专利名称：：一种生产d-乳酸的方法及其专用芽孢乳杆菌的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种生产D-乳酸的方法及其专用菌株，特别是涉及一种生产D-乳酸的方法及其专用芽孢乳杆菌。
背景技术：
：乳酸(LacticAcid)是一种结构简单的有机酸，作为代谢中间体及代谢产物广泛存在于自然界。由乳酸聚合生成的聚乳酸具有良好的生物相容性和生物可降解性，可用于生产手术缝合线、生物植片、生物可降解纤维、包装材料和农用薄膜等。乳酸分子中存在一个手性中心，具有旋光性，是一种手性分子。根据旋光性的不同，乳酸可分为L-乳酸、D-乳酸和消旋乳酸。其中，高纯度D-乳酸主要应用于生物可降解塑料、农药除草剂和医药中间体等方面。德国HOECHST公司以光学纯D-乳酸为原料生产的"威霸除草剂"，能防除农田中的未本科杂草，杀草谱广，使用灵活，能与多种其它除草剂混配，也可与杀虫剂(如敌杀死等)混用，能在甜菜、油菜、亚麻、大豆等作物上施用。德国BASF公司生产的除草剂S-2-氯丙酸是以D-乳酸异丙酯为原料。此外，钙拮抗剂降低药物、皮考啉酸衍生物、二甲基四氯丙酸及氟系除草剂等都需要高纯度D-乳酸作为原料。生产乳酸的方法主要有化学合成法、酶催化法和发酵法三种。其中，化学法直接合成的乳酸为DL-乳酸，若要得到D-乳酸或L-乳酸则需进行光学拆分，而且合成所用的原料是乙醛和剧毒物氢氰酸，所以合成出的乳酸应用于食品不能被广泛接受，此外其生产成本也较高。酶催化法可以专一性地得到光学纯乳酸，但其反应过程的研究难度较大，尚未被应用于工业化生产。微生物发酵法生产乳酸，能以淀粉、纤维素等可再生资源分解所得到的葡萄糖等为原料，通过菌种和培养条件的选择发酵生产乳酸，能获得D-乳酸、L-乳酸或是两者一定比例的混合物，其生产成本低，产品安全性高，是大规模生产乳酸的主要方法。丁子建等在2004年报道采用芽孢乳杆菌(印oro/acto6fl"7/^sp)从葡萄糖发酵制备D-乳酸，可产40.7g/L的D-乳酸。中国专利CN200610097453.6公开了一种组合发酵生产D-乳酸的工艺，产酸7.5%13.1%。目前微生物发酵法生产D-乳酸的方法中，D-乳酸的产量还有待进一步提高。在微生物发酵生产D-乳酸的过程中，与分批发酵相比，半连续发酵能够縮短发酵周期，提高设备利用率，提高劳动生产率，降低劳动强度，简化操作过程，有利于控制发酵法生产D-乳酸的成本。但是半连续发酵法生产D-乳酸存在着菌株退化、污染杂菌、D-乳酸光学纯度下降等问题。
发明内容本发明的一个目的是提供一株能生产D-乳酸的芽孢乳杆菌。本发明所提供的芽孢乳杆菌为菊糖芽孢乳杆菌(<S/7wo/actotec///wsCASD，是从北京平谷某果园的土壤中分离得到的，已于2007年9月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，其保藏编号为CGMCCW2185。它具有以下生物学特征1)形态特征细胞直杆。单个或成对。形成内生孢子。少量周生鞭毛、运动。在含有葡萄糖、酵母粉和蛋白胨的琼脂平板上形成细小的针尖状菌落。2)生理生化特征革兰氏阳性。微好氧。不含有血红素化合物。不形成吲哚。不液化明胶。不还原硝酸盐。石蕊牛奶不变。能利用果糖、葡萄糖、菊糖、棉子糖、麦芽糖、甘露糖、海藻糖、蔗糖、甘露醇产酸，不能利用木糖、半乳糖、阿拉伯糖产酸。1(TC以下和5(TC以上不生长，最适生长温度4042°〇。本发明的另一个目的是提供一种生产D-乳酸的方法。本发明所提供的生产D-乳酸的方法，是发酵菊糖芽孢乳杆菌(^ora/fl"o^c///^/mJ/m^)CASDCGMCCW22185得到D-乳酸。发酵培养的方式具体可为半连续发酵。其中，发酵培养基每升中含有葡萄糖150180克，玉米浆1040克，豆粕水解液100200克，用于调控培养基pH的中和剂，余量为水；所述发酵培养基的pH为5.57。所述用于调控培养基pH的中和剂具体为碳酸钙，每升所述发酵培养基中含碳酸钙7590克。所述豆粕水解液可从商业途径获得，也可自己制作。本发明中是按照下述方法制作的将豆粕粉(北京康明威培养基技术有限责任公司)和2%(体积百分含量)的硫酸溶液，以lg豆粕粉5ml硫酸溶液的比例进行充分混匀，9(TC水浴15小时，得到豆粕水解液。发酵条件为35"C45。C培养4875小时，如3742°。培养4865小时。在发酵培养过程中还可进行搅拌，搅拌的转速为30100转/分钟，旋转半径为33或42mm，搅拌时间为2040分钟；其中，搅拌转速优选为50转/分钟，搅拌时间优选为30分钟。