一种昆虫表皮细胞系及其构建方法与应用的制作方法

专利名称：一种昆虫表皮细胞系及其构建方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种利用昆虫的表皮组织构建的昆虫表皮细胞系及其构建方法与应用，属于 昆虫细胞培养技术。
背景技术：
自上世纪六十年代无脊椎动物体外培养技术建立以来，目前己从IOO多种昆虫中建立了 500多种细胞系，如草地贪夜蛾卵巢细胞系IPLB-Sf21-AE及其克隆株Sf9(Vaughn ef a/.， 1977)、 粉纹夜蛾Tn-5Bl-4细胞系、家蚕BmN细胞系、美洲棉铃虫HzAMl卵巢细胞系等，这些昆 虫细胞系在重组蛋白表达研究、杆状病毒杀虫剂的扩增、细胞凋亡诱导及机制研究、激素或 其类似物调控细胞的基因表达等生产和研究中起了和起着重要的作用。但这些昆虫细胞系的 来源组织主要为卵巢、精巢、胚胎、成虫盘、血细胞、中肠、脂肪体等，而利用神经组织、 表皮组织、内分泌系统和肌肉组织等构建的细胞系则极少或没有报道，究其原因，主要是与 这些组织的细胞分化程度高有关，它们对体外培养的条件要求苛刻，其中原代细胞培养液的 成分不充分是造成细胞难以成活的重要因素，组织的取材部位及取材时间不合适也是造成原 代细胞培养难以成活的一个重要因素。
昆虫在生长发育过程中要经历多次蜕皮，掌握其蜕皮机制对控制昆虫的生长有重要作用； 昆虫的蜕皮过程是由蜕皮激素和保幼激素共同调控引起的一系列蜕皮相关基因的级联表达， 最终引起效应器官——表皮的规律性变化，表现为旧表皮的溶离和新表皮的生成；体内错综 复杂的因素使得研究复杂化，结果也受多种因素的干扰，致使许多机制至今未能阐明，如果 能在体外建立表皮细胞系，就可以获得纯的均一的表皮细胞，避开体内复杂因素的影响，便 于施加实验因素进行研究、获得单个细胞的活体观测结果进而进行多种生物学研究。

发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明提供了一种昆虫表皮细胞系及其构建方法，以及其在 生物学研究中的应用。
一种昆虫表皮细胞系的构建方法，包括以下步骤-(1)配制细胞培养液配制昆虫细胞培养基(按商品说明)，抽滤，分装，保存；用时加入 0.1 2g/L的L-谷氨酰胺，占总体积10 30%的动物血清，50 200IU/mL的生长因子， 或再添加o.l 7 g/L的水解乳蛋白，0.1 7g/L的酵母提取物，1 400 IU/mL的庆大霉素 或青霉素或链霉素；
(2) 原代培养选取进入蜕皮周期的昆虫幼虫，冰浴至昏迷，70 75%酒精消毒体表，无菌
解剖，取虫体体壁背腹表皮，用解剖器械分离剔除其上连带的脂肪体和气管，用细胞培 养液漂洗后，刮取新鲜表皮层，剪切为细小组织块，将其移至细胞培养瓶或培养板，涂
布均匀，25 29'C下恒温静置培养使其贴壁，每日观察细胞生长状态，12 30小时后补 加l 2mL细胞培养液，9 11d后再补加l 2mL细胞培养液，以后根据组织块贴壁及 细胞生长状态每隔14 16d更换1/4 3/4体积的细胞培养液；
(3) 传代培养原代培养细胞开始增殖后，细胞数目增多，细胞生长密度较大时，用吸管轻
轻吸打的方法或拍击瓶壁的方法或酶消化传代法悬起细胞以1: 2 3进行稀释传代；以
后每次传代视细胞生长状态，15 20d传代一次；传至第4代时，传代方法改用橡皮刮
轻轻刮下细胞，吸管吹打细胞分散均匀以1: 2 3稀释传代；传至第6代时，细胞培养 液中动物血清含量减为总体积的10 20%，生长因子含量降低为原用量的一半；至第10 代时，细'胞培养液中动物血清含量减为总体积的8 12%，并撤除生长因子，此时，细胞
系建立成功。
所述昆虫细胞培养基为Grace's、 TC-199-MK、 TNM-FH、 TC-IOO、 MGM-448中的一种。
所述动物血清为新生小牛血清、胎牛血清、胎马血清、新生小马血清中的一种或任两种 血清的混合物。
所述生长因子为胰岛素、表皮生长因子中的一种。
