专利名称：：一种利用转基因植物修复重金属和有机物复合污染土壤的方法
技术领域：
：本发明涉及生物技术及环境保护领域，特别是将外源基因引入抗复合污染植物及应用于重金属和有机物复合污染土壤修复的方法。二
背景技术：
：随着城镇化、工业化、汽车尾气排放以及农业的集约化发展,环境问题越来越受到人们关注，重金属、有机物引起的土壤污染也日益成为环境、土壤科学家们研究的热点问题。土壤被重金属及有机物污染后，不仅直接影响作物产量和品质,还会通过食物链影响人体健康和安全。利用绿色植物清除污染物的策略，即植物修复技术具有成本低，环境友好和可再利用等特点，是一种非常有前途的环境污染原位治理途径。转基因植物由于具有更好的耐受力和积累量，可以得到更好的土壤修复效果。用转基因植物修复污染土壤，已经成为各国科学家研究的重点之一。转基因植物修复重金属污染在转基因植物修复中，植物鳌合肽技术得到较多应用。美国科学家Bennett等分别比较了表达Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶(ECS)或谷胱苷肽合成酶(GS)或ATP硫酸化酶(APS)基因的印度芥菜对土壤的修复效果，结果表明，表达Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶(ECS)或谷胱苷肽合成酶(GS)的植株，植物鳌合肽和谷胱苷肽的水平增加，对镉的耐受力和积累量也提高。表达ATP硫酸化酶的植株，其谷胱苷肽和硫醇的含量均有所提高。ECS和GS植株茎叶的重金属累积量显著高于野生株，其中镉为1.5倍，锌为1.5—2倍，对于铬、铜、铅，ECS植株的累积量为野生株的2.4_3倍。所有的转基因植株从土壤中清除的重金属量均显著高于野生株，土壤中镉、锌的减少量分别为25%和6%。上述几种转基因植株中，ECS植株的表现最佳。2006年，美国科学家Li等将Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶(ECS)基因在拟南芥中表达，使谷胱甘肽在茎叶和根中的含量较野生株增加了2—5倍，有效提高了植物对砷、汞的耐受力。Po即oni教授等将拟南芥的植物鳌合肽基因在烟草中表达，提高了植株对Cd的耐受性和积累量。2007年，美国学者Banuelos等将半胱氨酸裂合酶(cpSL)和半胱氨酸转甲基酶(SMT)基因分别转入印度芥菜中表达，用转基因植株修复硒污染的土壤。结果，春季种植的转cpSL基因的植株对硒的累积量增加到原来的2倍，与野生型植株相比，叶子中硒浓度提高了1.8倍。转SMT基因的植株叶子中硒浓度比野生型植株提高了1.7倍。秋季种植的转SMT基因的植株对硒的累积量是野生植株的1.6倍，且茎、叶中硒的浓度都较高。这些结果表明，cpSL、SMT的转基因印度芥菜对硒的累积能力显著提高。LeDuc等研究者分别在拟南芥和印度芥末中同时表达ATP硫酸化酶和半胱氨酸甲基转移酶，使植株对硒的积累量提高了4一9倍。2007年，美国的Banuelos等研究者进行了转基因印度芥菜的大田试验，在转基因植株中表达了半胱氨酸裂合酶或半胱氨酸甲基转移酶,结果表明，硒的积累量提高了1.6_2倍。Gasic等将拟南芥的植物鳌合肽基因在印度芥菜中表达，提高了植株对镉的耐受性。除了鳌合肽技术外，其它的转基因植物也用于重金属污染修复。日本科学家YazakiK等异源表达哺乳动物的ABC转运器基因于烟草中，可以同时提高对有机和无机污染物的耐受性，因而，可望用于复合污染的植物修复。但是，ABC表达的不够稳定。Sasaki等在拟南芥中表达细菌汞转运蛋白基因，构建了超级汞积累植株。Kim等在拟雨芥中表达ABC转运器AtPDR8，提高了对镉的耐受力。2006年，美国学者Lindblom等将高亲和的硫酸盐传输子基因在印度芥末中表达，明显提高了植株对fCr，Cd,V和W的耐受力。日本科学家Sasaki等将硫杆菌的汞膜转运蛋白在拟南芥中表达，构建了超级耐汞植物，其汞积累量为野生植物的2倍。2006年，Nagata等将细菌磷酸激酶基因在烟草中表达，提高了植株的汞耐受'吐和积累量。