本发明方法中，在发酵前先将菊糖芽孢乳杆菌(5^wo/acto^c/〃^/"M/Zm^)CASDCGMCC2185接入种子培养基中，3742。C培养1024小时，然后再接入所述发酵培养基。其中，种子培养基是由如下物质组成的水溶液葡萄糖40克/升，酵母提取物5克/升，蛋白胨10克/升，牛肉膏10克/升，磷酸氢二钾2克/升，柠檬酸二铵2克/升，乙酸钠5克/升，吐温801毫升/升，七水合硫酸镁0.58克/升，四水合硫酸锰0.25克/升，碳酸钙15克/升；所述种子培养基的pH为67。本发明所提供的菊糖芽孢乳杆菌(*0^^"0^"7/^/m^'mw)CASDCGMCC処2185生产D-乳酸的能力强，以葡萄糖为底物发酵生产D-乳酸，D-乳酸最高产量162克/升，转化率94.796.0%，D-乳酸光学纯度98.0。/o以上，而且经过多次循环发酵后菌株不退化，仍能保持较高的活力；利用其发酵生产D-乳酸，可以进行多次循环发酵，发酵获得的D-乳酸的浓度高、转化率高，而且D-乳酸的纯度也能保持原来较高的水平，还能避免杂菌的污染。因此，利用本发明方法生产D-乳酸，能节约成本、提高生产效率，适合于工业生产中推广应用。图1为高效液相色谱图。A为L-乳酸标准品高效液相色谱图B为D-乳酸标准品高效液相色谱图C为菊糖芽孢乳杆菌(5^wo/acto6ac/〃MCASDCGMCCW2185发酵生产D-乳酸的发酵液的高效液相色谱图具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。本发明的利用菊糖芽孢乳杆菌(^ora/acto^c^/w/mJ/m^)CASDCGMCC2185发酵生产D-乳酸方法中涉及的步骤如下(1)斜面培养将菊糖芽孢乳杆菌(印ora/fl"o6acZ〃ws/m^'"w5)CASDCGMCCW22185菌种接种于含有1.5g/100ml琼脂的固体斜面培养基上，3742'C条件下，培养2448小时。(2)种子培养将步骤(1)的斜面培养物，在无菌条件下接种到30ml种子培养基中，3742。C条件下，静止培养1024小时，加入中和剂控制发酵液pH，制得种子培养液。G)发酵培养以10%体积比的接种量，将种子培养液接种于发酵培养基中，3545。C条件下培养4875小时，其中，三角瓶中发酵采用手动振动，每隔12小时振动一次，发酵罐采用间歇搅拌培养，每隔12小时搅拌一次，搅拌速度30100转/分钟，旋转半径为33或42mm，搅拌时间2040分钟，加入中和剂控制发酵液pH，制得含有D-乳酸的发酵培养液(第一次循环发酵)；然后将其中6090%的发酵液替换为同体积的新鲜发酵培养基，3545T:条件下培养4875小时,其中振荡方式同第一次循环发酵中所述一致(第二次循环发酵)；再将其中6090%的发酵液替换为同体积的新鲜发酵培养基，3545'C条件下培养4875小时，其中振荡方式同第一次发酵循环中所述的一致(第三次循环发酵)；如此循环发酵。(4)处理样品取发酵液以6,000转/分钟的速度离心5分钟，取上清液。(5)样品检测取上清液稀释，检测葡萄糖含量、D-乳酸含量、L-乳酸含量。其中，步骤(1)中所述的菌体培养温度具体可为4042'C。其中，步骤(2)中所述的菌体培养温度具体可为4042"C。其中，步骤(3)中所述的菌体培养温度具体可为3742t:。其中，步骤(1)中所述的菌体培养时间具体可为2436小时。其中，步骤(2)中所述的菌体培养时间具体可为1820小时。其中，步骤(3)中所述的菌体培养时间具体可为4865小时。其中，步骤(2)、(3)所述的培养过程中加入的中和剂为碳酸钙，控制pH为5,57。其中，葡萄糖的测定方法为，发酵液离心后稀释，采用生物传感分析仪SBA-40C(山东省科学院生物研究所)测定。生物传感分析仪SBA-40C是以固定化酶为传感器的分析仪器，葡萄糖与氧气、水在葡萄糖氧化酶的催化下生成葡萄糖酸和双氧水。反应放出的双氧水与白金一银电极接触，并产生电流信号，该电流信号与葡萄糖浓度成线性比例关系，通过测定电流信号强度可得出葡萄糖浓度。L-乳酸和D-乳酸含量采用AgilentIIOO液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)测定，手性分离柱(日本三菱化学公司，MCIGEL-CRS10W(3y)4.6IDX50mm，光学异体分离用)，0.002mol/L硫酸铜为流动相，流量0.5ml/min，进样量20uL，紫外检测器，检测波长254nm，操作温度25。C。D-乳酸标准品为Sigma-Aldrich公司产品，货号为L0625，L-乳酸标准品为Sigma-Aldrich公司产品，货号为L1750。以初始发酵培养基作为对照。