所述步骤还包括细胞系的生化特征标志物的鉴定体外培养的表皮细胞系经lpM蜕皮激
素刺激12h后继续在无激素正常细胞培养液中继续培养6-24h，收集细胞，分别提取总 RNA，反转录为cDNA,以cDNA为模板，以细胞系来源昆虫的昆虫表皮蛋白基因设计 的引物进行半定量RT-PCR，检测表皮蛋白的转录。
所述步骤(1)配制细胞培养液中，昆虫细胞培养基为Grace's培养基，添加的物质为3.33 g/L的水解乳蛋白，3.33 g/L的酵母提取物，0.5 g/L的L-谷氨酰胺，50 IU/mL的庆大霉 素、100IU/mL的胰岛素、占总体积20%的胎牛血清。 一种用上述昆虫表皮细胞系的构建方法构建的棉铃虫表皮细胞系。 所述的昆虫表皮细胞系的应用，可以利用该昆虫表皮细胞系进行昆虫被杆状病毒感染后 的机制研究，包括致使细胞凋亡、致使细胞被感染、细胞对其无反应的研究；还可以利用该 昆虫表皮细胞系进行蛋白质的重组表达研究和生产，病毒杀虫剂的扩增生产等研究；也可以 进行激素或激素类似物诱导及诱导前后基因表达差异及调控的研究等。
用上述昆虫表皮细胞系的构建方法构建的棉铃虫表皮细胞系，其倍增时间约为64h，生
长曲线正常，遗传稳定，染色体正常，无异型核型，基因的转录和表达正常，可以进行连续 传代，能提供大量的棉铃虫表皮细胞，也可对其进行冷冻保藏；提供的表皮细胞可以直接进 行各种生物学研究。
本发明提供的昆虫表皮细胞系的构建方法重复性强，生化特征标志物鉴定方法专一性高， 可信，配制的培养液的营养成分全面，组织的取材部位及取材时间恰当，成功地克服了因表 皮细胞组织分化程度高而带来的难以进行体外培养的难题，该构建方法可适用于构建其它组 织分化程度高的组织来源的昆虫细胞系，应用价值极大。


图1为相差显微镜下传代培养的棉铃虫表皮细胞类型(10X20); 其中，a:上皮I型；b:上皮II型；C:成纤维型；d:纺綞型； 图2为棉铃虫表皮细胞系的生长曲线绘制图； 图3为棉铃虫表皮细胞的染色体镜检图(10X40);
图4为半定量RT-PCR分析棉铃虫表皮细胞系的特异性表皮蛋白的表达其中，a为棉铃虫蜕皮幼虫不同组织表达表皮蛋白的图片，1为表皮乡且织，2为中肠组织，
3为脂肪体组织，4为血细胞；b为经20E刺激后并撤除激素后棉铃虫表皮细胞系中表皮蛋白
的表达情况的图片。
具体实施例方式
实施例 一、棉铃虫表皮细胞系的构建，步骤如下-
(1) 配制细胞培养液向Grace's培养基中添加3.33 g/L的水解乳蛋白，3.33 g/L的酵母提 取物和0.5g/L的L-谷氨酰胺，抽滤，分装，-20。0冻存；用时再加入50lU/mL的庆大霉素、 100IU/mL的胰岛素、占总体积20%的胎牛血清，4。C存放；
(2) 原代培养选取进入蜕皮周期的5龄头壳爆裂的棉铃虫幼虫，碎冰冰浴至昏迷，75% 酒精消毒体表，无菌解剖，取虫体中段体壁背腹表皮，用眼科镍轻轻分离剔除其上连带的脂 肪体和气管组织等非表皮组织，用细胞培养液漂洗后，用钟表镊钝端刮取新鲜表皮层，剪切 为细小组织块，用吸管将其移至25o^细胞培养瓶，轻轻涂布均匀，27'C静置培养使其贴壁， 每天观察细胞生长状态，1 d后补加1.5 mL细胞培养液，10 d后再补加1.5 mL细胞培养液， 以后根据组织块贴壁及细胞生长状态每隔15 d更换半量细胞培养液；
(3)传代培养原代培养细胞增殖长满培养瓶底时，用吸管轻轻吹起以L 2稀释传代； 以后每次传代视细胞生长状态，15 20d传代一次；传至第4代时，传代方法改用橡皮刮轻
轻刮下细胞，吸管吹打细胞分散均匀以1: 2稀释传代；传至第6代时，细胞培养液中胎牛血清含量减为总体积的15%，胰岛素含量降低为原用量的一半；至第IO代以后，传代培养液中
胎牛血清含量减为总体积的10%，并撤除胰岛素；从接种组织至今已2年4个月，传代60 代，细胞已能稳定增殖，可定为细胞系，命名为SDU-Ha-Epi。该细胞系在20代以前有多种 类型的细胞形态，其中上皮型2种，成纤维型l种，纺锤形1种，如图l所示；随着传代次 数的增加，成纤维型细胞逐渐减少消失，上皮型和纺锤型为主要的细胞类型。
