专利名称：：一种生产l-乳酸的方法及其专用鼠李糖乳杆菌的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种生产L-乳酸的方法及其专用菌株，特别是涉及一种生产L-乳酸的方法及其专用鼠李糖乳杆菌。
背景技术：
：乳酸(LacticAcid)又名二羟基丙酸，是世界三大有机酸之一。作为一种传统的多用途精细化学品，乳酸可作为酸味剂、芳香剂、防腐剂、植物生长调节剂、生物可降解性材料、药物和农药等，应用于食品、制药、酿造、制革、纺织、环保和农业中。乳酸是一种手性分子，可分为L-乳酸、D-乳酸和DL-乳酸。由L-乳酸作为主要单体制成的聚乳酸具有良好的生物相容性和生物可降解性，可制成医用缓释材料、生物可降解纤维和生物可降解塑料等。L-乳酸正成为国内外乳酸行业的研究热点。乳酸的生产方法主要有化学合成法、酶合成法和发酵法三种。化学法直接合成的乳酸为DL-乳酸，若要得到D-乳酸或L-乳酸则需进行光学拆分。而且由于合成法所用的原料是乙醛和剧毒物氢氰酸，因此合成乳酸应用于食品不能被广泛接受，此外其生产成本也较高。酶法催化可以专一性地得到光学纯乳酸，但其反应过程研究难度很大，尚未应用于工业化生产。微生物发酵法生产乳酸，可通过菌种和培养条件的选择而获得D-乳酸、L-乳酸或是两者一定比例的混合物，能以淀粉、纤维素等可再生资源分解所得到的葡萄糖等为原料发酵生产乳酸，且生产成本低、产品安全性高，是大规模生产乳酸的主要方法。申请号为200480036931.1的中国专利公开了一种采用丄fl"o6ac/〃wsparacwe/生产乳酸的方法，以葡萄糖、酵母提取物和蛋白胨为发酵基质，产生181克/升的乳酸；以葡萄糖、蛋白胨和玉米浸渍粉为发酵基质，产生179.1克/升的乳酸。申请号为20051011卯41.3的中国专利公开了一种采用干酪乳杆菌改组菌株aflcto&"7/wcwez'—Lc一F34发酵生产L-乳酸的方法，该菌株以葡萄糖和酵母抽提物为发酵基质，摇瓶补料分批发酵生产乳酸，产生177.6克/升的乳酸；以玉米浆和葡萄糖为发酵基质，30升发酵罐分批补料发酵生产乳酸，产生154.6克/升的L-乳酸。L-乳酸的生产成本是制约L-乳酸应用的关键因素之一。提高发酵法生产L-乳酸过程中发酵液中L-乳酸的浓度有利于降低成本。在发酵法生产L-乳酸的过程中，培养基中的氮源是影响L-乳酸生产成本的另一重要因素，采用来源广泛、价格低廉的含氮原料作为酵母粉和蛋白胨等价格较高的氮源的替代物，是控制L-乳酸生产成本的另一有效途径。
发明内容本发明的一个目的是提供一株产L-乳酸的鼠李糖乳杆菌(丄acto^c/〃Mr/z扁"o犯s)CASL。本发明所提供的鼠李糖乳杆菌aacto6flc/〃^Wzam"omy)CASL是从山东济南某牛奶厂附近土壤中筛选得到，鉴定为鼠李糖乳杆菌aacto6ac〃/wMam"(W"s)。鼠李糖乳杆菌a""o6ac〃/wAam"asws)CASL已于2007年9月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCCW2183。鼠李糖乳杆菌aacto6ac/〃wAflmwomy)CASLCGMCCW2183为革兰氏阳性菌，细胞长杆状，长2.5—3.5(im，宽0.7—0.8pm。可利用海藻糖、山梨糖醇、葡萄糖、乳糖、核糖、纤维二糖、麦芽糖、果糖等。本发明的第二个目的是提供一种利用鼠李糖乳杆菌a""o6a"'〃^Aam"amy)CASLCGMCC2183生产L-乳酸的方法。本发明所提供的生产L-乳酸的方法，是发酵鼠李糖乳杆菌(丄"ctoZ)"c///^Aam"as^)CASLCGMCCWs2183得到L-乳酸。