在以上色谱条件下，标准品的高效液相色谱检测结果见附图1。其中，A为L-乳酸标准品高效液相色谱图，B为D-乳酸标准品高效液相色谱图。在该色谱条件下，L-乳酸标准品的保留时间为11.566分钟，D-乳酸标准品的保留时间为9.724分钟。D-乳酸光学纯度计算方法D-乳酸光学纯度(％)二[D-乳酸浓度(克/升)一L-乳酸浓度(克/升)]+[D-乳酸浓度(克/升)屮L-乳酸浓度(克/升)]xlOO%转化率计算方法转化率(％)二D-乳酸浓度(克/升)+葡萄糖消耗量(克/升)xiOO%下面通过实施例进一步阐述本发明。实施例1、菊糖芽孢乳杆菌(5Jwra/actoZ)ac/〃附CASDCGMCCJV22185的分离、诱变筛选和鉴定一、菌株菊糖芽孢乳杆菌(Spwo/acto6ac/〃M/"w"m^)CASDCGMCC2185的分离、诱变筛选菌株分离筛选采集北京市平谷某果园土壤，称取5克溶于100ml生理盐水，充分混匀后用无菌水稀释100,000倍涂布于MRS固体培养基上，37'C培养；菌落长出后，部分单菌落由于产酸将菌落周围培养基中的碳酸钙溶解，产生透明圈，挑取透明圈明显的单菌落，接种于10ml发酵培养基中，37'C静止培养72小时后，根据上述具体实施方式中所述的检测方法，检测发酵液中D-乳酸含量。经过多次筛选，挑取一株D-乳酸产量最高的菌株。离子束诱变筛选将上述获得的D-乳酸产量最高的菌株接种于MRS液体培养基中，37t:静止培养至对数中期，离心，将菌体用生理盐水洗涤后悬浮，制成菌悬液。吸取100^iL菌悬液涂布于直径为3.5cm的无菌空白培养皿上，涂布直径约1.5cm，无菌风吹干制成菌膜后进行离子注入，离子能量30keV，注入剂量分别为lx1014ions/cm2、5xl014ions/cm2、10x10"ions/cm2、50x1014ions/cm2、100x1014ions/cm2。离子注入后的平皿用lmL生理盐水洗脱。各不同注入剂量分别吸取10(HiL，稀释后涂布在MRS固体培养基上，待长出单菌落后，挑选透明圈较大的菌落，接种于10ml发酵培养基中，37"C静止培养48小时；然后将其中90%的发酵液替换为同体积的新鲜发酵培养基，37'C静止培养48小时；再将其中90%的发酵液替换为同体积的新鲜发酵培养基，37'C静止培养48小时；如此循环发酵10次。根据上述具体实施方式中所述的检测和计算方法，检测第1次和第10次循环发酵发酵液中葡萄糖浓度、D-乳酸浓度和L-乳酸浓度，计算D-乳酸光学纯度和葡萄糖转化率。结果发现，经过10次循环发酵，多数单菌落的产酸能力和D-乳酸光学纯度都有不同程度的下降，只有少数单菌落能够在多次循环发酵后基本保持原有的产酸能力和D-乳酸光学纯度。经过多次筛选，获得一株高活性的，D-乳酸产量比离子束诱变前有明显提高的、经过多次循环发酵后保持D-乳酸产量高、D-乳酸光学纯度98X以上、转化率95%以上的菌株。将此菌株多次传代培养，然后再进行10个循环的半连续发酵测试，其第10次循环发酵产生的D-乳酸产量、D-乳酸光学纯度和转化率基本保持原有水平，证明此菌株即是目的菌株，名称为CASD。其中，MRS固体培养基的组成为葡萄糖20克/升，酵母提取物5克/升，蛋白胨10克/升，牛肉膏10克/升，磷酸氢二钾2克/升，拧檬酸二铵2克/升，乙酸钠5克/升，吐温801毫升/升，七水合硫酸镁0.58克/升，四水合硫酸锰0.25克/升，碳酸钙15克/升，琼脂粉15克/升，溶剂为水；所述MRS固体培养基的pH为6.5。115'C灭菌20分钟。MRS液体培养基的组成为葡萄糖20克/升，酵母提取物5克/升，蛋白胨IO克/升，牛肉膏10克/升，磷酸氢二钾2克/升，柠檬酸二铵2克/升，乙酸钠5克/升，吐温801毫升/升，七水合硫酸镁0.58克/升，四水合硫酸锰0.25克/升，溶剂为水；所述MRS液体培养基的pH为6.5。115'C灭菌20分钟。发酵培养基的组成为工业葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)150克/升，豆粕水解液100克/升，玉米浆(上海西王淀粉糖有限公司)10克/升，碳酸钙75克/升，溶剂为水；所述发酵培养基的pH为6.5。115'C灭菌20分钟。其中，豆粕水解液制备方法将豆粕粉(北京康明威培养基技术有限责任公司)和2%(体积百分含量)的硫酸溶液，以lg豆粕粉5ml硫酸溶液的比例进行充分混匀，9(TC水浴15小时，得到豆粕水解液。二、菌株菊糖芽孢乳杆菌(S;ora/flctok/c/〃w""w""船)CASDCGMCCWe2185的鉴定按照"常见细菌系统鉴定手册"(东秀珠，蔡妙英等编著，北京科学出版社，2001.2)和"伯杰细菌鉴定手册"(第八版)中描述的方法，对该菌株进行形态特征观察和生理生化特性鉴定。