的表达或活性在统计学上高于(优选显著高 于，如高20%;优选的高40%;更优选的高60%或更高)对照组，就表明该候 选物是促进哺乳动物胰腺P细胞胰岛素释放的潜在物质。
在另一优选例中，还包括步骤
对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以选出对于促进 哺乳动物胰腺e细胞胰岛素释放有用的物质。
在本发明的第四方面，提供一种锌指蛋白ZBTB20基因敲除啮齿动物的用 途，用于作为糖尿病动物模型。
在另一优选例中，所述的啮齿动物选自大鼠或小鼠。
在另一优选例中，所述的锌指蛋白ZBTB20基因敲除小鼠的纯合缺失 ZBTB20基因的小鼠。
在另一优选例中，所述的锌指蛋白ZBTB20基因敲除小鼠作为糖尿病动物 模型，用于糖尿病治疗药物的筛选。
在本发明的第五方面，提供一种锌指蛋白ZBTB20或其编码基因的用途， 用于制备诊断糖尿病的试剂或试剂盒。
在本发明的第六方面，提供一种体外或体内(非治疗性地)调节胰岛P细胞胰 岛素释放的方法，所述方法包括提高胰岛e细胞中锌指蛋白ZBTB20的表达 或活性。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而 易见的。
图1. ZBTB20在正常小鼠胰岛e细胞中特异表达的免疫组化染色分析。 图lA是采用抗ZBTB20抗体与抗胰高血糖素抗体(anti-Glucagon)双染后
的荧光染色结果；
图lB是采用抗ZBTB20抗体与抗胰岛素抗体(anti-insulin)双染后的荧光染 色结果。
图2. ZBTB20条件基因打耙路线示意图。
图3. ZBTB20胰岛e细胞特异性基因敲除小鼠的基因组鉴定。 图3A是提取小鼠尾巴基因组DNA，用ZBTB20等位基因的Pl和P2引物、以 及Cre基因的引物进行PCR扩增后电泳的结果。图中，+/+/Cre代表Cre转 基因，F/F代表ZBTB20的flox等位基因纯合子，F/ + /Cre代表ZBTB20的flox 等位基因杂合子和Cre转基因，F/F/Cre代表ZBTB20的flox等位基因纯合子 和Cre转基因，F/十代表ZBTB20的flox等位基因杂合子。
图3B是提取F/F/Cre小鼠不同组织的基因组DNA，同上进行PCR扩增后电 泳的结果。
图4. ZBTB20胰岛P细胞特异性基因敲除小鼠3 -ZB20K0的代谢分析。 其中，图4A是雌性(左)或雄性(右)ZB20KO小鼠在2月龄和4月龄时的 体重情况，以野生型雌性或雄性小鼠作为对照。
图4B是雌性(左)或雄性(右)e -ZB20K0小鼠在2月龄和4月龄时的空腹血 糖测定结果，以野生型雌性或雄性小鼠作为对照。
图4C是雌性(左)或雄性(右)P -ZB20K0小鼠在2月龄和4月龄时的空腹血 浆甘油三脂测定结果，以野生型雌性或雄性小鼠作为对照。
图5. ZBTB20胰岛e细胞特异性基因敲除小鼠e -ZB20K0的糖耐量和胰岛素 分泌水平。
其中，图5A是雌性(左)或雄性(右)ZB20KO小鼠在腹腔注射葡萄糖后的 糖耐量水平测定，以野生型雌性或雄性小鼠作为对照。
图5B是雌性(左)或雄性(右)ZB20K0小鼠在腹腔注射葡萄糖后的血浆胰 岛素测定结果，以野生型雌性或雄性小鼠作为对照。
图5C是雌性(左)或雄性(右)P-ZB20K0小鼠在腹腔注射精氨酸后的血浆胰 岛素测定结果，以野生型雌性或雄性小鼠作为对照。
图6. ZBTB20胰岛g细胞特异性基因敲除小鼠0 -ZB20K0的胰岛结构和P细 胞数量分析。
图6A显示e -ZB20K0小鼠的胰岛形态和结构的HE染色结果。
图6B显示利用抗胰高血糖素抗体免疫组化染色P -ZB20K0小鼠的胰岛及表
达胰高血糖素的a细胞分布情况。
图6C显示雌性(左)或雄性(右)e -ZB20KO小鼠的P细胞数量，以野生型雌
性或雄性小鼠作为对照。
图7. ZBTB20胰岛P细胞特异性基因敲除小鼠P -ZB20K0的胰岛素含量分析。
图7A是利用抗胰岛素抗体的免疫荧光组化染色e -zb2oko小鼠的e细胞和
胰岛素表达，以野生型雌性或雄性小鼠作为对照。