所述鼠李糖乳杆菌(Za"o6ad//^Wzamwasw"CASLCGMCCW2183的发酵培养基中含有碳源、氮源和用于控制发酵液pH的中和剂，所述碳源为工业葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)150—200克/升，所述氮源选自下述1)至3)中的任意一种1)豆粕水解液100_300克/升；2)豆粕粉20—30克/升；3)豆粕水解液100—300克/升，玉米浆10—30克/升；所述发酵培养基的pH为5.5—7。所述豆粕粉可直接作为氮源，也可先进行酸解或酶解，将得到的豆粕水解液作为氮源。所述豆粕水解液可按照下述方法制备，称取豆粕粉(北京康明威培养基技术有限责任公司)，以lg豆粕粉5ml的2X硫酸溶液的比例进行充分混匀，卯r水浴15小时。当所述氮源为豆粕粉时，所述发酵培养基中还可含有0.05—0.1克/升的蛋白酶。所述中和剂具体可为碳酸钙。所述鼠李糖乳杆菌aa"o6a"7/wWzam"(w^)CASLCGMCCW2183的发酵条件具体可为35—50。C培养48—80小时，如35—45。C培养50—68小时。所述方法中，还可将鼠李糖乳杆菌aactokc/〃wCASLCGMCCW2183先接入如下种子培养基中，在35—4(TC培养12—20小时，再接入所述发酵培养基；所述种子培养基每升中含有葡萄糖20克，酵母粉5克，蛋白胨5克，碳酸钙10克，余量为水；所述种子培养基的pH为6.5。所述发酵的培养方式具体可为间歇振动培养(如用三角瓶发酵培养)或间歇搅拌培养(如采用发酵罐培养)，间隔时间均为12小时；所述搅拌的转速为30—100转/分钟，旋转半径为33或42mm，搅拌时间为20—40分钟；所述搅拌转速优选为50转/分钟，搅拌时间优选为30分钟。本发明利用鼠李糖乳杆菌aacto6ac/〃MMamwoms)CASLCGMCCWs2183生产L-乳酸，以工业葡萄糖为底物，在35T:—45t:条件下以94.5%—96.5%的转化率高效发酵生产光学纯度97.6%_98.7%的L-乳酸，其中L-乳酸浓度最高可达235克/升。本发明利用鼠李糖乳杆菌(Zacto6ac/〃MAflmwas^)CASLCGMCCW2183生产L-乳酸，以豆粕粉为氮源时，同时可加入蛋白酶，使蛋白质水解与乳酸发酵同时进行，提高了豆粕粉的利用效率，简化了原料处理过程，同时也可以控制L-乳酸的生产成本。图1为鼠李糖乳杆菌a"cto^c/〃^Aam"ams)CASLCGMCCW2183发酵生产L-乳酸发酵液和L-乳酸标准品、D-乳酸标准品高效液相色谱图。其中，A为L-乳酸标准品高效液相色谱图，B为D-乳酸标准品高效液相色谱图。图2为鼠李糖乳杆菌aa"o6ac/〃wsAammwws)CASLCGMCCW2183发酵生产L-乳酸过程中，葡萄糖和L-乳酸随时间变化过程曲线。具体实施例方式本发明的利用鼠李糖乳杆菌aa"o6ac/〃wsAamwo^ms)CASLCGMCC^2183发酵生产L-乳酸方法中涉及的步骤如下(1)斜面培养将鼠李糖乳杆菌(丄acto6ac/〃MW2am"osay)CASLCGMCCW2183菌种接种于含有1.5g/100ml琼脂的固体斜面培养基上，35—40。C条件下，培养24—48小时；(2)种子培养将步骤(1)的斜面培养物，在无菌条件下接种到30ml种子培养基中，35—4(TC条件下，静止培养10—24小时，加入中和剂控制发酵液pH，制得种子培养液；(3)发酵培养以5—15%体积比的接种量，将种子培养液接种于发酵培养基中，35—5(TC条件下培养48—80小时，其中，三角瓶中发酵采用手动振动，每隔12小时振动一次，发酵罐采用间歇搅拌培养，每隔12小时搅拌一次，搅拌速度30—100转/分钟，旋转半径为33或42mm，搅拌时间20—40分钟，加入中和剂控制发酵液pH，制得含有L-乳酸的发酵培养液；(4)处理样品取发酵液6，000转/分钟离心5分钟，取上清液；(5)样品检测取上清液稀释，检测葡萄糖含量、L-乳酸含量和D-乳酸含量；其中，步骤(1)中所述的菌体培养温度具体可为37—4(TC。