专利名称：一种快速建立悬浮、高密度工程细胞株的方法
技术领域：
本发明涉及细胞生物学领域，其技术属于细胞生物学的相关实验方法与 技术，特别是一类贴壁低密度有血清细胞株的改良。
背景技术：
生物制药包括疫苗、基因工程药物、基因治疗药物、抗体药物、蛋白 药物以及动物疫苗等生物制品，其中很大部分品种采用细胞技术生产，且 发展趋势是利用细胞表达、分泌的生物制品越来越多。在我国，疫苗(包 括人用和动物疫苗)的生产主要采用贴壁细胞转瓶培养的生产方式，如培 养Vero细胞用于狂犬、乙脑、出血热、甲肝疫苗的生产等，培养地鼠肾细 胞用于狂犬、乙脑疫苗的生产等，培养BHK21细胞用于口蹄疫疫苗的生产， 培养CHO细胞用于乙肝疫苗的生产，培养2BS细胞、KMB17细胞用于甲 肝疫苗的生产，培养2BS细胞、MRC5细胞用于水痘疫苗的生产，通过大 规模体外培养技术培养哺乳类动物细胞是生产生物制品的有效方法。
由于细胞的生长需在有血清的环境中，这样就使大多数细胞生长的状 态多为贴壁状态，在培养细胞时由于表面积有限，造成细胞的的密度低， 产量低，因此在进行细胞改良的过程成中，首要的问题是使细胞适应无血 清的状态。
动物细胞是一种无细胞壁的真核细胞，生长缓慢，对培养环境十分敏 感。细胞的生长需要一定的营养环境，用于维持细胞生长的营养基质称为 培养基，即指所有用于各种目的的体外培养、保存细胞用的物质，就其本 意上讲为人工模拟体内生长的营养环境，使细胞在此环境中有生长和繁殖 的能力。它是提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。细胞培养基 其组成成分主要有水、氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子及其他 一些核酸降解物、激素等。许多人用和兽用的重要蛋白质药物和疫苗，尤 其是那些相对较大、较复杂或糖基化的蛋白质来说，动物细胞培养是首选 的生产方式。无血清悬浮培养是用己知人源或动物来源的蛋白或激素代替动物血清 的一种细胞培养方式，它能减少后期纯化工作，提高产品质量，正逐渐成 为动物细胞大规模培养的研究新方向。
使用无血清培养基的优点
1、 增加确定性无血清中未知成分等干扰因素。
2、 生物安全性高可避免动物血清中存在的潜在病原体污染。
3、 性能更加一致无批次间质量差异。
4、 容易进行纯化和下游加工无动物来源蛋白成分等干扰因素。
发明内容
一种快速建立悬浮、高密度工程细胞株的方法，通过对原细胞株进行 悬浮状态适应的驯化，获得了适应无血清、悬浮、高密度状态的细胞株， 在细胞处理上是一种新的方法和应用。
具体实施例方式
分几步把细胞从添加血清的培养基转换到无血清培养基中，这种处理 方法对于细胞比较温和。 1、适应方瓶中的无血清状态
1) 以2倍正常接种密度接种生长活跃的细胞培养物到75%有血清培养基 25%混合培养基中，传代培养。
2) 当细胞密度5xl()S细胞/ml时，以3xl()S细胞/ml细胞密度，在有血清培 养基无血清培养基为50 : 50的混合培养基中传代培养。
3) 达到3xl()S细胞/ml细胞密度时，25%有血清培养基和75%无血清培养 基中传代培养。
4) 当细胞密度达到3xl()S细胞/ml (接种后5天)，在100%无血清培养基 中传代培养。
5) 每隔3天，当细胞密度达到3xl(^细胞/ml，细胞活率在90%时，冻存
部分细胞株。
细胞培养适应替代血清许多细胞利用连续适应方法能很好的适应，
用包含fbs的的培养基和包含有替代血清的培养基i : i (v : v)的混合培
养基培养细胞。通过下列的混合培养基的方式，连续几代减少当前培养基的量i : 2， i : 4， i : 16和100%替代培养基。每次适应改变血清比例时，
传代细胞2到3次。培养可以直接从FBS转换到替代血清。 一开始就使用 相同于FBS的浓度的替代物或血清，生长的延迟可能会发生，允许进行3 次的传代，使生长率恢复到以前的水平。
2、以较高的密度转至摇瓶，用无血清培养基培养，在摇瓶中适应4代以上， 使其适应摇瓶中无血清、悬浮的细胞株，细胞活率在90%时，冻存部分细 胞株。
实例说明
本研究对CHO细胞进行了驯化，原CHO为贴壁生长状态，在含有10% 胎牛血清的培养基中生长，以下为驯化的具体步骤-
1、 适应方瓶中的无血清状态
1) 以2倍正常接种密度接种到75%有血清培养基25%混合培养基中，传
代培养3次。
2) 当细胞密度5xl()S细胞/ml时，以3xl()S细胞/ml细胞密度，在50%有血
清培养基50%无血清培养基中传代培养3次。
3) 达到3xl(^细胞/ml细胞密度时，25%有血清培养基和75%无血清培养 基中传代培养3次。
4) 当细胞密度达到3xl()S细胞/ml (接种后5天)，在100%无血清培养基 中传代培养3次。
5) 每隔3天，当细胞密度达到3xl()S细胞/ml，细胞活率在90%时，冻存 部分细胞株。
2、 以较高的密度转至摇瓶，用无血清培养基培养，在摇瓶中适应4代以上， 使其适应摇瓶中无血清、悬浮的细胞株，细胞活率在90%时，冻存部分细 胞株。
至此，获得了无血清、悬浮的CHO细胞株。
以驯化后的细胞进行转染率的检测，通过免疫组化的方法测得转染效率 在40%以上，通过ELISA的方法进行检测，目的蛋白的产量达到较高的水平。
用同样的方法对Vero细胞进行驯化，获得了无血清悬浮的Vero细胞株。
权利要求
1、一种快速建立无血清、悬浮、高密度工程细胞株的方法。
2、 如权利要求1所述的方法可用于驯化CHO细胞株。
3、 如权利要求1所述的方法可用于驯化Vero细胞株。
4、 如权利要求1所述的方法可用于驯化BHK21细胞株。
5、 利用权利1所述的方法可用于驯化一类有重要意义的工程细胞株。
全文摘要
一种快速建立悬浮、高密度工程细胞株的方法，原细胞株为贴壁、低密度状态，适应在有血清培养基的环境中生长，通过对原细胞株进行悬浮状态适应的驯化先接入方瓶，更换培养基，当细胞生长至对数期时进行传代，连续传代使其适应在方瓶中的新环境，转至摇瓶，连续传代使之逐步适应摇瓶中的悬浮状态，获得了适应无血清、悬浮、高密度状态的细胞株。
文档编号C12N5/06GK101302492SQ20071010711
公开日2008年11月12日 申请日期2007年5月8日 优先权日2007年5月8日
发明者丹 散, 李荣皓, 颖 王, 磊 石, 峰 高, 黎志良 申请人:中美奥达生物技术(北京)有限公司;北京涌泉万方生物技术有限公司