图7B是扫描电镜分析显示P -ZB20K0小鼠的P细胞中胰岛素分泌颗粒的状 态，以野生型雌性或雄性小鼠作为对照。
图7C通过酸抽提和胰岛素的免疫测定P -ZB20KO小鼠胰腺的胰岛素总含量 的结果，以野生型雌性或雄性小鼠作为对照。
图8.在由不同浓度的葡萄糖或葡萄糖+ KCl刺激后，ZBTB20胰岛e细胞特 异性基因敲除小鼠e-ZB20K0的胰岛体外分泌胰岛素水平，以野生型雌性或雄 性小鼠作为对照。
具体实施例方式
本发明人经过长期的研究，首次揭示锌指蛋白ZBTB20对胰腺P细胞分泌胰 岛素的调节作用，所述锌指蛋白ZBTB20可提高胰腺P细胞对葡萄糖的感受能 力，调节胰岛素的释放。因此，锌指蛋白ZBTB20可作为筛选药物的靶点，用 于筛选通过调节锌指蛋白ZBTB20的表达或活性而调节胰腺e细胞对葡萄糖的 感受能力或胰岛素释放能力的物质。在此基础上完成了本发明。
锌指蛋白ZBTB20及其用途
锌指蛋白ZBTB20，又称DPZF(Dendritic Cell-Derived POZ Zinc Finger)， 是一由741个编码氨基酸组成的新型转录因子，其N端含有POZ结构域，C端 含有5个C2H2锌指结构域，属于BTB锌指蛋白亚家族，其生物学功能尚不明 确。锌指蛋白ZBTB20是广泛存在于哺乳动物中，其在各种哺乳动物中是高度 保守的，具有非常高的蛋白同源性。
本发明人分析发现，锌指蛋白ZBTB20在胰腺e细胞中特异性高表达，运 用被誉为新分子功能研究黄金标准的基因打靶技术建立了 ZBTB20在胰腺P细 胞中特异性基因剔除小鼠模型，发现该模型小鼠血糖代谢存在明显异常，主要 表现为空腹血糖升高、高血脂、葡萄糖耐量严重受损，分析表明其e细胞体内 和体外经葡萄糖刺激后的胰岛素分泌存在严重障碍，与糖尿病患者早期的一些 病理生理改变非常接近。本发明人首次发现了锌指蛋白ZBTB20对胰腺P细胞 分泌胰岛素的体内调节作用，提出锌指蛋白ZBTB20在P细胞中的功能缺陷参 与糖尿病发病的病理过程。
在本发明中，所用的锌指蛋白ZBTB20可以是天然存在的，比如其可被分 离或纯化自哺乳动物。此外，所述的锌指蛋白ZBTB20也可以是人工制备的， 比如可以根据常规的基因工程重组技术来生产重组锌指蛋白ZBTB20。
任何适合的锌指蛋白ZBTB20均可用于本发明。所述的锌指蛋白ZBTB20 包括全长的锌指蛋白ZBTB20或其生物活性片段。优选的，所述的锌指蛋白ZBTB20的氨基酸序列可以与SEQ ID NO: l所示的序列基本上相同。
经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的锌指蛋白ZBTB20 的氨基酸序列也包括在本发明中。锌指蛋白ZBTB20或其生物活性片段包括一 部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留 了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域的公知的技术，所述技术可以很容 易地被实施并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识 到， 一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物 活性。见Watson等Molecular Biology of The Gene，第四版，1987， The Benjamin/Cummings Pub. Co. P224。
任何一种锌指蛋白ZBTB20的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这 里，锌指蛋白ZBTB20的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保 持全长的锌指蛋白ZBTB20的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性 片段至少保持50%的全长锌指蛋白ZBTB20的活性。在更优选的条件下，所述 活性片段能够保持全长锌指蛋白ZBTB20的60%、 70%、 80%、 90%、 95%、 99%、 或100%的活性。