其中，步骤(2)中所述的菌体培养温度具体可为37—4(TC。其中，步骤(3)中所述的菌体培养温度具体可为35—45'C。其中，步骤(1)中所述的菌体培养时间具体可为24—36小时。其中，步骤(2)中所述的菌体培养时间具体可为12—20小时。其中，步骤(3)中所述的菌体培养时间具体可为50—68小时。其中，步骤(2)、(3)所述的培养过程中加入的中和剂为碳酸钙，控制pH为其中，葡萄糖的测定方法为，发酵液离心后稀释，采用生物传感分析仪SBA-40C(山东省科学院生物研究所)测定。生物传感分析仪SBA-40C是以固定化酶为传感器的分析仪器，葡萄糖与氧气、水在葡萄糖氧化酶的催化下生成葡萄糖酸和双氧水。反应放出的双氧水与白金一银电极接触，并产生电流信号，该电流信号与葡萄糖浓度成线性比例关系，通过测定电流信号强度可得出葡萄糖浓度。L-乳酸和D-乳酸含量采用Agilent1100液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)测定，手性分离柱(日本三菱化学公司，MCIGEL-CRS10W(3u)4.6IDX50mm，光学异体分离用)，流动相为0.002mol/L硫酸铜，流量0.5ml/min，进样量20uL，紫外检测器，检测波长254nm，操作温度25。C。L-乳酸标准品为Sigma-Aldrich公司产品，货号为L1750。D-乳酸标准品为Sigma-Aldrich公司产品，货号为L0625。在以上色谱条件下，标准品的高效液相色谱检测结果见附图1。其中，A为L-乳酸标准品高效液相色谱图，B为D-乳酸标准品高效液相色谱图，C为鼠李糖乳杆菌aacto6ac/〃wsAammwws)CASLCGMCCW2183发酵生产L-乳酸发酵液高效液相色谱图。在该色谱条件下，L-乳酸标准品的保留时间为11.566分钟，D-乳酸标准品的保留时间为9.724分钟。L-乳酸光学纯度计算方法L-乳酸光学纯度(％)二[L-乳酸浓度(克/升)一D-乳酸浓度(克/升)]+[L-乳酸浓度(克/升)屮D-乳酸浓度(克/升)]"00%转化率计算方法转化率(％)=1^乳酸浓度(克/升)+葡萄糖消耗量(克/升)xl00%下面通过实施例进一步阐明本发明。实施例1、鼠李糖乳杆菌aactotoc/〃ww/zam"oms)CASLCGMCC炝2183的分离、诱变筛选和鉴定1、菌种的分离、诱变筛选1)菌种的分离从山东济南某牛奶厂附近取得土样，称取5克土样于250ml三角瓶中，加入100ml生理盐水，充分混均后用无菌水稀释10,000倍涂布于MRS固体培养基上，4(TC培养，待长出单菌落后，部分单菌落由于产酸将菌落周围培养基中的碳酸钙溶解而形成透明圈。挑取透明圈较大的单菌落，接种于10ml发酵培养基中，4(TC静置培养72小时，测定发酵液中L-乳酸浓度，挑取一株L-乳酸产量最高的菌株，接种于MRS培养基斜面上冷藏备用。2)离子束诱变筛选将以上获得的菌株接种于MRS液体培养基中，4(TC静置培养至对数中期，离心后用生理盐水悬浮，制成菌悬液。吸取lOO)nL菌悬液涂布于直径为3.5cm的无菌空白培养皿上，涂布直径约1.5cm，无菌风吹干制成菌膜后进行离子注入，离子能量30keV，注入剂量分别为lxl0"ions/cm2、5xl014ions/cm2、10><1014ions/cm2、50><1014ions/cm2、100x10"ions/cm2。