专利名称：长穗偃麦草在创制低乳糜泻抗原编码dna小麦中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及长穗偃麦草的应用，尤其涉及长穗偃麦草在创制低乳糜泻抗原编码DNA 小麦中的应用。
背景技术：
乳糜泻(celiac disease,简称CD)是遗传易感者摄入麸质后，由免疫系统介导的以 乳糜样腹泻为主的全身性疾病。本病在欧美发病率较高,非洲最低。麸质食物是乳糜泻 的致病因素，另外个体的遗传易感性、免疫反应和环境因素等影响该病与并发症的发生。 麸质中麦醇溶蛋白(a-， |3-， Y-， ^-)是主要的致病性植物蛋白抗原，尤以a-醇
溶蛋白对小肠粘膜具有毒性。研究表明在a-醇溶蛋白中含有四种乳糜泻抗原，分别 为glia-a (QGSFQPSQQ) ， glia-a2 (PQPQLPYPQ) ， glia-a9 (PFPQPQLPY) , glia-a20 (FRPQQPYPQ) (Herpen et al, 2006)。正常人小肠粘膜细胞内有多肽分解酶，可将醇 溶蛋白分解为小分子的无毒物质，而易感者肠粘膜缺少醇溶蛋白分解酶，影响机体免疫 功能，对醇溶蛋白产生过敏反应。乳糜泻的发病与位于6号染色体的主要组织相容性复 合体(HLA)II型D区基因异常所形成的HLA-DQ2和HLA-叫8密切相关。研究表明，含有 HLA-DQ2和HLA-DQ8编码基因者患CD的概率为2 3。/。，高于一般人群(1%)。乳糜泻是终身 性疾病，治疗时以无麦醇溶蛋白食品为食是最基本的、必需的(Wang et al， 2007)。 小麦是世界上除了水稻外最为重要的粮食作物，可以加工成许多种食品，如馒头、 面条、面包饼干、糕点等(Shewry et al， 2003)。小麦不仅供给人们热量，而且也是 蛋白质的重要来源。而在蛋白质中，a-醇溶蛋白占总蛋白量的15-30%，由于现有小麦 品种中多数含有乳糜泻抗原，因而进行低或无乳糜泻抗原小麦育种十分必要。在小麦的 近缘材料中，如不同倍性的祖先种中，均有大量的抗原编码基因的存在(Herpenetal， 2006)。
发明人的早期实验中，发现与小麦远缘的禾草二、十倍体长穗偃麦草中编码四种抗 原的基因数和拷贝数均很低，有望作为有益的基因供体进行远缘育种工作，进而培育出 低或无乳糜泻抗原小麦。长穗偃麦草G^r邵/ro/2 eAw卵t哪)，由于具有蛋白质含量高 和抗逆性强的优点，已经成为小麦育种中十分重要的野生资源之一(Xia et al， 2003)。
远缘有性杂交可以实现供体遗传物质的转移，但是由于远缘杂交存在后代不育等缺 点限制了该方法的使用。体细胞杂交技术可以有效地克服基因组杂交的限制，而紫外线 照射可以提高外源基因组转移的效率和提高育性(Xia et al， 2003)。这两个技术的结 合就是现在常用的不对称体细胞杂交技术。
基因组原位杂交(GISH)分析表明，长穗偃麦草染色体小片段渐渗到小麦基因组并 且在后代稳定遗传(Wang et al, 2005);通过蛋白电泳、基因克隆与序列分析表明体细 胞杂交获得的普通小麦与长穗偃麦草后代株系中，出现了不同于双亲的优质匿W-GS基 因及组合如类似小麦的1Dx5+lDy10, 1Bxl3+lBy16 (Liu et al' 2006; Liu et al， 2007)。
总之，利用体细胞杂交技术接合紫外线照射供体基因组可以有效地转移外源遗传物 质进入小麦基因组，进而获得大量遗传稳定的小麦与长穗偃麦草的体细胞杂种植株，为 实现培育低或无乳糜泻抗原结合面粉品质优良的小麦奠定了技术基础。