鉴定结果如下1)形态特征细胞直杆。单个或成对。形成内生孢子。少量周生鞭毛、运动。在含有葡萄糖、酵母粉和蛋白胨的琼脂平板上形成细小的针尖状菌落。2)生理生化特征革兰氏阳性。微好氧。不含有血红素化合物。不形成B引哚。不液化明胶。不还原硝酸盐。石蕊牛奶不变。能利用果糖、葡萄糖、菊糖、棉子糖、麦芽糖、甘露糖、海藻糖、蔗糖、甘露醇产酸，不能利用木糖、半乳糖、阿拉伯糖产酸。10。C以下和5(TC以上不生长，最适生长温度4042。C。基于以上特征，将本株D-乳酸生产菌鉴定为菊糖芽孢乳杆菌(S/ora/flcto6a"7/^〖"w//m^)CASD，并将其保藏，保藏号为CGMCCW22185。"伯杰细菌鉴定手册"(第八版)中菊糖芽孢乳杆菌与菊糖芽孢乳杆菌CASD形态和生理生化特征比较如表1所示。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>实施例2、利用菊糖芽孢乳杆菌(S/ora/actotec〃/w/""//"^)CASDCGMCC2185在三角瓶中发酵生产D-乳酸，循环发酵2次，每次发酵培养48小时，发酵温度35"C，将其中90%的发酵液替换为同体积的新鲜发酵培养基本实施例中所使用的各培养基的组成如下斜面培养基葡萄糖20克/升，酵母提取物5克/升，蛋白胨10克/升，牛肉膏10克/升，磷酸氢二钾2克/升，柠檬酸二铵2克/升，乙酸钠5克/升，吐温801毫升/升，七水合硫酸镁0.58克/升，四水合硫酸锰0.25克/升，碳酸钙15克/升，琼脂粉15克/升，溶剂为水；所述斜面培养基的pH为6.5。115'C灭菌20分钟。种子培养基葡萄糖40克/升，酵母提取物5克/升，蛋白胨10克/升，牛肉膏10克/升，磷酸氢二钾2克/升，柠檬酸二铵2克/升，乙酸钠5克/升，吐温801毫升/升，七水合硫酸镁0.58克/升，四水合硫酸锰0.25克/升，碳酸钙15克/升，溶剂为水；所述种子培养基的pH为6.5。115'C灭菌20分钟。发酵培养基工业葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)150克/升，豆粕水解液(豆粕水解液制备方法同实施例1)100克/升，玉米桨(上海西王淀粉糖有限公司)30克/升，碳酸钙75克/升，余量为水；所述发酵培养基的pH为5.5。115。C灭菌20分钟。该发酵生产D-乳酸的方法包括以下步骤(1)斜面培养将菊糖芽孢乳杆菌(S;ora/acto6ac/〃wCASDCGMCCJY22185接种于斜面培养基上，4(TC培养24小时；(2)种子培养将步骤(1)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于装有30ml种子培养基的100ml三角瓶中，40。C静止培养20小时，制得种子培养液；(3)发酵培养将10ml步骤(2)制得的种子培养液接入装有90ml发酵培养基的300ml三角瓶中，35t:静止培养，每隔12小时振荡搅拌一次，培养48小时；然后从中取出90ml发酵液，再向其中补充加入90ml新鲜发酵培养基，同时补加葡萄糖至其终浓度为150克/升，35'C静止培养，每隔12小时振荡搅拌一次，培养48小时，结束发酵。发酵结束后，根据上述具体实施方式中所述的检测和计算方法，检测最后一次循环发酵发酵液中D-乳酸浓度、L-乳酸浓度、葡萄糖浓度，计算葡萄糖转化率及D-乳酸光学纯度。该实验共设3次重复。结果表明D-乳酸浓度为136±3克/升，转化率为95.0±0.4%，D-乳酸光学纯度为98.3±0.2%。实施例3、利用菊糖芽孢乳杆菌(S;oTO/acto6ac/〃uyCASDCGMCC2185在三角瓶中发酵生产D-乳酸，循环发酵2次，每次发酵培养65小时，发酵温度4(TC，将其中70%的发酵液替换为同体积的新鲜发酵培养基本实施例中所使用的各培养基的组成如下斜面培养基和种子培养基同实施例2。发酵培养基工业葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)160克/升，豆粕水解液(豆粕水解液制备方法同实施例1)150克/升，玉米浆(上海西王淀粉糖有限公司)40克/升，碳酸钙80克/升，余量为水；所述发酵培养基的pH为6。115"C灭菌20分钟。该发酵生产D-乳酸的方法包括以下步骤(1)斜面培养同实施例2。(2)种子培养同实施例2。(3)发酵培养将10ml步骤(2)制得的种子培养液接入装有90ml发酵培养基的300ml三角瓶中，40。