离子注入后的平皿用lmL生理盐水洗脱。各不同注入剂量分别吸取10(HiL，稀释后涂布在MRS固体培养基上，待长出单菌落后，挑选透明圈较大的菌落，接种于10ml发酵培养基中，4(TC静置培养72小时，测定发酵液中葡萄糖浓度、L-乳酸浓度和D-乳酸浓度。经过多次筛选，获得一株L-乳酸产量比离子束诱变筛选前的菌株有明显提高、L-乳酸光学纯度98X以上、转化率95%以上的菌株，即鼠李糖乳杆菌(丄a"o^c/〃^r/^mwoms)CASLCGMCCW2183，经多次传代后发酵测试，L-乳酸产量、L-乳酸光学纯度和转化率没有明显变化。鼠李糖乳杆菌aacto&ac/〃wsr/2ammw^)CASLCGMCC2183筛选中所用的MRS固体培养基为葡萄糖20克/升，酵母提取物5克/升，蛋白胨10克/升，牛肉膏10克/升，磷酸氢二钾2克/升，柠檬酸二铵2克/升，乙酸钠5克/升，吐温801毫升/升，七水硫酸镁0.58克/升，四水硫酸锰0.25克/升，碳酸钙15克/升，琼脂粉15克/升。培养基的pH值为6.5。115。C条件下灭菌20分钟。鼠李糖乳杆菌aacto^c/〃ww/zam朋ms)CASLCGMCC2183筛选中所用的MRS液体培养基为葡萄糖20克/升，酵母提取物5克/升，蛋白胨10克/升，牛肉膏10克/升，磷酸氢二钾2克/升，柠檬酸二铵2克/升，乙酸钠5克/升，吐温801毫升/升，七水硫酸镁0.58克/升，四水硫酸锰0.25克/升。培养基的pH值为6.5。115"条件下灭菌20分钟。鼠李糖乳杆菌aacto6ac/〃wCASLCGMCCW2183筛选中所用的发酵培养基为工业葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)180克/升，豆粕水解液(豆粕水解液制备方法豆粕粉(北京康明威培养基技术有限责任公司)，以lg豆粕粉5ml的2%(体积百分含量)硫酸溶液的比例进行充分混匀，9(TC水浴15小时，得到豆粕水解液)100克/升，玉米浆(上海西王淀粉糖有限公司)10克/升，碳酸钙90克/升。培养基的pH值为6.5。115'C条件下灭菌20分钟。2、菌株的鉴定按照"伯杰细菌鉴定手册"(第八版)禾n"常见细菌系统鉴定手册"(东秀珠，蔡妙英等编著，北京科学出版社，2001.2)中描述的方法，对该菌株进行形态特征观察和生理生化特性鉴定；鉴定结果表明鼠李糖乳杆菌(丄acto6ad〃MWzammww)CASLCGMCCW2183为革兰氏阳性菌，细胞长杆状，长2.5—3.5,，宽0.7—0.8pm。可利用海藻糖、山梨糖醇、葡萄糖、乳糖、核糖、纤维二糖、麦芽糖、果糖、甘露醇、松三糖、鼠李糖、半乳糖、七叶苷、甘露糖。不能利用蜜二糖、苦杏仁苷、阿拉伯糖、肌醇、棉子糖。氧化酶阴性。溶血试验阴性。能够在15。C和45X:生长。基于以上特征，将本株L-乳酸生产菌鉴定为鼠李糖乳杆菌(丄flcto^c///^CASL，并于2007年9月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCCW22183。鼠李糖乳杆菌afl"oZ)ac/〃wsr/^moms)CASLCGMCCWs2183与"乳酸细菌分类鉴定及实验方法"(凌代文主编；凌代文，东秀珠编著，北京中国轻工业出版社，1999.3)中所述的鼠李糖乳杆菌aflcto6ac/〃ztfW^m"ams)生理生化特征比较见表1。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>条件下灭菌20分钟。本发明发酵法生产L-乳酸的方法包括以下步骤(1)斜面培养将鼠李糖乳杆菌aa"o&ac/〃wsAammwz^)CASLCGMCCW2183菌种接种于固体斜面培养基上，37。