二、 传代细胞的冷冻保藏和复苏
(1) 细胞的冷冻选取生长旺盛、处于指数生长期的、细胞90%以上贴壁密度的培养瓶, 用吸管轻轻吹打，使细胞脱离培养瓶或培养板壁，收集转移至10mL玻璃离心管，2000 ipm 离心5min，弃上清液，用冻存液(含10%二甲基亚砜的细胞培养液)悬浮细胞，使细胞密度约 为0.5 3X106个/mL,移至冻存管，4'C0.5h， -20'C0.5 1 h，再移至液氮中保存。
(2) 细胞复苏自液氮中取出保存3个月的冻存管迅速置于38'C水浴中融化，转移细 胞至玻璃离心管，2000 rpm离心5 min，弃上清，加细胞培养液悬起细胞，再离心，弃上清 后用新的细胞培养液悬浮细胞至约1 5X105个/mL密度，并转移至培养瓶中，，放置在恒温 生化培养箱中27'C静置培养，待细胞贴壁后弃上清，换新的细胞培养液或换半量细胞培养液。
三、 细胞生长曲线和群体倍增时间的测定
在传代至12代时，棉铃虫表皮细胞生长旺盛，吸弃培养液，用含10%血清的细胞培养液 制备成单细胞悬液，血球计数板计数后，稀释成3X10MVmL的细胞悬液，传至7块6孔板，每 孔2mL细胞悬液。次日起每天同一时间取3个孔的细胞，0.2%的台盼蓝染色后计数活细胞数 量，取平均值；连续计数14d。绘制生长曲线，以培养时间为横坐标，以每mL细胞数量为纵 坐标，如图2所示，并按Haylick法计算出细胞的群体倍增时间
T=tlg2/lg(N/N0)
T:细胞在对数期的平均增长一倍所需时间
t:从接种到测定细胞数的时间
No:接种时的细胞数
N:时刻t所测定的细胞数
传代后第l 4d为缓慢生长期，第5 l()d为对数生长期，第lld达平台期，第12d起 细胞逐渐死亡。通过计算得出TTO-64h，所以对数生长期表皮细胞群体倍增时间为64h，并 确定最佳传代时间为第9 10d。
四、 染色体分析
第18代表皮细胞生长至指数生长期吋，于培养液中加入终浓瓜0.1吗/mL的秋水仙素，　15h后收集细胞至lOmL离心管内，1000rpm离心10min，去上清，磷酸盐缓冲液(PBS) 清洗一遍，加入4 mL0.5%KCL溶液，27"C低渗处理10 min后加入4 mL甲醇冰醋酸(V/V-3/1) 混合液预固定5min， 1000rpm离心5min，弃上清，再加新鲜甲醇冰醋酸固定液固定20 min， 1000 rpm离心3 min，留0.5 mL固定液悬浮细胞，滴冰片，蒸汽烘干，Giemsa染色液(Giemsa 原液与pH6.8的1/15mol/LPBS按1:9稀释)，染色20min,镜检；用表皮细胞系制备的染色 体形状为球棒状，具备典型鳞翅目昆虫染色体的特点，数目约为75-500余个，如图3所示， 表明培养的表皮细胞系染色体有二倍体和多倍体。 五、细胞特异性生化标志物的检测
提取棉铃虫蜕皮期5龄幼虫的表皮组织、中肠组织、脂肪体组织、血细胞等组织，按总 RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，分别以不同组织的总RNA为模板反转录为cDNA,再 以cDNA为模板，用棉铃虫表皮蛋白(cuticle protein)基因设计的引物进行半定量RT-PCR 检测特异性表皮蛋白的基因转录表达。体外培养的表皮细胞系经lnM20羟蜕皮酮(20E)刺 激12h后继续在无激素的细胞培养液中继续培养6h， 12h, 18h和24h，收集细胞，分别提 取总RNA，反转录为cDNA,以cDNA为模板进行半定量RT-PCR，结果只有棉铃虫幼虫表 皮组织及表皮细胞系可以检测到表皮蛋白(cuticleprotein)的转录，如图4所示，由a可见， 只有表皮组织的细胞有表皮蛋白的表达；由b可见，棉铃虫表皮细胞系经20E处理后撤除刺 激继续培养6h时刚开始表达棉铃虫表皮蛋白，18h时表达量最高，表明它就是表皮组织来源 的细胞系。
权利要求