本发明也可采用经修饰或改良的锌指蛋白ZBTB20，比如，可采用为了促进
其半衰期、有效性、代谢、和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的锌指蛋白 ZBTB20。所述经过修饰或改良的锌指蛋白ZBTB20可以是一种锌指蛋白ZBTB20 的共轭物，或其可包含被取代的或人工的氨基酸。所述经过修饰或改良的锌指 蛋白ZBTB20或者基因可以是与天然存在的锌指蛋白ZBTB20或基因虽然具有一 定的不同点，但也能调节胰腺e细胞的胰岛素释放，且不会带来其它不良影响 或毒性。也就是说，任何不影响锌指蛋白ZBTB20的生物活性或者说是基因的 生物功能的变化形式都可用于本发明中。
任何与所述的锌指蛋白ZBTB20同源性高(比如与锌指蛋白ZBTB20的同源性 为70%或更高，优选的，同源性为80%或更高，更优选的，同源性为90%或更高) 的、且具有锌指蛋白ZBTB20相同功能的蛋白也包括在本发明内。
基于本发明人的新发现，本发明提供了锌指蛋白ZBTB20的用途，用于促 进哺乳动物胰腺e细胞的胰岛素释放。所述的锌指蛋白ZBTB20可直接作为药 物调节哺乳动物胰腺e细胞的胰岛素释放。或者，可基于所述的锌指蛋白 ZBTB20来筛选促进哺乳动物胰腺0细胞胰岛素释放的物质。
锌指蛋白ZBTB20的激动剂及其用途
所述的锌指蛋白ZBTB20的激动剂是指任何可提高锌指蛋白ZBTB20的活 性、维持锌指蛋白ZBTB20的稳定性、促进锌指蛋白ZBTB20表达、延长锌指 蛋白ZBTB20有效作用时间、或促进锌指蛋白ZBTB20的转录和翻译的物质， 这些物质均可用于本发明，作为通过促进锌指蛋白ZBTB20的表达或活性而促 进哺乳动物胰腺e细胞胰岛素释放有用的物质。所述的激动剂包括(但不限于) 促进剂、上调剂等。
任何可调节锌指蛋白ZBTB20的各种活性机制的物质也可用于本发明，作 为对于调节哺乳动物胰腺P细胞胰岛素释放有效的物质。
筛选促进胰腺0细胞胰岛素释放的物质
在得知了所述的锌指蛋白ZBTB20对于哺乳动物胰腺e细胞的影响作用后， 可以采用本领域熟知的多种方法来筛选促进哺乳动物胰腺P细胞胰岛素释放
的潜在物质。进而可从所述的潜在物质中找到对于促进哺乳动物胰腺e细胞胰 岛素释放真正有用的物质。
因此，本发明提供一种筛选促进哺乳动物胰腺e细胞胰岛素释放的潜在物
质的方法，包括以下步骤
将候选物质与含有锌指蛋白ZBTB20的体系接触；观察候选物质对于锌指 蛋白ZBTB20的表达或活性的影响；其中，若所述候选物质可提高锌指蛋白 ZBTB20的表达或活性，则表明该候选物质是促进哺乳动物胰腺P细胞胰岛素 释放的潜在物质。
在本发明中，所述的体系选自(但不限于)溶液体系、细胞体系、亚细胞 体系、组织体系、器官体系、或动物体系。
在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到锌指蛋白 ZBTB20的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质 的含有锌指蛋白ZBTB20的体系。
这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，可对这些物质进行进一步的细胞 实验和/或动物试验，以便于最终可以从中筛选出能够对于促进哺乳动物胰腺 P细胞胰岛素释放真正有用的药物。
因此，本发明还包括一类通过本发明的筛选方法获得的促进哺乳动物胰腺e 细胞胰岛素释放的物质。
组合物和治疗方法
技术领域：
本发明还提供了一种组合物，它含有有效量(如0.00001-0.01克/60千克体重 /天；优选的，为0.0001-0.005克/60千克体重/天)的所述的锌指蛋白ZBTB20， 或锌指蛋白ZBTB20的激动剂，以及药学上或食品学上可接受的载体。