C培养36小时；(2)种子培养将步骤(1)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于装有30ml种子培养基的100ml三角瓶中，37。C静置培养20小时，制得种子培养液；(3)发酵培养在装有90ml发酵培养基的300ml三角瓶中接入10ml步骤(2)的种子养液，4(TC静置培养72小时，结束发酵。其中，每隔12小时振荡搅拌一次。实验共设3次重复。发酵结束时，取发酵液，6,000转/分钟离心5分钟，取上清液，根据上述方法检测发酵液中葡萄糖浓度、L-乳酸浓度和D-乳酸浓度，计算L-乳酸光学纯度和转化率。结果表明葡萄糖的浓度为10克/升±0.5克/升，L-乳酸浓度132克/升±3克/升，转化率94.5%±0.3%，L-乳酸光学纯度98.5%±0.4%。实施例3、利用鼠李糖乳杆菌(丄acto6ac/〃M)CASLCGMCC2183在三角瓶中发酵法生产L-乳酸该实施例中所用的培养基的组成如下斜面培养基和种子培养基同实施例2。发酵培养基工业葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)150克/升，豆粕水解液(制备方法同实施例1)300克/升，碳酸钙75克/升。该培养基的初始pH为7。115°C条件下灭菌20分钟。本发明发酵法生产L-乳酸的方法包括以下步骤(1)斜面培养同实施例2;(2)种子培养同实施例2;(3)发酵培养在装有85ml发酵培养基的300ml三角瓶中接入15ml步骤(2)的种子养液，37"C静置培养65小时,结束发酵。其中，每隔12小时振荡搅拌一次。实验共设3次重复。发酵结束时，取发酵液，6,000转/分钟离心5分钟，取上清液，按照上述检测方法，检测发酵液中葡萄糖浓度、L-乳酸浓度和D-乳酸浓度，计算L-乳酸光学纯度和转化率。结果表明葡萄糖的浓度为2克/升±0.3克/升，L-乳酸浓度140克/升±4克/升，转化率95.2%±0.5%，L-乳酸光学纯度98.0%±0.2%。实施例4、利用鼠李糖乳杆菌(/^"0^"7/^^7"/^705^)CASLCGMCC在三角瓶中发酵法生产L-乳酸该实施例中所用的培养基的组成如下-斜面培养基和种子培养基同实施例2。发酵培养基工业葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)150克/升，豆粕水解液(制备方法同实施例1)220克/升，碳酸钙75克/升。该培养基的初始pH为5.5。115°C条件下灭菌20分钟。本发明发酵法生产L-乳酸的方法包括以下步骤(1)斜面培养同实施例2;(2)种子培养同实施例2;(3)发酵培养在装有95ml发酵培养基的300ml三角瓶中接入5ml步骤(2)的种子养液，4(TC静置培养50小时,结束发酵。其中，每隔12小时振荡搅拌一次。实验共设3次重复。发酵结束时，取发酵液，6,000转/分钟离心5分钟，取上清液，按照上述检测方法，检测发酵液中葡萄糖浓度、L-乳酸浓度和D-乳酸浓度，计算L-乳酸光学纯度和转化率。结果表明葡萄糖的浓度为1克/升±0.3克/升，L-乳酸浓度142克/升±2克/升，转化率95.3%±0.3%，L-乳酸光学纯度98.5%±0.5%。实施例5、利用鼠李糖乳杆菌aa"o6ac/〃ww/^mwomy)CASLCGMCCW2183在三角瓶中发酵法生产L-乳酸该实施例中所用的培养基的组成如下斜面培养基和种子培养基同实施例2。发酵培养基工业葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)180克/升，豆粕水解液(制备方法同实施例l)100克/升，玉米浆(上海西王淀粉糖有限公司)30克/升，碳酸钙90克/升。