转基因植物修复有机物污染三氯乙烯(TCE)等是污染量较大的有机污染物，特别是对地下水的污染较多。P4502E1酶可以氧化多种污染物，包括三氯乙烯、溴乙烯、氯仿、四氯化碳及氯乙烯等，对多种主要的土壤污染物有效，因此P4502E1(CYB2E1)被认为是增强植物有机污染修复效率的候选基因。美国科学家Doty等(16)将人类细胞色素基因P4502E1转入烟草，用其修复污染土壤。P4502E1转基因烟草对TCE的代谢能力较空白对照株提高达640倍。转基因植株明显增加了对溴乙烯的摄取和脱溴作用。所以，P4502E1植株可用于卤化物污染的植物修复，有效修复卤化物污染。2006年，英国科学家Rylott等在拟南芥中表达降解环三甲撑三硝胺(RDX)的细胞色素P450,提高了其对RDX的耐受力，在含RDX环境中，茎叶及根的生长均优于野生植株。希腊学者Karavangeli等构建转基因烟草，表达玉米的谷胱苷肽转移酶基因，提高了对对氯乙酰苯胺除草剂的降解能力。2006年，复旦大学的廖教授等深入研究了转基因拟南芥对儿茶酚的降解，将细菌氯儿茶酚双加氧酶基因在拟南芥中表达，转基因拟南芥表现出明显高的清除儿茶酚的能力，可以用作芳香污染物的植物修复。同时表达多个基因可产生协同作用InuiH等在马铃薯中表达人类P450基因CYP1A1,CYP2B6，CYP2C9禾tlCYP2C19,结果表明，同时转入CYP1A1，CYP2B6,及CYP2C19基因的植株T1977，表现出对多种除草剂的交叉抵抗力；表达CYP2C19基因的植株2C9-57R2,对磺脲类药物有较强耐受力；表达CYP2C9基因的植株2C19-12R1,对多种除草剂有较强的交叉耐受力。上述结果表明多基因协同作用，提高了转基因马铃薯的修复能力。Kawahigashi等采用质粒pIKBACH，将人类细胞色素P450的基因CYP1A1,CYP2B6，和CYP2C19同时在水稻中表达，大幅度提高了水稻对除草剂莠去津和异丙甲草胺的耐受力，可以对有机污染的土壤进行植物修复。Wawrzynski等将丝氨酸乙酰转移酶基因、Y-谷氨酰半胱氨酸酶基因和植物鳌合肽合成酶基因同时在植物中表达，使镉的积累量提高8倍，而表达单一基因的植株，镉的累积量提高较少。这表明，同时表达多个基因，具有协同作用。美国专利20060150279A1，将鼠李糖基转移酶基因rhlA或rhlB,或2个基因同时表达于烟草中，增加了转基因植株对铜等污染物的耐受力。美国专利20060130173A1,将P型ATPaseZntA基因转入拟南芥，提高了植株对重金属的耐受力。美国专利20060095982Al，在植物中表达植物鳌合肽,提高了植株对污染土壤的修复能力。中国专利CN1594583，将iaaM基因和ACC脱氨基酶基因在矮牵牛或烟草中表达，提高了转基因植物对铜、铅、镉、钴等不同重金属的广谱富积特性和抗性。复合污染修复许多地区存在重金属和有机物的复合污染，复合污染带来更严重的影响，因此修复复合污染的任务更加艰巨。目前的转基因植物，只是转入了针对重金属污染或者有机物污染的相应基因，因此，只能用于单独修复重金属污染或者有机物污染，而不能修复复合污染，因此，将可以修复重金属污染和有机污染的相应基因同时在一个植株中表达，使其同时大幅度提供对重金属和有机污染物的耐受力及累积量，成为修复复合污染土壤的有力工具。
发明内容本发明基于以上背景，在耐复合污染的植物中引入增强植物有机污染修复效率的外源基因和可提高植物对多种金属耐受力和积累量的外源基因，获得一种对重金属和有机物都有较好修复效果的转基因植物，为重金属和有机物复合污染的生物修复提供了一条有效的途径。本发明的目的在于提供一种利用转基因植物修复重金属和有机物复合污染土壤的方法本发明的目的可以通过如下步骤实现1、将外源基因引入抗复合污染植株(1)构建含有可增强植物有机污染修复效率的外源基因和可提高植物对多种金属耐受力和积累量的外源基因的双元表达载体(2)利用电转化方法将所构建的植物双元表达载体转化农杆菌(3)通过农杆菌介导法将外源基因转入抗复合污染植株2、转基因植株的筛选在施加抗生素选择培养基上进行分化培养和诱导生根培养，筛选出抗性再生植株。