如本文所用，"药学上或食品学上可接受的"的成分是适用于人和/或哺 乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益 /风险比的物质。术语"药学上可接受的载体"指用于治疗剂给药的载体，包 括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体它们本身并不是必要的 活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟 矢口的。在Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co. ， N.J. 1991) 中可找到关于药学上可接受的载体的充分说明。在组合物中药学上可接受的载 体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助 性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。
本发明的组合物可直接用于促进哺乳动物胰腺e细胞胰岛素释放；此外，还 可同时与其它治疗剂或辅剂联合使用。
本发明还提供了一种体内或体外促进哺乳动物胰腺P细胞胰岛素释放的方 法(特别是非治疗性的方法)，包括提高胰岛e细胞中锌指蛋白ZBTB20的表达 或活性。
应理解，当用于调节哺乳动物胰腺e细胞胰岛素释放时，所用的锌指蛋白 ZBTB20或其激动剂的有效剂量可随待治疗的对象的严重程度而变化。具体情 况根据受试者的个体情况来决定，这些因素均在熟练医师或营养师可以判断的 范围内。
在得知了所述锌指蛋白ZBTB20或其激动剂的用途后，可以采用本领域熟 知的多种方法来将所述的锌指蛋白ZBTB20或其激动剂，或它们的编码基因、 或它们的药物组合物给药于哺乳动物。优选的，可采用基因治疗的手段进行。 比如，可直接将锌指蛋白ZBTB20或其激动剂通过诸如注射等方法给药于受试 者；或者，可通过一定的途径将携带锌指蛋白ZBTB20或其激动剂的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达有活性的锌指蛋白
ZBTB20或其激动剂，具体情况还需视所述的激动剂的类型而定，这些均是本 领域技术人员所熟知的。
优选的，可将编码锌指蛋白ZBTB20或其激动剂的基因、或携带所述基因 的载体通过常规的方法引入到耙细胞或耙组织中实现锌指蛋白ZBTB20或其激 动剂的表达。所述的耙组织包括但不限于胰腺组织。
动物模型
本发明还提供一种可作为糖尿病动物模型的锌指蛋白ZBTB20基因敲除啮
齿动物。所述的动物模型利用基因打靶技术建立，在胰腺e细胞中特异性剔除
了ZBTB20基因，该动物模型血糖代谢存在明显异常，主要表现为空腹血糖升
高、高血脂、葡萄糖耐量严重受损，分析表明其e细胞体内和体外经葡萄糖刺 激后的胰岛素分泌存在严重障碍，与糖尿病患者早期的一些病理生理改变非常 类似。该动物模型可用于糖尿病治疗药物的筛选。
制备糖尿病动物模型的动物基因敲除技术也可采用本领域人员熟悉的技术 进行。
本发明的主要优点在于
首次揭示锌指蛋白ZBTB20对胰腺e细胞分泌胰岛素的调节作用，所述锌指 蛋白ZBTB20可提高胰腺e细胞对葡萄糖的感受能力和以及促进胰岛素释放。因 此，锌指蛋白ZBTB20可直接作为药物以调节哺乳动物胰腺P细胞对葡萄糖的感 受能力或胰岛素释放能力；或者可作为筛选药物的靶点，用于筛选通过调节锌 指蛋白ZBTB20的表达或活性而调节胰腺P细胞对葡萄糖的感受能力或调节胰 岛素释放的物质。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂 商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉 的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本 发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
I.材料和方法
1. 基因剔除小鼠的制备
