微卫星不稳定性细胞的检测方法以及试剂盒的制作方法

专利名称：：微卫星不稳定性细胞的检测方法以及试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及用于癌诊断的、基于基因表达分析来检测具有微卫星不穗定性的细胞的方法。
背景技术：
：据报道通过人类基因组计划阐明的惊人发现之一是人基因组中含有的基因数比预测少的多，只有25000个左右。这个基因数和更低等生物相比几乎没有差异，不能充分解释人的复杂的脑系统和免疫系统统的功能。所以认为在高等动物的复杂的生物功能中，来自l个基因的多种的表达结构起着重要的作用。来自1个基因的mRNA以及蛋白质的表达的多样性主要是通过mRNA转录、或者RM加工阶段的选择性启动子的利用、或者选择性剪切进行控制的(参见非专利文献1)。选择性剪切是指在mRM前体中多个内含子存在的情况下，通常通过在多种剪切部位间发生在相互邻接的剪切部位间进行的剪切反应，由1个mRNA前体产生多种成熟的niRNA(剪切变体)的机制。另一方面，选择性启动子是指存在控制1个基因的转录的选择性的多个启动子。在选择性启动子存在的情况下，由于在这个基因上存在多个转录启点，结果生成了具有不同的5'末端序列的多种转录产物。最近，报道说基于寡核苷酸帽法cDNA文库中含有的1780295种的完整长cDNA序列进行的检索，结果令人吃惊地发现在美国NCBI的RefSeq数据库(http:〃ncbi.nih.gov/RefSeq/;转录产物相关数椐库)中登记的基因中有约52%的基因在选择性启动子的控制之下，平均每1个基因存在3.1个选择性启动子(参见非专利文献2)。已知通过这样的由1个基因进行多种表达，衍生出在进化的过程中的生物的多样性和复杂的生物功能，另外一方面，导致在个体中的异常蛋白质的产生和蛋白质自体缺陷，其结果有时诱发细胞癌变(参见非专利文献3)。对于遣传性非息肉性大肠癌(Hereditarynon-poliposiscolorectalcancer;HNPCC)，通过从1993年到1995年分离的错配修复相关的各种基因的发现，对其在遗传学上的理解取得理飞跃性的进步。错配修复机制是指识别DNA复制和基因重组时在DNA上产生的异常的碱基匹配(错配)，将其除去加以修复的机制。已知在家族性肺瘤中最具代表性的疾病之一的HNPCC中，90%以上的情况下，作为错配修复系统缺陷的反映的结果，其肿瘤組织的DNA中微卫星不穗定性(MicrosatellUeinstability;MSI)呈阳性(参见非专利文献4)。微卫星是指2~5个碱基对的重复单位反复重复数次到数十次的重复序列，其不穗定性是指它们的重复数变得异常地少的现象。MSI通常能够通过采用PCR法的微卫星标记(BAT25、BAT26、D2S123、D5S346、D17S250等)的分析实现检测，所以MSI的检测成为在HNPCC诊断时的一个辅助(参见非专利文献5)。此外，在1997年的MSI检测相关国际交流会议中，将检测出这些标记中的2个以上的不稳定性的肿瘤定义为MSI-H(检测出肿瘤中30%以上的MSI的状态)，判定具有临床病理性特征，癌的基因诊断多数根据致病基因的突变解析的结果。不过作为家族性腺痛性息肉病(Familialadenomatouspolyposis;FAP)的致病基因的APC基因等是不同的，在HNPCC的情况下，已经确定了5个(hMSH2、hMLHl、hPMSl、hPMS2、以及hMSH6)致病基因，不过在这些致病基因有突变的情况下，发病的比例(浸透率；penetrancerate)也不是100%，所以在美国临床肿瘤学会(ASCO)的分类中，基于上述致病基因的突变进行的HNPCC的基因诊断现在尚且未达到临床水平，处于研究水平阶段.也有人提出了针对hMLHl等癌相关基因进行基因组上的基因突变和甲基化检测，以此作为指标的癌检测方法的方案(专利文献1以及2)。不过疾病覆盖率不太高，此外在简便性以及迅速性方面也有问题。所以亟需开发出用于包括HNPCC在内的癌诊断的、简便并且高可靠性的好的细胞检测方法。认为如果公开发能够判断癌发病的基因表达水平的细胞检测方法，因为能够确认检测时的细胞的基因表达状态，所以能够用于实时地检测细胞的突变。不过尚未开发出这样有用的检测方法。专利文献1:特开2005-304497号公报专利文献2:特表2002-533061号公报非专利文献1:LandryJ.R.etal.，TrendsinGenetics,(2003)19(11)p.640-648非专利文献2:KimuraK.etal.，GenomeResearch,(2006)16:p，55-65非专利文献3:BrinkmanB.M.,Clin.Biochem.，(2004)37(7):p.584-594非专利文献4:LiuB.etal.，NatureMed.，(1996)2:p,169-174非专利文献5:LaihoP.etal.，CancerResearch,(2002)62:p.1166-1170非专利文献6:DengG.etal.，CancerResearch,(1999)59:p.2029-203