发明内容
针对现有小麦含有大量乳糜泻抗原的问题，本发明的目的是提供一种长穗偃麦草的 新应用，即长穗偃麦草在创制低乳糜泻抗原编码DNA小麦中的应用。
本发明所述长穗偃麦草在创制低乳糜泻抗原小麦的应用通过下列歩骤实现1)低 乳糜泻抗原编码DNA的小麦远缘禾草长穂偃麦草的鉴定；2)不对称体细胞杂交转移长 穗偃麦草遗传物质到受体小麦；3)低乳糜泻抗原编码DNA小麦体细胞杂种的筛选。
步骤l)低乳糜泻抗原编码DNA的小麦远缘禾草的鉴定利用同源序列法筛选供体 材料，获得低乳糜泻抗原编码DNA的小麦远缘禾草二、十倍体长穗偃麦草。
步骤2)包括双亲胚性细胞的获得受体材料为小麦，供体材料为二、十倍体长穗 偃麦草等含低乳糜泻抗原的远缘禾草，受体、供体的幼胚在MS培养基上诱导愈伤组织， 经继代培养后，选取胚性愈伤组织作为受体；受、供体原生质体的收集取继代2-5天 的材料，切碎，利用酶解技术，即在25'C下，游离3-5小时，用300-500目不锈钢网过 滤，500-800 rpm离心5min，收集原生质体；供体原生质体的UV处理将收集的供体 原生质体，经洗液冲洗后，调密度为1Xl(T7mL，之后铺于直径为3.5 cm的培养皿低 部成一均匀薄层，敞开盖后紫外线照射，强度和时间为380iMv/cm2， 1-2 min;双亲原 生质体的杂交将供体与受体按照1 : 2的体积比混合，用PEG法诱导，具体步骤如下 (1)向直径为.5cm的培养皿滴加0.2ral混合双亲原生质体成一均匀薄层，静置20-30 min; (2)沿原生质体周围小心滴加0. 2 mlPEG溶液，静置15-20 min; (3)在原生质 周围滴加0.275 M硝酸钙，调p^7.0,抽滤火齒，0. 4ml，静置15-20 min; (4)小心 吸掉皿巾液体，间隔10 min，洗液小心冲洗2次；(5) 5_10 min后用Ps培养基洗1次 后，在P5培养基中于25'C避光培养；杂种愈伤组织的培养与植株再生待再生的愈伤 组织至1. 5-2 mm时，移到增殖培养基上增殖和分化培养基上分化幼苗，待幼苗长到5 cm 时，在壮苗培养基上长出一片新叶后，经不同湿度、有菌等炼苗后栽到大盆屮。
歩骤3)低乳糜泻抗原编码DNA小麦体细胞杂种的筛选利用同源序列法筛选再生 材料，获得低乳糜泻抗原编码DNA的小麦体细胞杂种株系。 其中
酶液成分1. 5% cellulase (ONozuka RS, 0 . 3% Pcctolyase Y-23' 5 mM MES， 0. 6 M 甘露醇，5 mM CaGl2pH=5. 8;
洗液成分0. 6 M甘露醇，5 mM CaCl2pH=5.8;
PEG溶液配方2 g葡萄糖，1.5 g硝酸钙，40 g PEG ,。，溶于IOO ml无离子水中， 调pH二7.0，抽滤灭菌；
PJ咅养基MS培养基大量和微量元素+B5维生素+500 mg/L水解酪蛋白+2 mg/L甘 氨酸-146 mg/L谷氨酰氨+90 g/L葡萄糖+975 mg/L MES， pH=5. 8;
MS培养基MS培养基大量和微量元素+2 mg./L甘氨酸+30 g/L蔗糖+6. 2 g/L琼脂 粉，pH二5.8;
MS继代培养基:MS培养基+1 mg/L 2， 4-D+0. 5 mg/L玉米素； MS诱导分化培养基:1^培养基+ 0-0.5 mg/L 2, 4-D+0. ;1 rag/L玉米素； MS壮苗培养基:^^培养基+ 0.5 mg/L NAA+1-3 mg/L多效唑。 本发明获得低乳糜泻抗原编码DNA小麦体细胞杂种可以用于低乳糜泻抗原小麦的育 种工作，从而为解决该类病人治疗期间的食品问题奠定基础。