C静止培养，每隔12小时振荡搅拌一次，培养65小时；然后从中取出70ml发酵液，再向其中补充加入70ml新鲜发酵培养基，同时补加葡萄糖至其终浓度为160克/升，4(TC静止培养，每隔12小时振荡搅拌一次，培养65小时，结束发酵。发酵结束后，根据上述具体实施方式中所述的检测和计算方法，检测最后一次循环发酵发酵液中D-乳酸浓度、L-乳酸浓度、葡萄糖浓度，计算葡萄糖转化率及D-乳酸光学纯度。该实验共设3次重复。结果表明D-乳酸浓度为146±5克/升，转化率为94.7±0.4%，D-乳酸光学纯度为98.0±0.3%。实施例4、利用菊糖芽孢乳杆菌(S/7ora/flcto6ac/〃MCASDCGMCCW2185在三角瓶中发酵生产D-乳酸，循环发酵4次，每次发酵培养75小时，发酵温度45'C，将其中60%的发酵液替换为同体积的新鲜发酵培养基本实施例中所使用的各培养基的组成如下斜面培养基和种子培养基同实施例2。发酵培养基工业葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)150克/升，豆粕水解液(豆粕水解液制备方法同实施例1)100克/升，玉米浆(上海西王淀粉糖有限公司)10克/升，碳酸钙75克/升，余量为水；所述发酵培养基的pH为5.5。115'C灭菌20分钟。该发酵生产D-乳酸的方法包括以下步骤(1)斜面培养同实施例2;(2)种子培养同实施例2;(3)发酵培养将10ml步骤(2)制得的种子培养液接入装有90ml发酵培养基的300ml三角瓶中，45。C静止培养，每隔12小时振荡搅拌一次，培养75小时；然后从中取出60ml发酵液，再向其中补充加入60ml新鲜发酵培养基，同时补加葡萄糖至其终浓度为150克/升，45X:静止培养，每隔12小时振荡搅拌一次，培养75小时；从中取出60ml发酵液，再向其中补充加入60ml新鲜发酵培养基，同时补加葡萄糖至其终浓度为150克/升，45'C静止培养，每隔12小时振荡搅拌一次，培养75小时；再如此循环发酵l次，结束发酵。发酵结束后，根据上述具体实施方式中所述的检测和计算方法，检测最后一次循环发酵发酵液中D-乳酸浓度、L-乳酸浓度、葡萄糖浓度，计算葡萄糖转化率和D-乳酸光学纯度。该实验共设3次重复。结果表明D-乳酸浓度为140±3克/升，转化率为95.3±0.3%，D-乳酸光学纯度为98.5±0.2%。实施例5、利用菊糖芽孢乳杆菌(S/wra/acto6ac/〃M)CASDCGMCCW2185在三角瓶中发酵生产D-乳酸，循环发酵10次，每次发酵培养72小时，发酵温度37'C，将其中75%的发酵液替换为同体积的新鲜发酵培养基本实施例中所使用的各培养基的组成如下斜面培养基和种子培养基同实施例2。发酵培养基工业葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)160克/升，豆粕水解液(豆粕水解液制备方法同实施例1)200克/升，玉米浆(上海西王淀粉糖有限公司)40克/升，碳酸钙80克/升，余量为水；所述发酵培养基的pH为6。115i:灭菌20分钟。该发酵生产D-乳酸的方法包括以下步骤(1)斜面培养同实施例2;(2)种子培养同实施例2;(3)发酵培养将10ml步骤(2)制得的种子培养液接入装有90ml发酵培养基的300ml三角瓶中，37。C静止培养，每隔12小时振荡搅拌一次，培养72小时；从中取出75ml发酵液，再向其中补充加入75ml新鲜发酵培养基，同时补加葡萄糖至其终浓度为160克/升，37'C静止培养，每隔12小时振荡搅拌一次，培养72小时；从中取出75ml发酵液，再向其中补充加入75ml新鲜发酵培养基，同时补加葡萄糖至其终浓度为160克/升，37'C静止培养，每隔12小时振荡搅拌一次，培养72小时；如此再循环发酵7次，结束发酵。发酵结束后，根据上述具体实施方式中所述的检测和计算方法，检测最后一次循环发酵发酵液中D-乳酸浓度、L-乳酸浓度、葡萄糖浓度，计算葡萄糖转化率及D-乳酸光学纯度。该实验共设3次重复。结果表明D-乳酸浓度为145±4克/升，转化率为95.7±0.5%，D-乳酸光学纯度为98.1±0.2%。实施例6、利用菊糖芽孢乳杆菌(印ora/flctoZ)ac/〃MCASDCGMCC2185在三角瓶中发酵生产D-乳酸，循环发酵10次，每次发酵培养60小时，发酵温度4(TC，将其中80%的发酵液替换为同体积的新鲜发酵培养基本实施例中所使用的各培养基的组成如下斜面培养基和种子培养基同实施例2。