发明内容发明所要解决的问趙本发明的目的是提供能够用于癌诊断的、基于基因表达分析的细胞的检测方法.解决问趙的方法本发明人等为了解决上述问题，反复努力研究，结果发现由人MLHl基因(hMLHl基因)表达至少3种转录产物变体(变体1、变体2、变体3)，此外在显示微卫星不穗定性的癌细胞中，与其中主要的转录产物的变体1相比，变体3的表达量相对增加，由此完成了本发明。即、本发明包含下述内容。[1]基因表达分析方法，特征在于，测定生物试样中的在5'末端含有序列号1所示的碱基序列的人MLH1基因的转录产物、以及在5'末端含有序列号2所示的碱基序列的人MLH1基因的转录产物的表达量，通过将其进行比较，检测显示微卫星不稳定性的细胞。在该方法中，能够使用实时PCR法测定转录产物的表达量。使用实时PCR法的测定可以使用TaqMan(注册商标)探针法进行。在本发明的方法中优选使用下述的(a)以及(b)的引物对进行测定(a)引物对:其是由至少含有序列号1所示的碱基序列上的1~204位的外显子1部分的一部分的连续15~50个碱基的碱基序列构成的引物、和与序列号5所示的外显子2部分的碱基序列上的连续15~50个碱基的序列互补的碱基序列构成的引物的组合，以及(b)引物对其是由至少含有序列号2所示的碱基序列上的1~91位的外显子l部分的一部分的连续15~50个碱基的碱基序列构成的引物、和与序列号5所示的外显子2部分的碱基序列上的连续15~50个碱基的序列互补的碱基序列构成的引物的组合。作为适合上述(a)以及(b)的引物对的例子可以列举作为由序列号6所示的碱基序列构成的引物、和序列号7所示的碱基序列构成的引物的组合的引物对(a)、以及作为由序列号8所示的碱基序列构成的引物、和序列号7所示的碱基序列构成的引物的组合的引物对(b)。使用这些引物对进行测定时，在利用TaqMan(注册商标)探针法的情况下，可以使用在一端添加了荧光物质，另一端添加了消光物质的序列号9所示的碱基序列构成的探针。用上述本发明的方法检测的显示微卫星不稳定性细胞多数情况下是癌细胞.该癌可以是大肠癌。此外，这种大肠癌可以是遗传性非息肉性大肠癌。含有下述的(a)以及(b)的引物对的、用于检测显示微卫星不稳定性的细胞的基因表达量的分析用引物组(a)引物对其是由至少含有序列号1所示的碱基序列上的1~204位的外显子l部分的一部分的连续15~50个碱基的碱基序列构成的引物、和与序列号5所示的外显子2部分的碱基序列上的连续15~50个碱基的序列互补的碱基序列构成的引物的组合，以及(b)引物对其是由至少含有序列号2所示的碱基序列上的1~91位的外显子l部分的一部分的连续15~50个碱基的碱基序列构成的引物、和与序列号5所示的外显子2部分的碱基序列上的连续15-50个碱基的序列互补的碱基序列构成的引物的组合。含有下述的(a)以及(b)的引物对的、用于检测显示微卫星不稳定性的细胞的基因表达量分析用试剂盒。(a)引物对其是由至少含有序列号1所示的碱基序列上的1~204位的外显子1部分的一部分的连续15~50个碱基的碱基序列构成的引物、和与序列号5所示的外显子2部分的碱基序列上的连续15~50个碱基的序列互补的碱基序列构成的引物的组合，以及(b)引物对其是由至少含有序列号2所示的碱基序列上的1~91位的外显子l部分的一部分的连续15~50个碱基的碱基序列构成的引物、和与序列号5所示的外显子2部分的碱基序列上的连续15~50个碱基的序列互补的碱基序列构成的引物的组合。该试刑盒中含有的引物对(a)以及(b)优选引物对(a)是由序列号6所示的碱基序列构成的引物、和序列号7所示的碱基序列构成的引物的组合，引物对(b)是由序列号8所示的碱基序列构成的引物、和序列号7所示的碱基序列构成的引物的组合。该试剂盒还可以含有在一端添加了荧光物质、另一端添加了消光物质的序列号9所示的碱基序列构成的探针。作为该试剂盒的检测对象的上述细胞优选是癌细胞。特别是该试剂盒可以作为癌诊断用试剂盒使用，还可以作为大肠癌诊断用试剂盒使用，特别是作为遗传性非息肉性大肠癌诊断用试剂盒使用。发明的效果本发明的检测方法即使针对仅仅含有少量癌细胞的生物试样也能够简便并且清楚地检测hMLHl基因的表达状态，能够迅速并且简便地检测显示微卫星不稳定性细胞(特别是、癌细胞)。图l是表示hMLHl基因的3种转录产物变体的外显子结构的图。图2是表示在6种癌细胞林中的hMLHl基因的转录产物变体1以及3的表达量的图。黑色条型表示变体l、白色条型表示变体3。图2的下半页表示的是上半页图所示的各癌细胞林中变体1和变体3的表达量的比较结杲，将变体1的表达量比变体3的少表示为VI<V3，将变体1未能检测到，仅仅检测到变体3，表示为Vl(-)，V3(+)，将变体1的表达量比变体3多表示为VI>V3。此外，图2的下半页中，微卫星不穗定性(MSI)的阳性为(+)，阴性为(-)，并且hMLHl基因的启动子区域中确认有甲基化为(+)，未确认有为(-)。序列表序列号6~8以及10~12是引物。序列号9是探针.具体实施方式下面详细说明本发明。人MLH1基因(hMLHl基因)是大肠杆菌(E.coli)的DNA错配修复基因mutL的人等同物(相同体)。hMLHl基因作为识别在遗传性非息肉性大肠癌(HNPCC)中高频性突然突变的基因座已经为人所知。hMLHl基因的mRNA的RefSeq序列公开在GenBank登记号NM000249中，在本说明书中为了参照该序列，表示为序列号13。该hMLHl基因的mRNA的RefSeq序列(序列号13)中含有hMLHl基因中所含有的19个外显子部分。在本发明中，作为hMLHl基因的转录产物的变体(variant;突变体)，除了与作为主要转录产物的上述RefSeq序列几乎一致的变体1之外，发现还存在变体2以及变体3(图1)。该变体1在其5'末端含有序列号1的碱基序列(外显子l+2)，之后连接着hMLHl基因的外显子3~19部分(与序列号13的第268~2524位碱基相当)。变体2具有与变体1几乎相同的外显子结构，但在外显子2部分(序列号5)的5'末端缺失5个碱基。另一方面，因为变体3来自从变体1更后方的约300bp的转录启点开始转录而得到的mRM前体，所以其5'末端含有和变体1不同的序列号2的碱基序列(外显子l+2)，其后面连接有和变体1以及2共同的外显子3~19部分。