图1 二、十倍体长穗偃麦草中a-醇溶蛋白基因的PCR扩增。
其中M:分子量标准(ADNA/&0RI+//2'/3dIII); 1， 二倍体长穗偃麦草；2，十倍
体长穗偃麦草。
图2体细胞杂种11-12和双亲小麦济南177与长穗偃麦草中a-醇溶蛋白基因 的PCR扩增。
其中M:分了'量标准(人DNA/fcoR I+ffi/7d III);1,体细胞杂种I1-12; 2,济 南177; 3,十倍体长穗偃麦草。
具体实施例方式
实施例1利用同源序列法筛选低乳糜泻抗原编码DNA的小麦远缘未草
取长穗偃麦草的幼叶，利用CTAB的方法提取DNA，引物为P1: 5' - ATG AAG ACC TTT CTC ATC CT - 3' ， P2: 5' - TCA GTT AGT ACC GAA GAT GCC -3' ， PCR的反应的的 酶为LATaq (TaKaRa);循环条件初始变性94。C/3 min，之后30个循环(变性94。C/40 s,退火55。C/1 min，延伸72。C/2 m丄n )，终延伸72。C/ 10 niin， PCR结果见图1。
PCR产物在2.0X琼脂糖凝胶上进行电泳并回收(TIANGEN DNA回收试剂盒)。将PCR 回收产物连到pMD18-T载体上，然后转化￡ coW DH10B感受态细胞。克隆转化方法参照 分子克隆实验指南(Sambrook et al， 1989)，鉴定出的阳性克隆进行双向两次测序， 十倍体长穗偃麦草a-醇溶蛋白基因的序列号为EU018300-EU018335; 二倍体长穗偃麦 草a-醇溶蛋白基因的序列号为EU018207-EU018267。筛选的四种在a-醇溶蛋白编码 基因中的乳糜泻抗原总结情况见表l 。
表l小麦济南177、 一、十倍体长穗偃麦草和休细胞杂种I1-12中四种乳糜泻抗原编 码DNA在a-醇溶蛋白编码基因中的分布
可表达基因glia墨ctglia-a2Glia-a9glia-a20基因数总计
济南17755959
十倍体长穗50005
偃麦草
二倍体长穗00005
偃麦草
杂种11-1235558
假基因glia-aglia-a2glia-tx9glia-a20基因数总计
济南17778101123
十倍体长穗1400031
偃麦草
二倍体长穗100056
偃麦草
杂种U-12356519
实施例2利用不对称体细胞杂交获得小麦体细胞杂种
1)双亲胚性细胞的获得受体材料为小麦，供体材料为二、十倍体长穗偃麦草等 含低乳糜泻抗原的远缘禾草，受体、供体的幼胚在MS培养基上诱导愈伤组织，经继代
培养后，选取胚性愈伤组织作为受体。
2) 受、供体原生质体的收集取继代2-5天的材料，切碎，利用酶解技术，即在 25。C下，游离3-5小时，用300-500目不锈钢网过滤，500 rpm离心5min，收集原生质 体。
3) 供体原生质体的UV处理将收集的供体原生质体，经洗液冲洗后，调密度为l X105—7mL,之后铺于直径为3.5cm的培养皿低部成一均匀薄层，敞开盖后紫外线照射， 强度和时间为380u w/cm2， 2 min。
4) 双亲原生质体的杂交将供体与受体按照l: 2的体积比混合，用PEG法诱导， 具体歩骤如下(1)向直径为.5 cm的培养皿滴加0. 2 ml混合双亲原生质体成一均匀薄 层，静置20-30 rain; (2)沿原生质体周围小心滴加0. 2 mlPEG溶液，静置15-20 min;