该培养基的初始pH为6。115"C条件下灭菌20分钟。本发明发酵法生产L-乳酸的方法包括以下步骤(1)斜面培养同实施例2;(2)种子培养同实施例2;(3)发酵培养在装有90ml发酵培养基的300ml三角瓶中接入10ml步骤(2)的种子养液，37'C静置培养60小时,结束发酵。其中，每隔12小时振荡搅拌一次。实验共设3次重复。发酵结束时，取发酵液，6,000转/分钟离心5分钟，取上清液，按照上述检测方法，检测发酵液中葡萄糖浓度、L-乳酸浓度和D-乳酸浓度，计算L-乳酸光学纯度和转化率。结果表明葡萄糖的浓度为8克/升±1.0克/升，L-乳酸浓度165克/升±5克/升，转化率96.0%±0.5%，L-乳酸光学纯度98.2%±0.3%。实施例6、利用鼠李糖乳杆菌(丄actoZ)ac/〃Mw/2flmwoms)CASLCGMCCW2183在三角瓶中发酵法生产L-乳酸该实施例中所用的培养基的组成如下斜面培养基和种子培养基同实施例2。发酵培养基工业葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)200克/升，豆粕水解液(制备方法同实施例l)300克/升，玉米浆(上海西王淀粉糖有限公司)10克/升，碳酸钙100克/升。该培养基的初始pH为6.5。115"C条件下灭菌20分钟。本发明发酵法生产L-乳酸的方法包括以下步骤(1)斜面培养同实施例2;(2)种子培养同实施例2;(3)发酵培养在装有85ml发酵培养基的300ml三角瓶中接入15ml步骤(2)的种子养液，35'C静置培养48小时,结束发酵。其中，每隔12小时振荡搅拌一次。实验共设3次重复。发酵结束时，取发酵液，6,000转/分钟离心5分钟，取上清液，按照上述检测方法，检测发酵液中葡萄糖浓度、L-乳酸浓度和D-乳酸浓度，计算L-乳酸光学纯度和转化率。结果表明葡萄糖的浓度为1克/升±0.5克/升，L-乳酸浓度192克/升±2克/升，转化率96.5%±0.4%，L-乳酸光学纯度97.6%±0.2%。实施例7、利用鼠李糖乳杆菌aacto&d〃"H/2flm朋my)CASLCGMCC2183在三角瓶中发酵法生产L-乳酸该实施例中所用的培养基的组成如下斜面培养基和种子培养基同实施例2。发酵培养基工业葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)150克/升(发酵初始浓度)，豆粕水解液(制备方法同实施例1)250克/升，玉米浆(上海西王淀粉糖有限公司)20克/升，碳酸钙75克/升。该培养基的初始pH为6.5。115。C条件下灭菌20分钟。本发明发酵法生产L-乳酸的方法包括以下步骤(1)斜面培养同实施例2;(2)种子培养同实施例2;(3)发酵培养在装有90ml发酵培养基的300ml三角瓶中接入10ml步骤(2)的种子养液，4CTC静置培养50小时，每隔12小时振荡搅拌一次。其中，在30小时补加8克工业葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)和4克碳酸钙。实验共设3次重复。发酵结束时，取发酵液，6,000转/分钟离心5分钟，取上清液，按照上述检测方法，检测发酵液中葡萄糖浓度、L-乳酸浓度和D-乳酸浓度，计算L-乳酸光学纯度和转化率。结果表明表明葡萄糖的浓度为2克/升±0.3克/升，L-乳酸浓度220克/升±3克/升，转化率96.3%±0.4%，L-乳酸光学纯度98.0X士0.2X。实施例8、利用鼠李糖乳杆菌afl"o&c/〃MAamw(wt^)CASLCGMCC2183在三角瓶中发酵法生产L-乳酸该实施例中所用的培养基的组成如下斜面培养基和种子培养基同实施例2。