因为变体l的外显子l部分中含有翻译启始部位ATG，所以推测变体3编码的蛋白质与变体1编码的蛋白质至少在5'末端的氨基酸序列上不同，是作为不完整的蛋白质而产生的或者根本不产生。本发明中还表现出了在大肠癌等的癌细胞、特别是显示微卫星不稳定性细胞中，与上述的变体1的表达量相比较，变体3的表达量相对增加。因为预测在生物内通常变体l的表达量最多，所以这样的hMLHl基因的转录产物之间的表达重的比率的变化显示生物试样中的细胞中hMLHl基因的表达状态的异常。所以由此认为这种异常与细胞中微卫星不稳定性以及癌变有关。本发明的方法是基于以上发现的基因表达分析方法，其特征在于，测定在生物试样中的变体1(在5'末端含有序列号1所示的碱基序列的人MLH1基因的转录产物)、以及变体3(在5，末端含有序列号2所示的碱基序列的人MLH1基因的转录产物)的表达量，通过将其进行比较检测显示微卫星不稳定性的细胞。在本发明中，生物试样可以是从人受试者回收到的任意的組织、细胞或者体液。这样的生物试样可以是例如皮肤、粘膜组织、消化道组织等，也可以是血液、淋巴液、唾液、精液等。更优选的生物试样特别是肿瘤、癌组织、或者癌变疑似組织。生物试样也可以是建立品系的培养细胞。特别优选的生物试样是来自大肠癌的组织或者细胞、或者也可以大肠癌(并非是限定，例如、遗传性非息肉性大肠癌)的疑似大肠组织或者细胞等。本发明中用语"转录产物"包含从某些基因转录得到的mRM前体、该迈RNA前体的修饰物(通过加帽结构添加或者多聚腺苷酸化进行量修饰的产物等)、成熟mRNA、以及从成熟RNA逆转录的cDNA。作为转录产物，当指的是RNA的情况下，为了指定该转录产物而将各序列号等所示的碱基序列中的"T(胸腺嘧啶)"换成"U(尿嘧啶)"。本发明中"转录产物(变体)的表达量"指的是生物试样中的由该基因表达得到的转录产物的存在量。生物试样中转录产物变体1以及变体3的表达量的测定可以使用本
技术领域：
内公知的方法，对这样的表达量的测定没有限定，可以使用例如实时PCR法、半定量的RT-PCR法、使用毛细管电泳装置的竟争的PCR法、使用DNA芯片或者微阵列的基因表达量测定法、Northern印记法等测定从生物试样中制备得到的核酸试样(例如RNA、cDM)中的各转录产物的存在量。从生物试样制备核酸试样可以按照常规方法进行，也可以在分析前进行纯化。本发明中实施的基因組DNA或RNA的制备可以按照J.Sambrooketal.(Eds.)，MolecularCloning,3nded.ColdSpringHarborLaboratoryPress,(2001)等的分子生物学领域的标准的试验书进行。变体1以及变体3的表达量的测定只要能区分开不同的转录产物，进行定量，可以使用任何方法。本发明中分别检测例如、变体1和变体3间具有很大差别的外显子1部分，进行定量的方法很方便。作为一个例子。对使用实时PCR法的表达量测定进行详细的说明。实时PCR法是实时地监测PCR扩增产物的增加，进行解析的技术。通常使用热循环仪和分光荧光光度计一体化的实时PCR仪进行。实时PCR和以往的PCR法相比，不需要进行电泳，所以能够迅速并且简便地解析，而且对DNA和RM的定量性优良。通过实时PCR法进行定量的原理如下所示。首先，将梯度稀释的已知量的DNA作为标准试样，一边进行PCR，一边进行PCR产物量的监测，读取针对各稀释样在指数级扩增区域达到的一定的扩增产物量的循环数(thresholdcycle;Ct值)，将其作为橫轴坐标，然后将标准试样的初期模板量作为纵轴坐标，制作标准曲线。对于含有未知浓度的转录产物的待测核酸试样，一边进行和标准试样相同的条件下的PCR反应，一边进行监测，求出达到与上述相同的扩增产物量的循环数(Ct值)。待测核酸试样得到的Ct值与上述制作的标准曲线拟合，能够算出待测核酸试样中含有的初期模板量。这个初期模板量相当于转录产物的表达量。对实时PCR中的PCR产物量的监测(检测)没有限定，优选能够使用荧光物质来进行。作为这种荧光监测法没有限定，可以使用例如intercalater、TaqMan(注册商标)探针法等公知的技术。intercalater法是通过将与双链DNA结合的发出荧光的物质(intercalater法)SYBR(注册商标)GreenI添加到实时PCR反应系中的方法。在该方法中，intercalater结合到PCR反应合成的双链DNA上，经过激发光的照射发出荧光，通过测定其荧光强度，能够监测PCR扩增产物的生成量。这种intercalater法，不需要制备用于任意的双链DNA检测的针对每个基因的检测用探针，试验成本低廉，反应体系构建也很容易，不过检测特异性不那么高。而另外一方面，TaqMan(注册商标)探针法是通常用将荧光物质(FAM等)标记了5'末端，消光物质(TAMRA等)标记(添加)了3'末端的寡核苷酸探针(TaqMan(注册商标)探针)添加到实时PCR反应系的方法。这种方法中，TaqMan(注册商标)探针在退火步稞与模板DNA特异性地杂交，此时，因为在探针上共存有荧光物质和消光物质，所以，即使激发光照射荧光物质，也能抑制荧光的发生。不过在后续的延伸步骤中，通过TaqDNA聚合酶具有的5'—3'核酸外切酶活性将与模板杂交的TaqMan(注册商标)探针依次分解，将荧光物质从探针上释放,解除了消光物质的抑制，发出荧光。通过测定该荧光强度能够监测PCR扩增产物的生成量。这种TaqMan(注册商标)探针法试验成本高，不过，检测特异悻高，定量性也特别优良。在本发明的方法中，为了测定各变体的表达量，可以适当选用基于上述的实时PCR法的定量法。这种情况下，对PCR扩增产物的监测没有限定，可以适当使用TaqMan(注册商标)探针法。在TaqMan(注册商标)探针法中，使用在多聚核苷酸的一端添加(一般在5'末端)荧光物质，另一端(一般在3'末端)添加消光物质的TaqMan(注册商标)探针。