专利名称：一种炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶的表达方法
技术领域：
本发明涉及一种表达炭疽杆菌Y噬菌体裂解酶的方法
背景技术：
炭疽杆菌是一种能形成芽胞的革兰氏阳性大杆菌，由它感染引起的炭疽病是危害人类的 致死性重大传染病。炭疽杆菌在有氧条件下形成大量芽胞，芽胞被人体吸入后在肺泡周围的 淋巴细胞中萌发，其繁殖体和毒素进入血液，可致99%以上的未防护人群死亡。
芽胞生存力强，在干燥土壤中存活40年以上仍具有感染力，当前新发突发细菌病原体不 断出现，抗生素抗性越来越高，且在世界范围内普遍存在，裂解酶由于杀灭细菌的作用机制 与抗生素不同，裂解细菌细胞壁使之致死，细菌不会产生抗性，而Y噬菌体裂解酶专性裂解 炭疽杆菌，与炭疽杆菌结合力强，可替代抗生素，杀灭清除炭疽杆菌繁殖体与芽孢，具有开 发成药物的潜力。
2002年，Schuch (Nature ，2002 ，418(8) :884 - 889)等人首次证实了 Y噬菌体裂解酶(命 名为plyG)可快速裂解生长中的炭疽杆菌并可有效地杀死感染炭疽杆菌小鼠中的病原菌。炭 疽杆菌Y噬菌体裂解酶由233个氨基酸残基组成，是N—乙酰胞壁酸一L一丙氨酸酰胺酶，通 过破坏炭疽杆菌细胞壁中的N—乙酰胞壁酸和L一丙氨酸之间的交联而使其裂解。体外试验表 明plyG可特异性裂解炭疽杆菌各株型的细菌和芽孢，而对与其非常接近的蜡样芽孢杆菌、苏 云金芽孢杆菌则没有杀灭效果。对其它如枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽胞杆菌、 短小芽孢杆菌也没有作用。
Y噬菌体裂解酶对炭疽菌及芽孢的快速杀灭效果与高灵敏度，作为炭疽菌诊断试剂、炭 疽菌污染环境的洗消剂及炭疽治疗药物，具有开发潜力。因此本项目用基因工程的方法表达 Y噬菌体裂解酶，作为炭疽环境污染检测试剂、炭疽洗消剂与炭疽治疗药物的用途。
根据已有文献报道，美国的RaymondSchuch (2002)对Y噬菌体裂解酶做功能鉴定时用 了大肠杆菌表达系统获得具有活性的plyG，国内军事医学科学院生物工程研究所(2005)也 用大肠杆菌表达系统获得Y噬菌体裂解酶plyG。该种方法表达纯化的plyG量虽然较大，但该 系统的内毒素及热源问题使其应用仍有一定的局限性。
发明内容
本发明的目的是提供一种能在毕赤酵母菌中高效表达炭疽杆菌Y噬菌体裂解酶基因的方法。
本发明所提供的表达炭疽杆菌Y噬菌体裂解酶的方法，是将上述PlyG基因插入真核细胞 表达载体，经线性化后电转化受体菌，获得重组蛋白的宿主菌，经过随机挑选和加压筛选，获得生产菌株G6，使Y噬菌体裂解酶在毕赤酵母工程菌P/c^'apo^w^ G6上清中获得高表达， 且表达产物不含多余氨基酸。
所述真核细胞表达载体可为PPIC9K等商业酵母分泌型表达载体。
所述真核细胞表达载体为pMEX9K。
所述PlyG插入到pMEX9K的feci和酶切位点间。
所述宿主菌为巴斯德毕赤酵母P!'c/n'a pc^on's GS115。
所述工程菌为巴斯德毕赤酵母尸/c/z/aG6。
上述方法中，所述表达为诱导表达，所用的诱导剂为甲醇，诱导浓度为终体积0. 51 所述工程菌的培养温度为28-3(TC，优选为28。C。
本发明使Y噬菌体裂解酶在毕赤酵母工程菌P!'cWa; flWw^ G6上清中获得高表达，且表 达产物不含多余氨基酸。活性测定本发明表达的Y噬菌体裂解酶的活性达1200U/mg。
通过离心、过滤等方法除去菌体和大颗粒杂质；再通过超滤的方法除去小分子的色素和 盐，并且浓縮体积，将发酵液调整为合适的缓冲液，经过离子交换层析、疏水层析、凝胶过 滤层析三步层析纯化后，蛋白回收率为46%，原液纯度可达95%以上。
图1为Y噬菌体裂解酶基因PlyG的电泳图(702bp) 图2为所用的表达载体pMEX9K
图3为毕赤酵母转化子表达产物plyG的SDS-PAGE分析图谱。泳道1、泳道2、泳道3、 泳道5、泳道6为诱导后转化子的表达上清。泳道4为诱导前转化子的表达上清。M为蛋白 分子量标准。目的蛋白27KD。
图4为PlyG纯化产物SDS-PAGE分析。泳道1为柱前产物，泳道2为一次纯化产物， 泳道3为二次纯化产物，泳道4为三次纯化产物。
具体实施例方式
实施例中的方法如无特别说明，均为常规方法。
1、 PlyG基因的获得
诊断用炭疽杆菌噬菌体由兰州生物制品研究所惠赠。提取噬菌体基因组，以基因组为模 板扩增噬菌体裂解酶基因。噬菌体基因组的提取方法参照入噬菌体(也为dsDNA型)DNA的 提取方法。 (1)噬菌体平板培养1) 用SM液10倍梯度稀释噬菌体原种。
2) 取0.1ml各梯度稀释离心到一消毒微量离心管中，加0.2ml新鲜培养的宿主菌，加麦芽 糖(0.2%)， MgS04 (lOmm)， 37。C温育20min，使噬菌体颗粒吸附于细菌。