选择ZBTB20的第6个外显子作为基因打耙的靶点，构建第6外显子两侧翼 内含子含有loxp位点的打靶载体，转染小鼠胚胎干细胞(ES)，筛选同源重组 克隆，将重组的阳性克隆ES细胞注射至小鼠的囊胚内，然后移植至假孕小鼠 宫内，发育为嵌合鼠，经过交配得到携带loxp位点的ZBTB20等位基因小鼠， 将此小鼠与精蛋白(protamine)启动子Cre转基因小鼠交配，筛选通过同源 重组去除新霉素抗性基因Neo但仍保留完整的ZBTB20第6外显子及其侧翼LoxP 位点的lox小鼠；再将这种小鼠与携带大鼠胰岛素启动子Cre转基因小鼠交配， 在表达胰岛素的P细胞中通过Cre介导的同源重组特异性剔除ZBTB20基因的 第6外显子。
2. 基因型鉴定
提取小鼠尾巴基因组DNA，用ZBTB20等位基因的Pl和P2引物(图2所示， 分别是5' GGCACCCTTTAAATCCAATCAT(SEQ ID NO: 2)和5， CTCTCCCCTCCTCCCTCTG(SEQ ID NO: 3))、以及Cre基因的引物(分别是 5, -GGCGGATCCGAAAAGAAAA 3， (SEQ ID NO: 4)，和5， CAGATGGCGCGGCAACACC 3， (SEQ ID NO: 5))进行PCR扩增，得到的700bp条带代表ZBTB70野生型等 位基因，800bp条带表示含Loxp位点的ZBTB20等位基因，400bp条带表示Cre 基因，从而对小鼠的基因型进行综合判断。提取F/F/Cre小鼠不同组织的基因 组DNA，进行PCR扩增，分析在胰腺P细胞中ZBTB20基因剔除的特异性及其效 率。
3. 糖耐量试验
饥饿过夜的不同性别成年小鼠，分别予以腹腔注射lmg/g葡萄糖，于注射后 0、 15、 30、 60、 120分钟用血糖检测仪检测血糖。
4. 胰岛素释放试验
饥饿过夜的成年小鼠，腹腔注射3mg/g葡萄糖或3mg/g精氨酸，于注射后0、 2、 5、 20分钟采血，用小鼠ELISA试剂盒检测胰岛素含量。
5. 胰岛的分离和体外胰岛素分泌试验
通过常规的胶原酶P灌注和手工挑取法分离胰岛细胞团，体外经含不同浓度 的葡萄糖或联合KC1的KRBH缓冲液剌激培养1小时后，收集其培养上清、酸 抽提提取胰岛细胞团的总胰岛素，分别用常规ELISA法检测胰岛素量，计算其 胰岛素释放率。
6. 免疫组化分析
取胰腺的常规石蜡切片，经煮沸法修复抗原后，用兔抗ZBTB20多克隆抗体 (Zhang W等，Biochem Biophys Res Commun. 2001 Apr 13;282(4): 1067-73.)、豚鼠抗胰岛素抗体(购自Sigma公司)、小鼠抗胰高血糖素等抗体(购自Sigma公 司)标记孵育，然后用相应的荧光素标记的二抗(Alexa 594或Alexa 488标记 的抗兔或抗豚鼠、小鼠单抗，购自Vector公司)孵育，漂洗后封片，在荧光显 微镜下观察染色结果。
7. HE染色
取小鼠胰岛组织，经固定后常规石蜡包埋、切片。切片常规用二甲苯脱蜡， 先后用乙醇和蒸馏水洗涤。接着，用苏木素染色5min,自来水冲洗。然后用盐 酸乙醇分化30s。自来水浸泡15min后置于伊红液中2min。常规方法脱水、透 明、封片。在显微镜下观察染色结果。
8. 酸抽提和胰岛素的免疫测定
收集细胞，加含有0.4N HC1的70%乙醇沉淀过夜，离心取沉淀，用PBS重 新溶解，用抗小鼠胰岛素ELISA试剂盒(Mercodia公司)检测胰岛素含量。
II.具体实施例
实施例1 ZBTB20蛋白在胰腺e细胞中特异性表达
正常胰腺石蜡切片经抗ZBTB20抗体与抗胰高血糖素抗体(anti-Glucagon) 或抗胰岛素(anti-insulin)双染后的荧光染色结果，显示了 ZBTB20与胰岛素
在胰岛P细胞中的共表达，见图l。
实施例2在e细胞中特异性剔除ZBTB20基因
在P细胞中特异性剔除ZBTB20基因的流程见图2。选择ZBTB20的第6个外 显子作为基因打靶的靶点，构建第6外显子两侧翼含有loxp位点的打耙载体， 转染小鼠胚胎干细胞(ES)，筛选同源重组克隆，将重组的阳性克隆ES细胞注 射至小鼠的囊胚内，然后移植至假孕小鼠宫内，发育为嵌合鼠，经过交配得到 携带loxp位点的ZBTB20等位基因小鼠，将此小鼠与精蛋白(protamine)启 动子Cre转基因小鼠交配，筛选通过同源重组去除新霉素抗性基因Neo但仍保 留完整的ZBTB20第6外显子及其侧翼LoxP位点的lox小鼠；再将这种小鼠与 携带大鼠胰岛素启动子Cre转基因小鼠交配，在表达胰岛素的e细胞中通过Cre 介导的同源重组特异性剔除ZBTB20基因的第6外显子。