发酵培养基工业葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)180克/升，豆粕水解液(豆粕水解液制备方法同实施例1)160克/升，玉米浆(上海西王淀粉糖有限公司)30克/升，碳酸钙90克/升，余量为水；所述发酵培养基的pH为6.5。115t:灭菌20分钟。该发酵生产D-乳酸的方法包括以下步骤(1)斜面培养同实施例2;(2)种子培养同实施例2;(3)发酵培养将10ml步骤(2)制得的种子培养液接入装有90ml发酵培养基的300ml三角瓶中，40。C静止培养，每隔12小时振荡搅拌一次，培养60小时；从中取出80ml发酵液，再向其中补充加入80ml新鲜发酵培养基，同时补加葡萄糖至其终浓度为180克/升，4CTC静止培养，每隔12小时振荡搅拌一次，培养60小时；从中取出80ml发酵液，再向其中补充加入80ml新鲜发酵培养基，同时补加葡萄糖至其终浓度为180克/升，4(TC静止培养，每隔12小时振荡搅拌一次，培养60小时；如此再循环发酵7次，结束发酵。发酵结束后，根据上述具体实施方式中所述的检测和计算方法，检测最后一次循环发酵发酵液中D-乳酸浓度、L-乳酸浓度、葡萄糖浓度，计算葡萄糖转化率及D-乳酸光学纯度。该实验共设3次重复。结果表明D-乳酸浓度为160±2克/升，转化率为95.7±0.4%，D-乳酸光学纯度为98.3±0.2%。实施例7、利用菊糖芽孢乳杆菌(印ora/acto6ac/〃M/"w/Z"ws)CASDCGMCC2185在三角瓶中发酵生产D-乳酸，循环发酵10次，每次发酵培养48小时，发酵温度42。C，将其中70%的发酵液替换为同体积的新鲜发酵培养基本实施例中所使用的各培养基的组成如下斜面培养基和种子培养基同实施例2。发酵培养基工业葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)170克/升，豆粕水解液(豆粕水解液制备方法同实施例1)200克/升，玉米浆(上海西王淀粉糖有限公司)20克/升，碳酸钙85克/升，余量为水；所述发酵培养基的pH为7。115。C灭菌20分钟。该发酵生产D-乳酸的方法包括以下步骤(1)斜面培养同实施例2;(2)种子培养同实施例2;(3)发酵培养将10ml步骤(2)制得的种子培养液接入装有90ml发酵培养基的300ml三角瓶中，42。C静止培养，每隔12小时振荡搅拌一次，培养48小时；从中取出70ml发酵液，再向其中补充加入70ml新鲜发酵培养基，同时补加葡萄糖至其终浓度为170克/升，42。C静止培养，每隔12小时振荡搅拌一次，培养48小时；从中取出70ml发酵液，再向其中补充加入70ml新鲜发酵培养基，同时补加葡萄糖至其终浓度为170克/升，42。C静止培养，每隔12小时振荡搅拌一次，培养48小时；如此再循环发酵7次，结束发酵。发酵结束后，根据上述具体实施方式中所述的检测和计算方法，检测最后一次循环发酵发酵液中D-乳酸浓度、L-乳酸浓度、葡萄糖浓度，计算葡萄糖转化率及D-乳酸光学纯度。该实验共设3次重复。结果表明D-乳酸浓度为150±2克/升，转化率为95.2±0.2%，D-乳酸光学纯度为98.5±0.2%。实施例8、利用菊糖芽孢乳杆菌(印oro/acto^c!7/wsz'm^'m^)CASDCGMCCNs2185在5升全自动发酵罐中发酵生产D-乳酸，循环发酵3次，每次发酵培养60小时，发酵温度4(TC，将其中80%的发酵液替换为同体积的新鲜发酵培养基本实施例中所使用的各培养基的组成如下斜面培养基和种子培养基同实施例2。发酵培养基工业葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)180克/升，豆粕水解液(豆粕水解液制备方法同实施例1)180克/升，玉米浆(上海西王淀粉糖有限公司)30克/升，碳酸钙90克/升，余量为水；所述发酵培养基的pH为6.5。115X:灭菌20分钟。该发酵生产D-乳酸的方法包括以下步骤(1)斜面培养同实施例2;(2)种子培养将步骤(1)培养的菌株在无菌条件下用接种环接2环于装有30ml种子培养基的100ml三角瓶中，40。C静止培养20小时，制得种子培养液1;将30ml种子培养液1在无菌条件下接入装有300ml种子培养基的500ml三角瓶中，4(TC静止培养20小时，制得种子培养液2;(3)发酵培养将300ml步骤(2)制得的种子培养液2在无菌条件下接入装有3.7升发酵培养基的5升全自动发酵罐(上海保兴BIOTECH)中，4(TC静止培养，每隔12小时搅拌一次，每次以30转/分的转速搅拌20分钟，旋转半径为33mm，培养60小时(第l次循环)；从中取出3.2升发酵液，再向其中补充加入3.2升新鲜发酵培养基，同时补加葡萄糖至其终浓度为180克/升，4(TC静止培养，每隔12小时搅拌一次，每次以30转/分的转速搅拌20分钟，旋转半径为33mm，培养60小时(第2次循环)；从中取出3.2升发酵液，再向其中补充加入3.2升新鲜发酵培养基，同时补加葡萄糖至其终浓度为180克/升，40。