3、转基因植株的检测分析(1)转基因植株的PCR检测(2)转基因植株的酶切及Southern杂交检测(3)Western印迹法对外源基因的表达产物进行检测4、转基因植株的盆栽及大田种植试验，进行土壤生物修复试验。在有卤代物污染或者是有重金属的土壤上种植转基因植株,定期对植株内的卤代物和重金属的含量进行检测分析，同时对土壤中的重金属含量也进行取样分析，试验分别在花盆和大田中进行。本发明的优点在于-(1)将可增强植物有机污染修复效率的外源基因和可提高植物对多种金属耐受力和积累量的外源基因在植物中协同表达，可进一步提高植物对重金属和有机物的耐受和积累能力。(2)本发明的转基因植物可用于三氯乙烯、二溴乙烷等卤代烃化合物等有机物污染土壤的修复(3)本发明的转基因植物可用于Cd、Cr、Cu、Mn、Zn和Pb等多种重金属污染的土壤的修复；(4)本发明的转基因植物可用于上述重金属和有机物造成的复合污染土壤的修复。下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。具体实施例方式实施例1植物双元表达载体的构建及转化农杆菌将来源于人的细胞色素P4502E1基因和来源于大肠杆菌的Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶(Y-ECS)基因用限制性内切酶BamHl和Sacl酶切后，连接至植物双元转化载体pCAMBIA2301G，获得的重组表达载体命名为pCMBIA2301G-p450-ECS。利用电穿孔法将重组表达载体pCAMBIA2301G-p450-ECS转化根瘤农杆菌菌株LBA4404。实施例2植物转化采用农杆菌介导的叶盘转化法，将重组表达载体pCAMBIA2301G-p450-ECS转入紫花苜蓿叶片中。将过夜培养的带有pCAMBIA2301G-p450-ECS质粒的农杆菌培养液离心，菌体悬浮于10ml0.15mol/L的NaCL中，离心收集菌体，再悬浮于lml20mmol/L的CaCL2溶液悬浮，将紫花苜蓿叶片切成0.5X0.5cm的小块，放入含有pCAMBIA2301G-p450-ECS质粒的菌液中浸泡20min，用滤纸吸干多余的菌液，放在MS培养基上共培养3天，然后再转到含有卡那霉素的筛选培养基(MS+0.5mg/L6-BA十0.5mg/L2,4-D+20mg/LKanamycin+300mg/LCefixime)上进行初步筛选。待芽长至lcm左右，将长芽的叶盘转移到生根培养基(MS+70mg/LKanamycin+300mg/LCefixime)上诱导幼芽生根培养。待根系健壮后，将转化植株移栽到温室内培养，获得紫花苜蓿转化苗。实施例3转基因紫花苜蓿对镉、铅一TCE复合污染土壤的修复实验首先将重金属镉、铅以其无机盐溶液(CdCh5H20、PbCl2,分析纯)的形式均匀施入土壤,对镉、铅和TCE分别设置了高、低两种处理浓度(其中镉为0.5、1.5mg'kg—铅100、300mg'kg—、TCE为IO、100mg'kg—"，采用L^正交设计，并设以下对照(1)种植转基因苜蓿的无污染物土壤(2)种植野生型紫花苜蓿的污染土壤，每个处理设置3个重复。试验采取如下步骤将TCE与试验土壤混合①每一浓度处理都先用适量丙酮溶解试验所需要的TCE,然后分别加入到试验设计所需土壤总量1/10的土壤中，充分搅拌。②步骤①土壤中丙酮挥发干后，再分别加入到试验设计所需土壤总量l/2的土壤中，充分搅拌，放置2d。③向步骤②土壤中加入剩余全部土壤，放置15d,每天混合1次，最后分装到带有底盘的塑料盆中，每盆装2Kg土壤，放置1周后，播入转基因紫花苜蓿种子20粒，发芽后6d定苗，每盆8—10株，日常管理用去离子水维持适宜水分植物中重金属含量:植物样品经干法灰化后，用HC1溶解,火焰原子吸收分光光度计法测定。土壤中重金属有效态含量:以DTPA(二乙三胺五醋酸)提取剂浸提，火焰原子吸收分光光度计法测定。植物中TCE含量将植物样品粉碎后，置液氮中捣碎，采用H2S04—NaCl法进行抽提，GC法测含量。土壤中TCE含量釆集的土壤样品经风干后，采用微波辅助萃取法提取TCE，提取液中的TCE浓度用紫外分光光度法测定。