这种探针是设计用于在实时PCR中生成的PCR扩增产物退火的。作为添加到这种探针上的荧光物质可以使用FAM、VIC，作为消光物质可以使用TAMRA等。对于实时PCR的反应条件，本领域的技术人员可以适当加以设定，也可以参照后述的实施例中记栽的反应条件。在本发明的方法中，为了各变体的表达量的测定，分别使用用于变体1的特异性PCR扩增的下述引物对(a)、和用于变体3特异性PCR扩增的下述引物对(b)，能够扩增各变体。(a)引物对由至少含有序列号1所示的碱基序列上的、1~204位的外显子1部分的一部分(优选10个碱基以上长度、例如、10~30个碱基长度)的连续15~50个碱基的碱基序列构成的引物、和与序列号5所示的外显子2部分的碱基序列上的连续15~50个碱基的序列互补的碱基序列构成的引物的组合，以及(b)引物对由至少含有序列号2所示的碱基序列上的、1~91位的外显子l部分的一部分(例如、10~30个碱基长度)的连续15~50个碱基的械基序列构成的引物、和与序列号5所示的外显子2部分的碱基序列上的连续15~50个碱基的序列互补的碱基序列构成的引物的组合。这些引物对(a)以及(b)之中，优选的具体例如下所述。引物对(a):由序列号6所示的碱基序列构成的引物、和序列号7所示的碱基序列构成的引物的组合、引物对(b):由序列号8所示的碱基序列构成的引物、和序列号7所示的碱基序列构成的引物的组合。使用由这些序列号6~8的序列构成的引物的組合，基于TaqMan(注册商标)探针法，通过实时RNA测定上述变体1以及3的表达量的情况下，作为TaqMan(注册商标)探针，特别优选由一端添加(一般在5'末端)了荧光物质、另一端添加(一般在3'末端)了消光物质的序列号9所示的碱基序列构成的探针。使用这些引物以及探针进行变体的表达量测定，例如、通过含有下述步骤进行'使用序列号6所示的碱基序列构成的引物、和序列号7所示的碱基序列构成的引物，由来自生物试样的cDNA进行变体1的扩增反应的步骤、使用序列号8所示的碱基序列构成的引物、和序列号7所示的碱基序列构成的引物，由来自生物试样的cDNA进行变体3的扩增反应的步槺、'监测各个扩增反应中PCR扩增产物量，由此计算出生物试样中的变体1和变体3的初期含有重的步骤。并且，在该监测步骤中通过向各个扩增反应系中添加TaqMan(注册商标)探针，能够从得到的荧光强度测定出PCR扩增产物量。在本发明的方法中，进行如上所述的变体1以及变体3的表达量的测定后，通过将其进行比较，能够检测显示微卫星不稳定性的细胞。具体而言，比较变体1和变体3，当与变体1的表达量的测定值相比，变体3的表达量的测定值高的情况下，表示所研究的生物试样中含有显示微卫星不穗定性细胞的可能性高。并且如果检测不到变体l，仅仅检测到变体3的情况下，由于变体3的表达量为多，也能判断含有显示微卫星不稳定性的细胞。这样，在本发明的方法中，能够针对来自受试者回收的生物试样进行显示微卫星不稳定性细胞的存在的检测。微卫星不稳定性是基因组上的2~5个碱基的重复单位(微卫星)的重复数异常少的现象。高度的微卫星不稳定性在全部大肠癌中有12~16%、在遣传性非息肉性大肠癌中有90%以上。微卫星不稳定性实际上在子宫癌、胃癌、食道癌、多重癌、淋巴系统肿瘤、扁平上皮癌等各种癌中被观测到，与癌的相关性强。微卫星不稳定性是由于DNA修复机制的缺陷造成的，所以推测显示微卫星不稳定性的情况具有癌多发倾向性和预后不良。所以通过本发明的方法检测到显示微卫星不稳定性细胞的情况下，可以判断该细胞是癌细胞的可能性高。这样检测的显示微卫星不稳定性细胞可以是癌细胞，具体的而言，例如大肠癌、遣传性非息肉性大肠癌、子宫癌、胃癌、食道癌、多重癌、淋巴系统肿瘤、扁平上皮癌、子宫内膜癌、胰癌，优选大肠癌，特别是遗传性非息肉性大炀癌。这样以来本发明涉及测定生物试样中hMLHl基因的变体1和变体3的表达量，通过将其进行比较，进行癌细胞的检测的方法。此外，本发明涉及在上述方法中优选使用的含有引物对(a)、(b)的引物组，即，该引物组是用于检测显示微卫星不稳定性的细胞的基因表达量分析用的、下述(a)以及(b)所示的各引物的组合。(a)引物对由至少含有序列号1所示的碱基序列上的、1~204位的外显子1部分的一部分(例如、10~30个碱基长度)的连续15~50个碱基的械基序列构成的引物、和与序列号5所示的外显子2部分的碱基序列上的连续15~50个碱基的序列互补的碱基序列构成的引物的组合、以及(b)引物对由至少含有序列号2所示的碱基序列上的、1~91位的外显子1部分的一部分的(例如、10~30个碱基长度)的连续15~50个械基的碱基序列构成的引物、和与序列号5所示的外显子2部分的碱基序列上的连续15~50个碱基的序列互补的碱基序列构成的引物的组合。作为这些引物组的具体例子，可以列举:含有序列号6所示的碱基序列构成的引物、序列号7所示的碱基序列构成的引物、和序列号8所示的械基序列构成的引物的组合。这些引物可以使用本
技术领域：