发酵培养基工业葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)150克/升，豆粕粉(北京康明威培养基技术有限责任公司)30克/升，碳酸钙75克/升。该培养基的初始pH为6.5。115"C条件下灭菌20分钟。本发明发酵法生产L-乳酸的方法包括以下步骤(1)斜面培养同实施例2;(2)种子培养同实施例2;(3)发酵培养在装有90ml发酵培养基的300ml三角瓶中接入10ml步骤(2)的种子养液，5(TC静置培养65小时,结束发酵。其中，每隔12小时振荡搅拌一次。实验共设3次重复。发酵结束时，取发酵液，6,000转/分钟离心5分钟，取上清液，按照上述检测方法，检测发酵液中葡萄糖浓度、L-乳酸浓度和D-乳酸浓度，计算L-乳酸光学纯度和转化率。结果表明葡萄糖的浓度为28克/升±0.8克/升，L-乳酸浓度115克/升±2克/升，转化率95.2%±0.5%，1^-乳酸光学纯度98.0%±0.3%。实施例9、利用鼠李糖乳杆菌aacto6ac/〃w〃/^mwom)CASLCGMCCWs2183在三角瓶中发酵法生产L-乳酸该实施例中所用的培养基的组成如下斜面培养基和种子培养基同实施例2。发酵培养基工业葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)180克/升，豆粕粉(北京康明威培养基技术有限责任公司)30克/升，蛋白酶(诺维信风味蛋白酶，Flavourzyme500MG)0.05克/升，碳酸l丐90克/升。该培养基的初始pH为7。115。C条件下灭菌20分钟。其中，蛋白酶在灭菌后加入。本发明发酵法生产L-乳酸的方法包括以下步骤(1)斜面培养同实施例2;(2)种子培养同实施例2;(3)发酵培养在装有90ml发酵培养基的300ml三角瓶中接入10ml步骤(2)的种子养液，42t:静置培养72小时，结束发酵。其中，每隔12小时振荡搅拌一次。实验共设3次重复。发酵结束时，取发酵液，6,000转/分钟离心5分钟，取上清液，按照上述检测方法，检测发酵液中葡萄糖浓度、L-乳酸浓度和D-乳酸浓度，计算L-乳酸光学纯度和转化率。结果表明葡萄糖的浓度为28克/升±0.7克/升，L-乳酸浓度145克/升±3克/升，转化率95.5%±0.3%，1^-乳酸光学纯度98.5%±0.2%。实施例10、利用鼠李糖乳杆菌aflcto6ac/〃wWzam"oms)CASLCGMCCW2183在三角瓶中发酵法生产L-乳酸该实施例中所用的培养基的组成如下斜面培养基和种子培养基同实施例2。发酵培养基工业葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)180克/升，豆粕粉(北京康明威培养基技术有限责任公司)20克/升，蛋白酶(诺维信风味蛋白酶，Flavourzyme500MG)0.1克/升，碳酸钙90克/升。该培养基的初始pH为6.5。115°C条件下灭菌20分钟。其中，蛋白酶在灭菌后加入。本发明发酵法生产L-乳酸的方法包括以下步骤(1)斜面培养同实施例2;(2)种子培养同实施例2;(3)发酵培养在装有90ml发酵培养基的300ml三角瓶中接入10ml步骤(2)的种子养液，42。C静置培养80小时，结束发酵。其中，每隔12小时振荡搅拌一次。实验共设3次重复。发酵结束时，取发酵液，6,000转/分钟离心5分钟，取上清液，按照上述检测方法，检测发酵液中葡萄糖浓度、L-乳酸浓度和D-乳酸浓度，计算L-乳酸光学纯度和转化率。结果表明葡萄糖的浓度为17克/升±0.5克/升，L-乳酸浓度156克/升±5克/升，转化率96.0%±0.3%，1^乳酸光学纯度98.2%±0.7%。