3) 取熔化(47°C) 0.7Q/。琼脂LB固体培养基3ml与上述管混匀，立即倒入预备<2-4天) 的含凝固1.5y。琼脂LB固体培养基的平板内，轻轻晃动平板使均匀分布。
4) 37'C培养6-8hr后，观察噬斑形成。
5) 用剪去部分头部的吸头挖取单个噬斑到0.5ml的SM液中，加0.05ml氯仿，震荡。37 。C温育10min。
6) 重复l) 一4)，获得单个噬斑滴度。
(2) 噬菌体液体培养
1) 取2ml新鲜培养的宿主菌，离心，0.4mlLB培养基重悬，加噬菌体0.1ml (新鲜获得 的单个噬斑，依滴度使之与宿主菌比约1/500-1000)。
2) 加麦芽糖(0.2%)， MgS04 (10mM), 37。C温育20min，使噬菌体颗粒吸附于细菌。
3) 加到lOOml LB液体培养基中，加麦芽糖(0.2%), MgS04 (10mM)， 37。C摇震培养 9-12hr后可见裂解发生。
4) 加0.1ml氯仿，37'C继续摇震培养10-20min。
(3) 噬菌体DNA提取
1)将上述裂解液转移至离心管，离心8000gX10min,去细菌碎片，取上清液。
2) 力卩RNase A、 DNaseI至1 P g/ml， 37。C温育30min。
3) 加9.3gPEG8000， 5.8gNaCl，摇匀至溶解，冰浴lhr或4。C过夜。
4) 4。C离心10000gX20min，去上清液。
5) 加2ml SM液，充分洗溶管壁及沉淀，移到新微量离心管，加20u 1 10%SDS， 20n 1 0.5M EDTA， 68。Cl5min。
6) 加等体积苯酚/氯仿/异戊醇(25: 24: 1)，混匀，离心12000gX5min，取上层液到一 新微量离心管，加等体积氯仿/异戊醇(24: 1)，混匀，离心12000gX5min。
7) 取上层液到一新微量离心管，加等体积异丙醇，混匀，-2(rClhr，4i:离心12000gX10min， 去上清液。
8) lml预冷的70。/。乙醇洗漆沉淀l-2次，4'C离心8000gX7min，弃上清，将沉淀室温下 晾干。9)沉淀溶于20ulTE， -20^保存备用。
(4)以基因组为模板扩增噬菌体裂解酶基因。在目的基因两端加入SacI和五coi I酶切位点， 设计引物如下
UPPER: 5-TGGAGCTCGAAATCCAAAAGAAATTAGTTGATC-3
LOWER: 5-GGGAATTC TTATTTAACTTCATACCACCAACCTTT-3
以2ul基因组DNA为模板，加入引物各liig，进行PCR扩增，PCR程序如下U)94。C， 5min; (2) 94°C 30sec， 52°C lmin, 72°C lmin， 30循环；(3) 72°C， 7min。将产物进行凝 胶电泳回收，电泳图谱如图l， PlyG基因为702bp。
实施例2、重组表达质粒的构建
用SacI及&oi I酶切PCR产物，与经同样酶切处理的分泌型酵母表达载体pMEX9K (图2) 连接，TSS法转化大肠杆菌DH5a，筛选阳性克隆提取质粒。送Takara公司测序，测序结果表 明该702bp大小的片段为PlyG基因，核苷酸两个位点发生突变，但均为同义突变，氨基酸序列 经比对完全一致，表达载体构建成功，重组质粒命名为pMEXplyG。
实施例3、 PlyG基因在酵母中的高效表达
提取重组质粒pMEXplyG DNA，然后经Sac I酶切使之线性化，分离纯化后用电转化法 转化毕赤酵母GS115。转化后的GS115经MD平板筛选得到HIS+重组克隆，将MD平板上 生长的克隆接种YPD--G418平板，置于3(TC温箱培养。将MD平板与不同G418浓度YPD 平板筛选出的重组克隆分别接种于5ml BMGY中，30°C300r/min培养至ODmo为2.0 6.0; 室温4 000r/min离心4min。收集的菌体用BMMY悬浮并稀释至OD6。。为1.0后，30°C 300r/min 诱导。每1211补加甲醇至0.5%。诱导48h后收集培养上清，SDS-PAGE检测蛋白表达(图3)， 并测定其生物活性。选取培养上清中表达量高的菌株G6作为生产菌株。将G6同时点种于 MD、 MM平板，3(TC培养2 3d，确定菌株的Mut表型为Mut+。
实施例4、三步层析纯化PlyG蛋白
层析纯化方法主要包括离子交换层析、疏水相互作用层析、亲和层析以及凝胶过滤层析 等方法。本发明中，PlyG分泌表达在发酵上清液中，通过离心、过滤等方法除去菌体和大颗 粒杂质；再通过超滤的方法除去小分子的色素和盐，并且浓縮体积，将发酵液调整为合适的 缓冲液，利于下步的层析纯化。