公知的寡核苷酸合成技术或者以序列号1或者2等上述hMLHl基因变体1以及3内的序列作为模板通过PCR法等容易地进行制备。并且本发明中的"引物"只要能用于PCR等中，可以标记适合检测用的标记就行。例如，本发明涉及的引物可以是在5'末端或者y末端添加了荧光色素、酶、蛋白质、放射性同位体、化学发光物质、生物素等的标记的多聚核苷酸。在本发明中，通过向多聚核苷酸添加而用于检测用等的寡核苷酸(例如、用于突变检测的invader法中的与模板无关的序列"flap"等)也包含在"标记"中。此夕卜，本发明涉及含有上迷引物对(a)以及(b)的、用于检测显示微卫星不穗定性的细胞的基因表达量分析用试剂盒。该试剂盒中还可以含有一端添加了荧光物质、另一端添加了消光物质的序列号9所示的碱基序列构成的探针的TaqMan(注册商标)探针。该试剂盒的检测对象优选是癌细胞，特别是可以用于显示微卫星不稳定性的癌细胞的检测用。所以，本试刑盒可以用作癌诊断用试剂盒。此外，本试剂盒可以用作大肠癌诊断用试刑盒、特别是遗传性非息肉性大肠癌诊断用试剂盒。实施例下面使用实施例对本发明进一步具体地加以说明。不过，本发明的技术的范围不局限于这些实施例中。[实施例1]hMLHl基因的转录产物变体的探索本发明人等为了研究hMLHl基因通过利用选择性剪切或者选择性启动子而作为多个转录产物变体(突变体)进行表达的可能性，进行了下述试验，如非专利文献2所记栽的基于使用寡核苷酸帽法构建的cDNA文库(SuzukiandSugano(2003)MethodsMol.Biol.221:p.73-91)得到人基因完全长cDNA，阐明含有5'末端的人完全长cDM的碱基序列信息有大约1800000种。这些序列信息登记于GenBank中，一般都是公开的.本发明人等从GenBank收集这些序列信息，进行multi-FASTA-format化，针对这样得到的序列数据，将hMLHlmRNA的RefSeq序列(NCBIReferenceSequence)(GenBank登记号NM_000249;序列号13)作为query序列，用blastn程序进行同源性检索，将选中的序列中的E-value在101。以下的序列作为hMLHl相关cDNA序列。然后提取GenBank的人基因组序列数据的Build35的3号染色体中与hMLHl基因相当的区域的碱基序列，将该hMLHl基因的基因组序列和上述那样选择出的每个hMLHl相关cDM序列用BLAST程序的bUseq进行处理，得到分别比对的结果。从这样得到的hMLHl基因组序列与各hMLHl相关cDM序列的比对中，选择出被认为能与上迷的hMLHlRefSeq序列上的2位的外显子部分(画—000249的第177~267位碱基序列)更靠前面的区域内也能很好地比对(alignment)的部分，并且比对部分中一致率达到98%以上的基因。解析选择的比对序列时，发现hMLHl相关cDNA序列和hMLHl基因组序列的对应关系有3种模式。即，判断在hMLHl基因的转录产物中存在至少3种变体(变体1~3)。这3种转录产物的5'末端側的结构如图1所示。在图1中仅仅表示了各转录产物中所舍的19个外显子区域中的最初的3个。如图1所示，转录产物的变体1从5'末端侧开始依次连接着外显子1部分、外显子2部分、外显子3部分，在外显子1部分中含有翻译启始部位(ATG)。通过该解析可知作为hMLHl基因的RefSeq序列的NM000249碱基序列，在该变体1的外显子l部分的5'末端存在少量的缺失。与此相对，变体2具有和变体1几乎相同的外显子结构，不过外显子2部分和变体1的外显子2部分相比，在5'侧短了5个碱基，是选择性剪切变体，此外，在变体3中，外显子2部分以及外显子3部分与变体1相同，不过，外显子1部分是与变体1以及2不完全相同的序列。由此可知hMLHl基因通过选择性启动子受到控制，变体3的结果是在比变体1靠近后面约325bp的转录启点开始转录，经过剪切后生成的。在上迷解析中表现出，在所选择的hMLHl相关cDNA序列中，变体1是141个(75%)、变体2是14个(7.4%)、变体3是33个(17.6%)，变体1是最主要的转录产物。分类为各变体的hMLHl相关cDNA序列表示在表1中。表1中，各hMLHl相关cDM序列如GenBank登记号所示。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>本实施例中发现的变体1以及3的外显子1~2部分的碱基序列如表2所示，表2<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>[实施例2]通过实施例1的解析可知作为hMLHl基因的转录产物存在3种的变体。虽然到目前为止已知hMLHl基因是细胞癌变相关的基因，不过这次为首次阐明存在转录产物变体，推测这些变体和癌之间具有相关性。所以然后着眼于变体1以及3，通过实时PCR测定其细胞内表达量，将癌细胞和正常细胞进行比较。作为待测材料，从ATCC(AmericanTypeCultureCollection)以及財团法人人类科学振兴财团研究资源银行购买的培养细胞林LoVo、COLO320、C0L0201、SW48、RKO、HCT116(全部是来自人大肠癌细胞)。将各细胞在添加了10%FBS(Invitrogen公司)的AdvancedDMEM培养基(Invitrogen公司)中培养。从培养后的细胞中使用QIAGEN公司的RNeasyTissueKit提取总RNA。将提取的总RNA在后述的逆转录反应以及实时PCR中作为待测试样使用。此外，设计在实时PCR中使用的引物以及探针。引物以及探针的设计可以使用实时PCR仪ABIPRISM7900HT(AppliedBiosystems公司)附带的PrimerExpress软件进行。从输入各种条件得到的引物以及探针的检索结果中选择出分值高的最前面的IO组，用这些进行实际的实时PCR来进行评价的时候，因为都得到很好的结果，所以使用最高分值的引物以及探针的组合进行下述的试验。在逆转录反应(cDNA合成反应)中使用SuperscriptIIIReverseTranscripUse(Invitrogen公司)。首先向管中加入2.Ojil的寡聚(dT)2。引物(50fiM)、2.Ojig的总RNA、4.Ojil的dNTPs(5mM)，加入DEPC处理水，使总量达到26jil。