1.一种昆虫表皮细胞系的构建方法，其特征在于包括以下步骤(1)配制细胞培养液配制昆虫细胞培养基，抽滤，分装，保存；用时加入0.1～2g/L的L-谷氨酰胺，占总体积10～30％的动物血清，50～200IU/mL的生长因子，或再添加0.1～7g/L的水解乳蛋白，0.1～7g/L的酵母提取物，1～400IU/mL的庆大霉素或青霉素或链霉素；(2)原代培养选取进入蜕皮周期的昆虫幼虫，冰浴至昏迷，70～75％酒精消毒体表，无菌解剖，取虫体体壁背腹表皮，用解剖器械分离剔除其上连带的脂肪体和气管，用细胞培养液漂洗后，刮取新鲜表皮层，剪切为细小组织块，将其移至细胞培养瓶或培养板，涂布均匀，25～29℃下恒温静置培养使其贴壁，每日观察细胞生长状态，12～30小时后补加1～2mL细胞培养液，9～11d后再补加1～2mL细胞培养液，以后根据组织块贴壁及细胞生长状态每隔14～16d更换1/4～3/4体积的细胞培养液；(3)传代培养原代培养细胞开始增殖后，细胞数目增多，细胞生长密度较大时，用吸管轻轻吸打的方法或拍击瓶壁的方法或酶消化传代法悬起细胞以1∶2～3进行稀释传代；以后每次传代视细胞生长状态，15～20d传代一次；传至第4代时，传代方法改用橡皮刮轻轻刮下细胞，吸管吹打细胞分散均匀以1∶2～3稀释传代；传至第6代时，细胞培养液中动物血清含量减为总体积的10～20％，生长因子含量降低为原用量的一半；至第10代时，细胞培养液中动物血清含量减为总体积的8～12％，并撤除生长因子，此时，细胞系建立成功。
2. 根据权利要求l所述的一种昆虫表皮细胞系的构建方法，其特征在于所述昆虫细胞培养 基为Grace's、 TC-199-MK、 TNM-FH、 TC-IOO、 MGM-448中的一种。
3. 根据权利要求l所述的一种昆虫表皮细胞系的构建方法，其特征在于所述动物血清为新生小牛血清、胎牛血清、胎马血清、新生小马血清中的一种或^B两种血清的混合物。
4. 根据权利要求l所述的一种昆虫表皮细胞系的构建方法，其特征在于所述生长因子为胰 岛素、表皮生长因子中的一种。
5. 根据权利要求l所述的一种昆虫表皮细胞系的构建方法，其特征在于所述步骤还包括细 胞系的生化特征标志物的鉴定体外培养的表皮细胞系经lpM蜕皮激素刺激12h后继续在无激素正常细胞培养液中继续培养6-24h，收集细胞，分别提取总RNA，反转录为 cDNA，以cDNA为模板，以细胞系来源昆虫的昆虫表皮蛋白基因设计的引物进行半定量 RT-PCR，检测表皮蛋白的转录。
6. 根据权利要求1所述的一种昆虫表皮细胞系的构建方法，芥特征在于所述步骤(1)配制细胞培养液中，昆虫细胞培养基为Grace's培养基，添加的物质为3.33 g/L的水解乳蛋 白，3.33 g/L的酵母提取物，0.5 g/L的L-谷氨酰胺，50 IU/mL的庆大霉素、100 IU/mL的 胰岛素、占总体积20%的胎牛血清。
7. —种用权利要求1所述的昆虫表皮细胞系的构建方法建立的棉铃虫虫表皮细胞系。
8. 权利要求7所述的棉铃虫虫表皮细胞系在生物学研究中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种昆虫表皮细胞系及其构建方法，成功地克服了表皮细胞组织分化程度高而难以进行体外培养的难题，步骤为先配制细胞培养液，然后选取进入蜕皮周期的昆虫幼虫，解剖，取虫体体壁背腹表皮，漂洗，剪切为细小组织块，25～29℃下培养使其贴壁，约1d后补加1～2mL细胞培养液，9～11d后再补加1～2mL细胞培养液；进行传代培养时，以1∶2～3进行稀释传代，15～20d传代一次；至第6代时，血清含量减为10～20％，生长因子含量降低为原用量的一半；至第10代时，血清含量减为8～12％，撤除生长因子，此时，细胞系建立成功；用本方法构建的表皮细胞系可以连续传代，提供大量的昆虫表皮细胞，可以对其进行各种生物学研究。
文档编号C12N5/06GK101182487SQ20071011406
公开日2008年5月21日 申请日期2007年11月14日 优先权日2007年11月14日
发明者王金星, 赵小凡, 邵红莲 申请人:山东大学