表1盆栽实验中苜蓿中镉含量(rag'kg"<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表2盆栽实验中苜蓿中铅含量(mg'kg—')不同处理转基因苜蓿根系地上部分野生苜蓿根系地上部分CK(铅01(铅1002(铅1003(铅1004(铅1005(铅3006(铅3007(铅3008(铅300TCE0TCE10TCE10TCE100TCE100TCE10TCE10TCE100TCE100镉0)镉O.5)镉1.5)镉0.5)镉1.5)镉0.5)镉1.5)镉O.5)镉1.5)0.0067.2859.7868.2561.86181.59179.52175.23167.610.007.506.667.616.9020.2420.0119.5418.690.0046.9741.7347.6543.18126.77125.32122.33117.010.006.735.986.836.1918.1717.9617.5316.77表3盆栽实验中苜蓿中TCE含量(mg'kg—不同处理转基因苜蓿野生苜蓿根系地上部分根系地上部分CK(铅0TCE0镉0)0.000.000.000.00I(铅IOOTCE10镉O.5)5.990.663.460.452(铅100TCE10镉1.5)5.460.603.160.413(铅100TCE100镉0.5)53.215.9030.804.034(铅100TCE100镉1.5)50.745.6229.373.845(铅300TCE10镉O.5)5.010.562.900.386(铅300TCE10镉1.5)4.780.532.770.367(铅300TCE100镉O.5)45.895.0926.573,478(铅300TCE100镉1.5)44.734.9625.893.39权利要求1.一种利用转基因植物修复重金属和有机物复合污染土壤的方法，其特征在于将可增强植物有机污染修复效率的外源基因和可提高植物对多种金属耐受力和积累量的外源基因引入植物，获得可修复重金属和有机物复合污染土壤的转基因植物，在污染土壤中种植转基因植物，修复被污染土壤。2.按照权利要求1所述的一种利用转基因植物修复重金属和有机物复合污染土壤的方法，其特征在于可增强植物有机污染修复效率的外源基因为以下基因之一来源于哺乳动物的金属硫蛋白(MT)基因、来源于高等植物的类MT基因或者来源于哺乳动物的细胞色素P4502E1基因。3.按照权利要求1所述的一种利用转基因植物修复重金属和有机物复合污染土壤的方法，其特征在于可提高植物对多种金属耐受力和积累量的外源基因为以下基因之一ACC脱氨基酶基因、Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因(Y-ECS)或者CAX-2基因。4.按照权利要求1所述的一种利用转基因植物修复重金属和有机物复合污染土壤的方法，其特征在于所述的植物为以下植物中的一种白杨树、烟草、花椰菜、苜蓿、印度芥菜。全文摘要本发明公开了一种利用转基因植物修复重金属和有机物复合污染土壤的方法。其技术特征在于将可增强植物有机污染修复效率的外源基因和可提高植物对多种金属耐受力和积累量的外源基因引入植物，构建一种对重金属和有机物污染都有较好修复作用的转基因植物。本发明对于以下三种类型的污染土壤都有较好的修复作用(1)有机污染物如三氯乙烯、二溴乙烷等卤代烃化合物污染土壤；(2)多种重金属如Cd、Cr、Cu、Mn、Zn及Pb等污染的土壤；(3)重金属和有机物造成的复合污染土壤。其过程包括转基因植物的构建，阳性植株的筛选及培养，用转基因植物进行污染土壤的修复。本发明在重金属和有机物复合污染的土壤修复中具有广阔的应用前景。文档编号C12N15/29GK101310882SQ200710107688公开日2008年11月26日申请日期2007年5月25日优先权日2007年5月25日公开号200710107688.发明者刘均洪,初立业,吴汝林,张媛媛,李俊峰,李凤梅,王繁业,苏忠亮,邵宏波,郑成超申请人:青岛科技大学被以下专利引用(2),