然后将该混合物在65"C下温育5分钟后，迅速移到冰上，加入5xFirstStrandBuffer(8.Opl)、0.1MDTT(2.0|il)、Superscript"IIIReverseTranscriptase(2.Ojil)、DEPC处理水(2.Ojil)，使总量达到40pl。将其用涡旋器混合后，进行离心，将溶液收集到管子的底部，在50t:温育60分钟。然后，通过在？ox:温育15分钟终止反应。然后，用上述得到的逆转录产物作为模板，使用ABIPRISM7900HT(AppliedBiosystems社)，通过实时PCR，尝试对来自各细胞的逆转录产物中含有的变体l、变体3分别进行定量。为了进行变体1的PCR扩增，混合作为模板DNA的逆转录产物l.Opl、lxmaster-混合物lOjil、5.OjiM正义引物(5'-CAGCGGCCAGCTAATGCTAT-3';序列号6)3.5pl、5.OjiM反义引物(5'-CCATTGTCTTGATCTGAATCAACTTC-3';序列号7)3.5pl、5.OjiMTaqMan(注册商标)探针(5'-CAAGTATTCAAGTGATTGTTAAAGAGGGAGGCC-3';序列号9)5.Opl、超純水1.Ojil，制备总量为20>il的反应液。为了变体3的PCR扩增用，同样地，混合作为棋板DM的逆转录产物l.Ojil、"master-混合物lOjil、5.OnM正义引物(5'-GGGTTGTTTGGAGTTTTAGATGCA-3';序列号8)3.5pl、5.OjiM反义引物(5'-CCATTGTCTTGGATCTGAATCAACTTC-3';序列号7)3.5|il、5.0jiMTaqMan(注册商标)探针(5'-CAAGTATTCAAGTGATTGTTAAAGAGGGAGGCC-3。序列号9)5.0jU、超纯水l.Onl,制备总量为20jil的反应液。此处使用的TaqMan(注册商标)探针是能够在变体1以及3共同检测中使用的探针，是由AppliedBiosystemsJapan株式会社制备的在5'末端标记FAM(荧光物质)、在3'末端标记TAMRA(消光物质)的形态的探针。制备的反应液供给ABIPRISM7900HT(AppliedBiosystems公司)，在95C反应IO分钟后，在95X:下15秒，以及在60t:下l分钟，进行40个循环的反应，然后测定荧光强度，还有，为了制作可以从实时PCR中测定得到的荧光强度计算出试样中的DNA量的标准曲线，在进行实时PCR前，由来自COLO320细胞株的上述逆转录产物如下所述那样预先制备PCR产物。首先，为了变体1的PCR扩增用，混合作为模板DNA的逆转录产物2.0jil、10xPCR緩沖液5.Ojil、dNTP混合物(各2.5mM)4.Opl、5.OjiM正义引物(5'-CTGGACGAGACAGTGGTGAAC-3';序列号10)3.5pl、5.OjiM反义引物(5'-ATACTGGCTAAATCCTCAAAGGACTG-3';序列号11)3.5pl、ExTaq聚合酶0.25|il、超純水37nl，制备得到总量为50pl的反应液。为了变体3的PCR扩增用，除了变更正义引物为序列号12(5/-TTTCTTTACCGCTCTCCCCCG-3')所示的序列之外，按照与上述变体1的PCR扩增用相同的组成制备反应液。制备的各反应液在951C下反应IO分钟后，在95匸下30秒、在63匸下1分钟、在72匸下1分钟，进行35个循环的反应，最后在721C反应IO分钟。对于这样得到的来自COLO320细胞林的PCR产物测定DNA量后，进行梯度稀释，将其作为模板DNA与在上述的实时PCR中其他的逆转录产物一样地进行扩增。并且，进行与上述相同的荧光强度的测定，根据得到的值，按照常规方法制作标准曲线。根据由上述测定的荧光强度得到的Ct(ThresholdCycle)值、和上述制成的标准曲线，计算出从各细胞提取到的总RNA中含有的初期转录产物中的变体1以及3的量。该各变体量的测定值即相当于各自的表达量.以上那样定量的6种大脉癌培养细胞中的变体1以及3的表达量结果如图2所示.如图2所示，对于变体1，在LoVo、HCT116、C0腦0、以及C0L0201细胞中检测到了表达，在RKO以及SW48细胞中未检测到表达(检测限以下)。这些结果和目前的报道(非专利文献5)是一致的。另一方面，本发明人等首次阐明的变体3的表达模式和变体1的表达模式是明显不同的，在目前的报道未检测到hMLHl的变体1的表达的RK0细胞和SW48细胞中检测到了变体3的表达。此外，变体3在LoVo细胞以及HCT116细胞中，与变体l相比，表达量显著多。该结果与在实施例1的解析中变体1是hMLHl基因的主要转录产物，变体3的表达量少的预测相反。速样，变体3比变体1多表达的LoVo以及HCT116细胞、以及检测到变体3但是检测不到变体1的RK0细胞以及SW48细胞在使用文献信息进行分析时，发现微卫星不稳定性(MSI)呈现阳性(图2、非专利文献5)。此外，根据非专利文献5的记栽研究左右hMLHl基因的表达量、同基因的启动子区域的曱基化程度的时候，只有检测到变体3但未检测到变体l的RK0细胞以及SW48细胞在hMLHl基因的启动子区域中检测到了甲基化。即可以认为hMLHl基因的启动子区域中的甲基化抑制变体l的表达，不抑制变体3的表达。如果考虑到已知hMLHl基因与遗传性非息肉性大肠癌(HNPCC)相在内的各种癌中高频率地出现微卫星不稳定性阳性，可以认为相对于hMLHl基因的转录产物变体l，变体3的表达量的相对增加，和癌中MSI阳性以及启动子区域的甲基化有关。对于变体3的表达条件和其表达所影响的癌症发病的具体作用并不清楚。认为与其说是转录产物变体3自体的MSI，进一步对癌发病带来恶劣影响，不如说变体1的表达量的低下或者丧失可能是造成诱发MSI的重要原因。