层析纯化的第一步采用阳离子交换介质SP Sepharose XL， SP Sepharose XL介质具有高载 量，快流速和易处理等特点，能快速有效地将plyG从超滤液中捕获。上样结束后，考虑到有利于下面的纯化，采用20 mmol/L PB洗涤SP Sepharose XL层析柱步骤，再用20 mmol/L PB 1 mol/LNaCl洗脱蛋白。
层析第二步通过疏水相互作用介质Phenyl Sepharose除去SP Sepharose XL洗脱蛋白峰中 残留的杂质和色素。用20 mmol/L PB 0.15 mmol/L NaCl 50%乙二醇可以有效从Phenyl Sepharose介质上洗脱目的蛋白。
层析第三步利用凝胶层析Superdex 75除去少量的杂质，并将缓冲液调整为磷酸盐缓冲 液。经过三歩层析纯化后，回收率为46%，原液纯度可达到95%以上(图4)。进行N端氨 基酸序列测定，序列测定结果表明N端氨基酸序列为MEIQK，与天然蛋白一致。
实施例5、 Y噬菌体裂解酶的活性检测
将纯化好的PlyG用Lowry法测蛋白浓度进行定量，并取部分样品进行梯度稀释。无毒炭 疽杆菌A15R用肉汤培养12h左右，制作吸光度标准曲线，测定最适吸收波长为0D6。。。取过夜 培养的无毒炭疽杆菌，离心收集菌体，1 XPBS(pH6)洗后重悬，并用l XPBS(pH6)稀释，等 体积分装，测定其初始0De。。。分别加入不同浓度的酶液，观察其0De。。的下降情况，检测对炭 疽杆菌的裂解情况。酶活性单位定义为以浓度lmg/mL的蛋白为标准，按l :1在同体积的菌 液中加入同体积不同稀释倍数的酶液，37°C，摇床温育20min后，0D,下降至原值-半时的 酶液的稀释倍数。酶的比活性约为1200U/mg。
权利要求
1、一种表达炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶的方法。其特征在于以毕赤酵母作表达系统，将炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶基因插入酵母表达载体，构建成新的表达质粒，经线性化后电转化宿主菌，经过随机挑选和加压筛选，获得生产菌株G6，使γ噬菌体裂解酶在毕赤酵母工程菌Pichia pastoris G6上清中获得表达，且表达产物不含多余氨基酸。
2、 含有权利要求1所述的表达载体、宿主菌、工程菌。
3、 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述真核细胞表达载体为pMEX9K。
4、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述炭疽杆菌Y噬菌体裂解酶基因插入到pMEX9K的Sad和五co及I酶切位点间。
5、 根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述工程菌为巴斯德毕赤酵 母尸/c/z/a戸加r/51 G6。
6、 根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述方法中，所述表达为诱导表达，所用的诱导剂为甲醇，诱导浓度为终体积的0.5%。
7、 根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述工程菌的培养温度为30'C， 诱导温度为28-30°C。
8、 根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述工程菌的诱导时间为48-60h。
全文摘要
本发明公开了一种表达炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶的方法。本发明采用毕赤酵母表达体系，利用已有知识产权的表达载体pMEX9K(ZL02117906.9)，将炭疽杆菌噬菌体基因与pMEX9K连接，构建成新的表达质粒pMEXplyG，经线性化后电转化宿主菌巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris GS115，经过随机挑选和加压筛选，获得生产菌株G6，使γ噬菌体裂解酶在毕赤酵母工程菌Pichia pastoris G6上清中获得表达，且表达产物不含多余氨基酸。经离心、超滤、离子交换层析、疏水层析、凝胶层析获得纯度高于95％的γ噬菌体裂解酶。该酶对炭疽杆菌及萌发时的芽孢有裂解活性，可用于炭疽洗消剂、炭疽治疗药物的开发。
文档编号C12N1/19GK101319195SQ200710105978
公开日2008年12月10日 申请日期2007年6月5日 优先权日2007年6月5日
发明者玲 付, 候利华, 宋小红, 张晓鹏, 曹晓梅, 曼 李, 李建民, 董大勇, 薇 陈 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所;北京爱柯森伦生物工程科技有限公司