ZBTB20胰岛3细胞特异性基因敲除小鼠的基因组PCR鉴定结果见图3。 图3A为常规方法提取小鼠尾巴基因组DNA，用ZBTB20等位基因的Pl和P2 引物、以及Cre基因的引物进行PCR扩增，将扩增产物进行电泳。电泳结果得 到的700bp条带代表ZBTB70野生型等位基因，800bp条带表示含Loxp位点的 ZBTB20等位基因，400bp条带表示Cre基因，从而对小鼠的基因型进行综合判 断。
图3B为提取P细胞中特异性ZBTB20基因剔除小鼠(F/F/Cre)不同组织的基 因组丽A，同上进行PCR扩增和电泳，结果显示在胰腺P细胞中ZBTB20基因发 生特异性重组，原本Pl/P2引物扩增出来的PCR条带因同源重组后消失。
实施例3 ZBTB20基因敲除小鼠的生化指标变化
测定ZBTB20胰岛P细胞特异性基因敲除小鼠P -ZB20K0的体重和血糖、血 脂等生化分析结果，并与对照(野生型小鼠)相比。测定时雄性小鼠和雌性小鼠 分开进行。
结果如图4所示，与对照组相比，基因敲除小鼠的体重增加、血糖和血脂水 平明显升高，特别是对于4月龄的小鼠特别明显。
实施例4 ZBTB20基因敲除小鼠的糖耐量和胰岛素分泌水平变化
糖耐量试验
饥饿过夜的不同性别成年小鼠(包括ZBTB20胰岛P细胞特异性基因敲除小 鼠和野生型小鼠(作为对照))，分别予以腹腔注射lmg/g葡萄糖，于注射后O、 15、 30、 60、 120分钟用血糖检测仪检测血糖。
结果见图5A。结果显示，在注射血糖后120min内，ZBTB20基因敲除小鼠体 内血糖处于较高的水平，而对照组小鼠在注射血糖120min后，血糖水平基本 接近于注射前。因此，ZBTB20胰岛e细胞特异性基因敲除小鼠e-ZB20K0的糖 耐量严重受损。
胰岛素释放试验
饥饿过夜的成年小鼠(包括ZBTB20胰岛e细胞特异性基因敲除小鼠和野生 型小鼠(作为对照))，腹腔注射3mg/g葡萄糖或3mg/g精氨酸，于注射后0、 2、 5、 20分钟采血，用ELISA试剂盒检测胰岛素含量。
结果见图5B和图5C。结果显示，在注射葡萄糖或精氨酸后，对照组小鼠都 有一个血浆中胰岛素上升的过程；而ZBTB20基因敲除小鼠没有该过程，胰岛 素一直处于较低的水平。因此，ZBTB20胰岛e细胞特异性基因敲除小鼠e -ZB20K0在葡萄糖或精氨酸刺激后体内的胰岛素释放存在明显的障碍。
实施例5 ZBTB20基因敲除小鼠的胰岛结构和e细胞数量分析
对ZBTB20基因敲除小鼠(0 -ZB20K0)和野生型小鼠(对照)的胰岛组织进行 HE染色检査。结果发现，ZBTB20胰岛P细胞特异性基因敲除小鼠e-ZB20K0的 胰岛形态和结构无显著异常，见图6A。
对ZBTB20基因敲除小鼠(P-ZB20K0)和野生型小鼠(对照)的胰岛组织进行 免疫组化分析。结果显示，利用抗胰高血糖素抗体免疫组化染色e-ZB20K0的 胰岛，表达胰高血糖素的a细胞分布无显著异常，见图6B。
e细胞数量的检测采用常规方法，即取胰腺进行连续切片，利用抗胰高血糖
素抗体、生长抑素抗体和抗多肽PP抗体(购自Dako公司)联合免疫染色，显示 胰岛中的非e细胞，对染色结果进行显微摄影，用ImagePro软件计算方法胰
岛e细胞占胰腺总面积的百分比，根据胰腺的重量推算e细胞的总量，结果显
示，ZB20K0小鼠的P细胞数量无显著异常，见图6C。
实施例6 ZBTB20基因敲除小鼠P -ZB20K0的胰岛素含量分析
分别取ZBTB20胰岛P细胞特异性基因敲除小鼠和野生型小鼠的胰腺组织， 利用抗胰岛素抗体进行免疫荧光组化染色分析。结果显示，ZBTB20胰岛e细胞 特异性基因敲除小鼠e -ZB20K0的0细胞和胰岛素表达无明显异常，见图7A。
利用扫描电镜扫描ZBTB20胰岛3细胞特异性基因敲除小鼠和野生型小鼠的 胰岛P细胞，结果显示ZBTB20胰岛P细胞特异性基因敲除小鼠0 -ZB20K0的P 细胞中胰岛素分泌颗粒无明显异常，见图7B。
