专利名称：高效表达重组蛋白的宿主cho细胞株的制作方法
技术领域：
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本发明涉及细胞生物学领域，其技术属于细胞生物学的相关实验方法与 技术，特别是一种适应无血清、悬浮、高密度状态的CHO细胞株。
技术背景-
CHO细胞是实验中非常常用的一个细胞株，是一个得到广泛应用的真 核基因表达宿主，在生物制药中使用也非常广泛，该细胞株培养条件简单， 贴壁强度适中，比较容易转染。CHO是T. T. Puck在1957年从一只成年 中国仓鼠卵巢获得的。用于培养CHO细胞的培养基为完全培养基Ham's F12培养基，其中添加2Mm的谷氨酰胺、1.5g/L的碳酸氢钠，10%的胎牛 血清。
CHO细胞可以对真核基因产物进行一系列的翻译后修饰，使其获得生 物活性。目前许多真核细胞表达的基因药物是用CHO细胞生产的。CHO 细胞的规模化培养技术已经形成固定的操作规范，如果在项目的研发阶段 采用CHO细胞作为表达宿主，可以为以后的工厂化生产提供有利条件。 宿主CHO细胞的应用
由于动物细胞培养技术的复杂性，目前我国批准上市的哺乳动物细胞 尤其是CHO细胞表达的产品很少，只有促红细胞生成素(EPO)、 CHO基因 工程乙肝疫苗、以及最近批准上市的治疗性抗体药物益赛普(有效成分相当 于美国食品药品管理局批准的Enbrel)和泰欣生(有效成分相当于美国食品 药品管理局批准的Erbitux)等少数几种生物技术药物。北京大学血研所教 授王德炳血小板生成素(TPO) CHO细胞中成功表达具有活性的基因重组 人TPO;筛选获得稳定产生抗TPO单克隆抗体的细胞株。TPO基因治疗 适用于恶性肿瘤、白血病化疗后因血小板减少症需要重建造血功能的病人， 使用后无血液制品导致的合并症，在将来过渡到临床后可提高癌症病人对 化疗的耐受性，提高治愈率，延长病人的生存期。
用于生物制药的工程细胞在体外培养时，多数呈贴壁生长或兼性贴壁 生长；而当其在无血清、无蛋白培养基中生长时，由于缺乏血清中的各种粘附贴壁因子如纤粘连蛋白、层粘连蛋白、胶原、玻表粘连蛋白，细胞往 往以悬浮形式生长。悬浮培养是目前大规模培养的趋势，具有操作简单， 易放大规模等优点。
由于传统的含有血清的细胞培养会给生产及科研带来许多不利因素。 自50年代起人们开始无血清培养基的研究，至今已经过三代。第一代虽然 不含有血清，但含有大量的动物或植物蛋白，不利于目标蛋白的分离纯化， 降低了回收率，增加了成本；第二代、第三代，完全不用动物来源蛋白或 者含量极低，是目前市面上市的主要基因工程产品,但是仅限于几株细胞 系，尚未应用到疫苗生产中；培养基中无血清、无蛋白，适合多种不同细 胞生长并可高温消毒，是第四代无血清细胞培养的发展趋势，目前引进了 学界和产业界共同关注。
开发适于各种CHO工程细胞的无血清培养基生产不同的重组蛋白国 外已有学者进行了相关研究。早期常用的CHO细胞的无血清培养基为 DMEM/F12，目前国外许多厂家都在开发适用于CHO细胞高密度生产及高 水平目的产物表达的无血清培养基，国内的一些单位在DMEM/F12培养的 基础上进行优化，取得了进展。另有研究表明在培养基中添加成分如丁酸 钠等对促进细胞生长的影响显著。CHO细胞传统培养的方法是贴壁培养， 但贴壁介质(如微载体)具有成本高和由于流体力学效应和细胞生长的限 制而难以实现长期连续高密度培养等缺点。
在经历了天然培养基、合成培养基后，无血清培养基和无血清培养成 为当今细胞培养领域的一大趋势。采用无血清培养可降低生产成本，简化 分离纯化步骤，避免病毒污染造成的危害。因此利用本研究所获得的悬浮、 无血清、高密度宿主细胞株进行蛋白类药物的生产，在安全性，产物的表 达量，提纯工艺的简单化及节约成本等方面都具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述背景技术存在的不足，建立悬浮、无血
清、高密度的CHO细胞系。
本发明的目的按下述方案实现更换几种无血清培养基，使CHO细胞
逐步适应无血清的生长环境、高密度的生长环境；使细胞在方瓶及摇瓶中适应悬浮的生长状态，从而建立了建立悬浮、无血清、高密度的CHO细胞株。
其继代培养方法
1. 倒掉原瓶中的培养基。
2. 用0. 25。/。(w/v)胰酶-0. 53 mM EDTA液体洗涤，以去除血清(血清会抑制 胰酶的活性)。
3. 将3.0ml带有胰酶的EDTA溶液添加到细胞瓶中，在细胞从贴壁状态消 化下来，并开始处于分散状态下，于倒置显微镜观察细胞。
注意为了避免细胞聚集在一起不能摇动细胞液，且细胞在37'C下很难分 散。
4. 添加6.0ml的完全培养基并轻轻吸取至细胞瓶中。
5. 添加适当的细胞悬液到新的细胞瓶中。
6. 在5%0)2、 37'C下孵箱中培养。
接种比率按l: 6接种，传代期间培养液更换2次。
冻存培养基:为95%的完全培养基；5%DMS0，冻存于液氮中。
具体实施例方式
一无血清、高密度、悬浮CHO细胞系的建立
1. 先接入方瓶，更换无血清培养基。
2. 当细胞生长至对数期时进行传代。
3. 连续传代使其适应在方瓶中的无血清状态。
4. 转至摇瓶。
5. 连续传代使之逐步适应摇瓶中的无血清、悬浮状态。 二制备主细胞库
1.细胞在方瓶中适应无血清的状态下，对细胞进行计数，冻存密 度为5xl()S个活细胞/ml， -80匸过夜，然后转至液氮保存。
2. 细胞在摇瓶中适应无血清的状态下，冻存细胞，与方瓶冻存条件一致。
3. 细胞在摇瓶中适应无血清、悬浮状态下冻存细胞，与方瓶冻存条 件一致。
权利要求
1、一种适应无血清、悬浮、高密度状态的宿主CHO细胞株。
2、 如权利要求1所述的宿主CHO细胞细胞可用于生产抗乙肝病毒 (HBV)的抗原。
3、 如权利要求1所述的宿主CHO细胞细胞可用于表达人红细胞 (erythropoietin ， EPO)。
4、 如权利要求1所述的宿主CHO细胞细胞可用于外源性TPA基因的表达。
5、 利用权利l所述细胞株用于各类基因工程蛋白的表达。
6、 利用权利l所述细胞株用于生物技术药物的生产。
全文摘要
本发明是一种细胞株。原宿主CHO细胞株为贴壁、低密度状态，所用培养基含10％的胎牛血清，通过对原宿主细胞株进行更换培养基，悬浮状态适应的驯化，获得了一种适应无血清、悬浮、高密度状态的宿主CHO细胞株，可用于各类重组蛋白的表达。
文档编号C12N5/06GK101302493SQ20071010711
公开日2008年11月12日 申请日期2007年5月8日 优先权日2007年5月8日
发明者刘逸人, 唐文英, 丹 散, 李荣皓, 颖 王, 峰 高, 黎志良 申请人:中美奥达生物技术(北京)有限公司;北京涌泉万方生物技术有限公司