C静止培养，每隔12小时搅拌一次，每次以30转/分的转速搅拌20分钟，旋转半径为33mm，培养60小时(第3次循环)，结束发酵。发酵结束后，根据上述具体实施方式中所述的检测和计算方法，分别检测第l、2、3次循环发酵液中D-乳酸浓度、L-乳酸浓度、葡萄糖浓度，计算葡萄糖转化率及D-乳酸光学纯度。该实验共设3次重复。3次发酵结果见表2。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>实施例9、利用菊糖芽孢乳杆菌(Spwo/flcto6ac///Ms!'"w"m^)CASDCGMCCW2185在5升全自动发酵罐中发酵生产D-乳酸，循环发酵7次，每次发酵培养55小时，发酵温度4(TC，将其中75%的发酵液替换为同体积的新鲜发酵培养基本实施例中所使用的各培养基的组成如下斜面培养基和种子培养基同实施例2。发酵培养基工业葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)170克/升，豆粕水解液(豆粕水解液制备方法同实施例1)170克/升，玉米浆(上海西王淀粉糖有限公司)25克/升，碳酸钙85克/升，余量为水；所述发酵培养基的pH为6.5。115°。灭菌20分钟。该发酵生产D-乳酸的方法包括以下步骤(1)斜面培养同实施例2;(2)种子培养同实施例8;(3)发酵培养将300ml步骤(2)制得的种子培养液2在无菌条件下接入装有3.7升发酵培养基的5升全自动发酵罐(上海保兴BIOTECH)中，40。C静止培养，每隔12小时搅拌一次，每次以50转/分的转速搅拌30分钟，旋转半径为33mm，培养55小时(第一次循环)；从中取出3.0升发酵液，再向其中补充加入3.0升新鲜发酵培养基，同时补加葡萄糖至其终浓度为170克/升，4(TC静止培养，每隔12小时搅拌一次，每次以50转/分的转速搅拌30分钟，旋转半径为33mm，培养55小时(第二次循环)；从中取出3.0升发酵液，再向其中补充加入3.0升新鲜发酵培养基，同时补加葡萄糖至其终浓度为170克/升，4(TC静止培养，每隔12小时搅拌一次，每次以50转/分的转速搅拌30分钟，旋转半径为33mm，培养55小时(第三次循环)；再如此循环发酵4次，结束发酵。检测第1至第7次循环发酵发酵液的D-乳酸浓度、L-乳酸浓度、葡萄糖浓度，并计算葡萄糖转化率及D-乳酸光学纯度。该实验共设3次重复。7次发酵结果见表3。第6次循环发酵发酵液高效液相色谱检测结果见附图l。其中，C为发酵液高效液相色谱图。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>实施例10、利用菊糖芽孢乳杆菌(5^ora/ac/o^c〃/w/"m/Z"w)CASDCGMCCW2185在30升全自动发酵罐中发酵生产D-乳酸，循环发酵4次，每次发酵培养48小时，发酵温度42"C，将其中85%的发酵液替换为同体积的新鲜发酵培养基本实施例中所使用的各培养基的组成如下斜面培养基和种子培养基同实施例2。发酵培养基工业葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)170克/升，豆粕水解液(豆粕水解液制备方法同实施例1)150克/升，玉米浆(上海西王淀粉糖有限公司)20克/升，碳酸钙85克/升，余量为水；所述发酵培养基的pH为6.5。115'C灭菌20分钟。该发酵生产D-乳酸的方法包括以下步骤(1)斜面培养同实施例2;(2)种子培养将步骤(1)培养的菌株在无菌条件下用接种环接2环于装有30ml种子培养基的100ml三角瓶中，40°C静止培养20小时，制得种子培养液1;将30ml种子培养液1在无菌条件下接种于装有300ml种子培养基的500ml三角瓶中，4(TC静止培养20小时，制得种子培养液2;将300ml种子培养液2，在无菌条件下接种于装有2升种子培养基的5升三角瓶中，4(TC静止培养20小时，制得种子培养液3;(3)发酵培养将2升步骤(2)制得的种子培养液3，在无菌条件下接入装有18升发酵培养基的30升全自动发酵罐(上海保兴BIOTECH)中，42'C静止培养，每隔12小时搅拌一次，每次以100转/分的转速搅拌40分钟，旋转半径为42mm，培养48小时(第l次循环)；从中取出17升发酵液，再向其中补充加入17升新鲜发酵培养基，同时补加葡萄糖至其终浓度为170克/升，42"C静止培养，每隔12小时搅拌一次，每次以100转/分的转速搅拌40分钟，旋转半径为42mm，培养48小时(第2次循环)；再如此循环发酵2次，分别记作第3次循环、第4次循环，结束发酵。