通过酸抽提和胰岛素的免疫测定显示，ZBTB20胰岛e细胞特异性基因敲除 小鼠e-ZB20KO胰腺的胰岛素总含量无显著异常，见图7C。
实施例7 ZBTB20基因敲除小鼠P -ZB20K0的胰岛体外分泌胰岛素水平
常规方法体外分离ZBTB20胰岛P细胞特异性基因敲除小鼠和野生型小鼠的 胰岛细胞团，分别经不同浓度的葡萄糖或联合KC1刺激后，测定其胰岛素的释 放率。
结果显示，ZBTB20胰岛P细胞特异性基因敲除小鼠P -ZB20KO的胰岛体外经 葡萄糖刺激后释放胰岛素存在显著障碍，但在KC1联合刺激下其胰岛素释放正 常，见图8。
结果说明，0-ZB20KO小鼠胰岛素的分泌通路本身无显著异常，但对葡萄糖 的感受能力受损。
实施例8筛选方法
以分离的原代胰岛e细胞(或P细胞瘤细胞)为受试对象，检测候选物质刺 激前后的细胞中内源ZBTB20的表达情况，利用定量PCR和抗ZBTB20抗体的免 疫印记检测，分析处理后细胞ZBTB20，利用ELISA方法检测细胞培养上清中胰 岛素分泌水平的变化。
测试组添加候选物质的胰岛P细胞培养物；
对照组不添加候选物质的胰岛e细胞培养物。
如果与对照组相比，测试组中的胰岛P细胞中ZBTB20的表达加强，则说明
该候选物质是可促进ZBTB20的表达，从而可促进哺乳动物胰腺e细胞胰岛素释
放的物质。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，
本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<no〉中国人民解放军第二军医大学
<120〉 一种锌指蛋白ZBTB20在胰腺e细胞中特异性基因剔除小鼠模型及用途 <130> 074961 <160〉 5
<170〉 Patentln version 3.3
<210〉 1 <211> 741 <212〉 PRT
<213〉 小鼠(Mus muscLilus) <400> 1
Met Leu Glu Arg Lys Lys Pro Lys Thr Ala Glu Asn Gin Lys Ala Ser 15 10 15
Glu Glu Asn Glu lie Thr Gin Pro Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ala
20 25 30
Leu Pro Cys Leu Asn Phe Glu Ala Val Leu Ser Pro Ala Pro Ala Leu
35 40 45
lie His Ser Thr His Ser Leu Thr Asn Ser His Ala His Thr Gly Ser
50 55 60
Ser Asp Cys Asp lie Ser Cys Lys Gly Met Thr Glu Arg lie His Ser 65 70 75 80
lie Asn Leu His Asn Phe Ser Asn Ser Val Leu Glu Thr Leu Asn Glu
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Val Val Ser Val Gin Ser Val Gin Lys Leu lie Asp Phe Met Tyr Ser 145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Val Ser Gin Asn Val Gly Asp Val Phe Pro Gly lie Gin Asp Ser Gly
195 200 205
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210 215 220
Ser Asp Thr Glu Ser Gly Tyr Leu Gin Ser His Pro Gin His Ser Val 225 230 235 240