(3) 在原生质周围滴加0. 275 M硝酸钙(调pH=7. 0，抽滤灭菌)0. 4 ml，静置15-20 min;
(4) 小心吸掉皿中液体，间隔10min，洗液小心冲洗2次；(5) 5-10 min后用Ps培养 基洗1次后，在Ps培养基中于25'C避光培养。
5) 杂种愈伤组织的培养与植株再生待再生的愈伤组织至1.5-2 mm时，移到增殖 培养基上增殖和分化培养基上分化幼苗，待幼苗长到5 cm时，在壮苗培养基上长出一 片新叶后，经不同湿度、有菌等炼苗后栽到大盆中。
6) 杂种植株的鉴定由于所使用的受体亲本小麦济南177经培养证明已经无法再生 植株，而供体长穗偃麦草由于紫外线的照射基因组受到破坏也无法再生，根据体细胞杂 交再生互补理论，能够再生植株的是体细胞杂种。
其中
酶液成分1. 5% cellulase (ONozuka RS， 0 . 3% Pectolyase Y-23， 5 mM MES， 0. 6 M 甘露醇，5 mM CaCl2pH=5. 8;
洗液成分0. 6 M甘露醇，5 mM CaCl2pH=5. 8;
PEG溶液配方:2 g葡萄糖，1.5 g硝酸钙，40 g PEG固"溶于IOO ml无离子水中， 调pH二7.0，抽滤灭菌；
P5培养基MS培养基大量和微量元素+B5维生素+500 mg/L水解酪蛋白+2 mg/L甘 氨酸+146 rag/L谷氨酰氨+90 g/L葡萄糖+975 mg/L MES， pH=5. 8;
MS培养基MS培养基大量和微量元素+2 mg/L甘氨酸+30 g/L蔗糖+6. 2 g/L琼脂 粉，pH:5.8;
MS继代培养基MS培养基+1 mg/L 2, 4-D+0. 5 mg/L玉米素； MS诱导分化培养基MS培养基+0.5 mg/L玉米素； MS壮苗培养基^^培养基+ 0.5 mg/L NAA+3 mg/L多效唑。 实施例3低乳糜泻抗原编码DNA小麦体细胞杂种的筛选
实施的方法同实施例l中的步骤与方法。
杂种I1-12 (EU018336-EU018362)与亲本小麦(济南177) (EU018268-EU018299)、 十倍体长穗偃麦草a-醇溶蛋白编码基因(EU018300-EU018335)中四种乳糜泻抗原编 码DNA的比较见表1。
权利要求
1.长穗偃麦草在创制低乳糜泻抗原编码DNA小麦中的应用。
2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述长穗偃麦草是低乳糜泻抗原编码DNA 的小麦远缘禾草二倍或十倍体长穗偃麦草。
全文摘要
本发明公开了一种利用长穗偃麦草创制低乳糜泻抗原(celiac disease epitope)编码DNA小麦的应用。该应用利用同源序列法筛选出低乳糜泻抗原编码DNA的小麦远缘禾草长穗偃麦草；之后利用体细胞杂交技术将远源禾草部分基因组或DNA转入小麦中，最后利用同源序列法筛选低乳糜泻抗原编码DNA小麦体细胞杂种。本发明获得低乳糜泻抗原编码DNA小麦体细胞杂种可以用于低乳糜泻抗原小麦的育种工作，为解决乳糜泻类病人治疗期间的食品问题奠定基础。
文档编号C12N15/05GK101173267SQ200710113909
公开日2008年5月7日 申请日期2007年10月17日 优先权日2007年10月17日
发明者夏光敏, 张尚立, 峰 赵, 陈凡国, 陈梦竹 申请人:山东大学