分别检测第l、2、3、4次循环发酵液中D-乳酸浓度、L-乳酸浓度、葡萄糖浓度，并计算每次的葡萄糖转化率及D-乳酸光学纯度。该实验共设3次重复。4次发酵结果见表4。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>权利要求1、菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillusinulinus)CASD，其保藏编号为CGMCC№2185。2、一种生产D-乳酸的方法，是发酵菊糖芽孢乳杆菌(*oro/flcto^c/〃M"，//"i)CASDCGMCCWe2185得到D-乳酸。3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述发酵培养的方式为半连续发酵。4、根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述菊糖芽孢乳杆菌(S/wra/fl"otocf〃"s/做//"船)CASDCGMCCWs2185的发酵培养基每升中含有葡萄糖150180克，玉米浆1040克，豆粕水解液100200克，用于调控培养基pH的中和剂，余量为水；所述发酵培养基的pH为5.57。5、根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述中和剂为碳酸钙，每升所述发酵培养基中含碳酸钙7590克。6、根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述菊糖芽孢乳杆菌(印ora/flcto&acz7/^/m///m)CASDCGMCC2185的发酵条件为35。C45。C培养4875小时。7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述发酵培养温度为37'C42'C。8、根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述发酵培养时间为4865小时。9、根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述发酵培养过程中进行搅拌，所述搅拌的转速为30100转/分钟，旋转半径为33mm或42mm，搅拌时间为2040分钟；所述搅拌转速优选为50转/分钟，搅拌时间优选为30分钟。10、根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述方法中，将菊糖芽孢乳杆菌(印ow/acto&c/〃M/m^mw)CASDCGMCCW2185先接入种子培养基中，在3742'C培养1024小时，再接入所述发酵培养基；所述种子培养基是由如下物质组成的水溶液葡萄糖40克/升，酵母提取物5克/升，蛋白胨10克/升，牛肉膏10克/升，磷酸氢二钾2克/升，柠檬酸二铵2克/升，乙酸钠5克/升，吐温801毫升/升，七水合硫酸镁0.58克/升，四水合硫酸锰0.25克/升，碳酸钙15克/升；所述种子培养基的pH为67。全文摘要本发明涉及一种生产D-乳酸的方法及其专用菌株，特别涉及一种生产D-乳酸的方法及其专用芽孢乳杆菌。本发明所提供的芽孢乳杆菌为菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillusinulinus)CASD，其保藏编号为CGMCC№2185。本发明提供的生产D-乳酸的方法为利用菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillusinulinus)CASDCGMCC№2185半连续发酵生产D-乳酸。本发明方法获得的D-乳酸的浓度最高可达162克/升、转化率94.7～96.0％、D-乳酸光学纯度98.0％以上，而且多次发酵循环后D-乳酸的光学纯度仍能保持98％以上，还能避免杂菌的污染。因此利用本发明方法生产D-乳酸，能节约成本、提高生产效率，适合于工业生产中推广应用。文档编号C12N1/20GK101173240SQ20071017605公开日2008年5月7日申请日期2007年10月18日优先权日2007年10月18日发明者波于,帅周,王丽敏,秦加阳,平许,博赵,闫淑芳,马延和,马翠卿申请人:中国科学院微生物研究所