不过，不论如何对这些机制进行推测，可以明确与转录产物变体1相比较，变体3的量的表现相对增加的情况表示存在伴随MSI的癌细胞。产业上的可利用性本发明的检测方法能够在很早期的癌检测样本等中，简便并且清楚地检测到大炀癌等的癌细胞的存在。本方法得到的检测结果在以HNPCC代表的伴随微卫星不穗定性的癌症的早期诊断中可以作为有用的判断材料。序列表<110>日立公司<120〉微卫星不稳定性细胞的检测方法以及试剂盒<130〉H600399<160〉14<歸PatentlnVer.2.1<210>1<211〉295<212>DNA<213〉智人(Homosapiens)<220><223>发明人高桥亮介；永井启一<400>1幼gaacgtgagcacgaggcactgaggtgattggctg幼ggcacttccgttgagcatctag60acgtttccttggctcttctggcgccaaaatgtcgttcgtggcaggggttattcggcggct120ggacgagacagtggtg咖cgcatxgcggcgggggaagttatccagcggccagctaatgc180tatcaaagagsttgattgaLgaactgtttagatgcaaaatccacaagtattcaagtgattgt240taaagagggaggcctgaagttgattC3gatccaagacaatggcaccgggsitc鄉295〈210〉2〈211>213<212〉DNA<213>智人<400>2gcatgcccacaacggcggaggccgccgggtttccgcagaccgtgtgtttctttaccgctcgttttagatgcaaaatccacaagtattcaaattcagatccaagacaatggcaccgggatctccctgacgtgccagtcaggccttctcctt60tcccccgagaccttttaagggttgtttgga120gtgattgttaaagagggaggcctgaagttg180agg213<210>3<211>204〈212>DNA<213>智人<400〉3aagaacgtgagcacgaggcactgaggtgatacgtttccttggctcttctggcgccaaaatggacgagacagtggtgaaccgcatcgcggctatc幼卿gatg3ttg3gssctgtggctgaaggcacttccgttgagcatctag60gtcgttcgtggc鄉ggttattcggcggct120gggggaagttatccagcggccagctaatgc180204<210>4〈211>122<212>醒<213>智人<400〉4gcatgcccacaacggcggaggccgccgggttccctgacgtgccagtcaggccttctcctt60ttccgcagaccgtgtgtUcUtaccgctctcccccg柳ccttUaagggttgtttgga120gt122<210>5<211〉91<212>DNA<213>智人<400〉5tttagatgcaaaatccacaagtattcaagtgattgUaaagagggaggcctg肌gttgat60tcagatccaagacaatggcaccgggatcagg91<210>6<211>20<212>DNA<213〉人工序列<220〉<223〉人工序列的描述引物<6cagcggccagctaatgctat<210〉7<211>26<212>腿<213〉人工序列<220〉<223〉人工序列的描述引物<400>7ccattgtcttgatctgaatcaacttc26<210〉8<211〉24<212〉腿<213〉人工序列〈220〉<223〉人工序列的描述引物<400>8gggttgtttggsgttUagatgca24<210>9<211>33<212>腿〈213>人工序列<220><223>人工序列的描述探针<400>9caagtattcaagtgattgttaaagagggaggcc33<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物■>10ctggacgagacagtggtgaac21<210>11<211>26<212〉DNA〈213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物■>11atactggctaaatcctcaaaggactg26<210>12<211>21<212>腿<213>人工序列<220><223〉人工序列的描述引物〈400>12tttctttaccgctctcccccg21〈210>13<211>2524〈212>腿<213>智人<220><221>CDS<222>(61)..(2331)<柳>13attggctgaaggcacttccgttgagcatctagacgtttccttggctcttctggcgccaaa60atgtcgttcgtggcaggggttatteggeggMetSerPheValAlaGlyVallieArgArg1510ctggacgagacagtggtg108LeuAspGluThrValVal15aaccgcategcggcgggggaagttatecagAsnArglieAlaAlaGlyGluVallieGin2025eggccagetaatgetate156ArgProAlaAsnAlalie30aaagagatgattgagaactgtttagatgcaaaatecacaagtattcaa204LysGluMetlieGluAsnCysLeuAspAlaLysSerThrSerlieGin354045gtgattgttaaagagggaggcctgaagUgattcagatecaagacaat252VallieValLysGluGlyGlyLeuLysLeulieGinlieGinAspAsn505560ggcsecggg3tcagg咖g幼gatctggstattgtstgtgasaggttc300GlyThrGlylieArgLysGluAspLeuAsplieValCysGluArgPhe65707580actactagtaaactgcagtectttgaggatttagccagtatttctacc348ThrThrSerLysLeuGinSerPheGluAspLeuAlaSerlieSerThr859095tatggctttcgaggtgaggetttggccageataagecatgtggetcat396TyrGlyPheArgGlyGluAlaLeuAlaSerlieSerHisValAlaHis100105110gttactattacaacgaaaacagetgatggaaagtgtgcatacagagca444ValThrlieThrThrLysThrAlaAspGlyLysCysAlaTyrArgAla115120125agttacteagatggaaaactgaaagcccctcctaaaccatgtgetggc492SerTyrSerAspGlyLysLeuLysAlaProProLysProCysAlaGly130135140aatcaagggacccagateacggtggaggaccttttttacaacatagcc540AsnGinGlyThrGinlieThrValGluAspLeuPheTyrAsnlieAla145150155160acgaggagaaaagetttaaaaaatccaagtgaagaatatgggaaaatt588ThrArgArgLysAlaLeuLysAsnProSerGluGluTyrGlyLyslie165170175ttggaagttgttggcaggtatteagtacacaatgcaggcattagtttc636UuGluValValGlyArgTyrSerValHisAsnAlaGlylieSerPhe180185190teagttaaaaaacaaggagagacagtagetgatgttaggacaetaccc684SerValLysLysGinGlyGluThrValAlaAspValArgThrLeuPro195200205aatgccteaaccgtggacaatattcgctecatetttggaaatgetgtt732AsnAlaSerThrValAspAsnlieArgSerliePheGlyAsnAlaVal210215220agtcgagaactgatagaaattggatgtgaggataaaaccetagccttc780SerArgGluLeulieGluIle'GlyCysGluAspLysThrLeuAlaPhe225230235240aaaatgaatggttacatatecaatgcaaactacteagtgaagaagtgc828LysMetAsnGlyTyrlieSerAsnAlaAsnTyrSerValLysLysCys245250255atettcttaetcttcateaaccatcgtctggtagaateaacttecttg876liePheLeuLeuPhelieAsnHisArgLeuValGluSerThrSerLeu260265270agaaaagccatagaaacagtgtatgcagcctatttgcccaaaaacaca924ArgLysAlalieGluThrValTyrAlaAlaTyrLeuProLysAsnThr275280285cacccattcctgtacetcagtttagaaateagtccccagaatgtggat972HisProPheLeuTyrLeuSerLeuGlulieSerProGinAsnValAsp290295300gttaatgtgcaccccacaaagcatgaagttcacttcctgcacgaggag1020ValAsnValHisProThrLysHisGluValHisPheLeuHisGluGlu305310315320ageatectggagegggtgcagcagcacategagageaagetcctgggc1068SerlieLeuGluArgValGinGinHislieGluSerLysLeuLeuGly325330335tecaattectecaggatgtacttcacccagactttgetaccaggactt1116SerAsnSerSerArgMetTyrPheThrGinThrLeuLeuProGlyLeu340345350getggcccctctggggagatggttaaatecacaacaagtctgaccteg1164AlaGlyProSerGlyGluMetValLysSerThrThrSerLeuThrSer355360365tcttctacttctggaagtagtgat卿gtctatgcccaccagatggtt1212SerSerThrSerGlySerSerAspLysValTyrAlaHisGinMetVal370375380cgtacagattecegggaacagaagcttgatgcatttctgcagcctctg1260ArgThrAspSerArgGluGinLysLeuAspAlaPheLeuGinProLeu385390395400ageaaacccctgtecagtcagccccaggcc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