Asp Arg lie Tyr Ser Ala Leu Tyr Ala Cys Ser Met Gin Asn Gly Ser 245 250 255
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260 265 270
Ala Leu Gly Leu Pro Arg Asp His His Met Glu Asp Pro Ser Trp lie
275 280 285
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<213> 人工序列
<220>
<221> misc—feature <223> 引物
<400〉 5
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权利要求
1.一种锌指蛋白ZBTB20或其激动剂的用途，其特征在于，用于制备促进哺乳动物胰腺β细胞胰岛素释放的组合物。
2. 如权利要求l所述的用途，其特征在于，所述的组合物还用于防止哺乳 动物糖耐量受损。
3. 如权利要求l所述的用途，其特征在于，所述的锌指蛋白ZBTB20选自(i) SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列；或(ii) 将SEQ ID NQ: 1所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、 缺失或添加而形成的，且能够促进哺乳动物胰腺e细胞胰岛素释放的由(i)衍 生的蛋白。
4. 一种锌指蛋白ZBTB20的用途，其特征在于，用于筛选促进哺乳动物胰 腺P细胞胰岛素释放的物质。
5. —种筛选促进哺乳动物胰腺e细胞胰岛素释放的潜在物质的方法，其特 征在于，所述方法包括(a) 将候选物质与含有锌指蛋白ZBTB20的体系接触；(b) 观察候选物质对于锌指蛋白ZBTB20的表达或活性的影响；其中，若所述候选物质可促进锌指蛋白ZBTB20的表达或活性，则表明该 候选物质是促进哺乳动物胰腺0细胞胰岛素释放的潜在物质。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(a)包括在测试组中， 将候选物质加入到含有锌指蛋白ZBTB20的体系中；和/或步骤(b)包括检测测试组的体系中锌指蛋白ZBTB20的表达或活性，并与 对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的含有锌指蛋白 ZBTB20的体系；如果测试组中锌指蛋白ZBTB20的表达或活性在统计学上高于对照组，就 表明该候选物是促进哺乳动物胰腺P细胞胰岛素释放的潜在物质。
7. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，还包括步骤 对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以选出对于促进哺乳动物胰腺P细胞胰岛素释放有用的物质。
8. —种锌指蛋白ZBTB20基因敲除啮齿动物的用途，其特征在于，用于作 为糖尿病动物模型。
9. 一种锌指蛋白ZBTB20或其编码基因的用途，其特征在于，用于制备诊断糖尿病的试剂或试剂盒。
10. —种体外或体内调节胰岛P细胞胰岛素释放的方法，其特征在于，所述 方法包括提高胰岛P细胞中锌指蛋白ZBTB20的表达或活性。
全文摘要
本发明公开了一种锌指蛋白ZBTB20的用途，用于制备促进哺乳动物胰腺β细胞胰岛素释放的组合物。本发明还公开了基于所述锌指蛋白ZBTB20为靶点，筛选对于促进哺乳动物胰腺β细胞胰岛素释放有效的物质的方法。本发明首次揭示锌指蛋白ZBTB20在调节胰腺β细胞胰岛素释放方面具有重要的作用，从而为糖尿病药物的研究提供了有效的靶点。
文档编号C12Q1/68GK101371919SQ20071004522
公开日2009年2月25日 申请日期2007年8月24日 优先权日2007年8月24日
发明者周光迪, 晔 张, 海 张, 宇 杜, 章卫平, 谢志芳 申请人:中国人民解放军第二军医大学