实施例11、利用鼠李糖乳杆菌aacto6a"7/wAam"omy)CASLCGMCCWs2183在5升发酵罐中发酵法生产L-乳酸该实施例中所用的培养基的组成如下斜面培养基和种子培养基同实施例2。发酵培养基工业葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)180克/升，豆粕粉(北京康明威培养基技术有限责任公司)28克/升，蛋白酶(诺维信风味蛋白酶，Flavourzyme500MG)0.08克/升，碳酸钙90克/升。该培养基的初始pH为6.5。115°C条件下灭菌20分钟。其中，蛋白酶在灭菌后加入。本发明发酵法生产L-乳酸的方法包括以下步骤(1)斜面培养同实施例2;(2)种子培养将步骤(1)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于装有30ml种子培养基的100ml三角瓶中，37。C静置培养20小时；1升三角瓶中加入400ml种子培养基，将30ml种子培养液接入400ml种子培养基，37"C静置培养20小时，制得种子培养液；(3)发酵培养上海保兴BIOTECH5升发酵罐中加入3.6升发酵培养基，在发酵培养基中接入400ml种子培养液，45。C静置培养72小时,结束发酵。其中，每隔12小时搅拌一次。搅拌转速30转/分，旋转半径为33mm，搅拌时间40分钟。实验共设3次重复。发酵结束时，取发酵液，6,000转/分钟离心5分钟，取上清液，按照上述检测方法，检测发酵液中葡萄糖浓度、L-乳酸浓度和D-乳酸浓度，计算L-乳酸光学纯度和转化率。结果表明葡萄糖的浓度为10克/升±0.6克/升，L-乳酸浓度160克/升±4克/升，转化率94.8%±0.4%，匸乳酸光学纯度98.7%±0.3%。实施例12、利用鼠李糖乳杆菌aactokc/〃w^amwas^)CASLCGMCCWs2183在5升发酵罐中发酵法生产L-乳酸该实施例中所用的培养基的组成如下斜面培养基和种子培养基同实施例2。发酵培养基工业葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)200克/升(发酵初始浓度)，豆粕水解液(制备方法同实施例1)230克/升，玉米浆(上海西王淀粉糖有限公司)22克/升，碳酸钙100克/升。该培养基的初始pH为6.5。115。C条件下灭菌20分钟。本发明发酵法生产L-乳酸的方法包括以下步骤(1)斜面培养同实施例2;(2)种子培养同实施例11;(3)发酵培养上海保兴BIOTECH5升发酵罐中加入3.6升发酵培养基，在发酵培养基中接入400ml种子培养液，4(TC静置培养60小时。其中，每隔12小时搅拌一次。搅拌转速50转/分，旋转半径为33mm，搅拌时间30分钟。其中，在40小时补加200克工业葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)和IOO克碳酸钙。实验共设3次重复。发酵结束时，取发酵液，6,000转/分钟离心5分钟，取上清液，按照上述检测方法，检测发酵液中葡萄糖浓度、L-乳酸浓度和D-乳酸浓度，计算L-乳酸光学纯度和转化率。结果表明葡萄糖的浓度为3克/升±0.4克/升，L-乳酸浓度235克/升±3克/升，转化率95.2%±0.3%，L-乳酸光学纯度97.9%±0.5%。发酵液高效液相色谱检测结果见附图1。其中C为鼠李糖乳杆菌(Za"o/^"W^rAgyzmo^^)CASLCGMCCN22183发酵生产L-乳酸发酵液高效液相色谱图。鼠李糖乳杆菌aacto6ac/〃wsWzam"o^w)CASLCGMCCW2183发酵过程曲线见附图2。实施例13、利用鼠李糖乳杆菌aacto^c///^AammwM)CASLCGMCC2183在30升发酵罐中发酵法生产L-乳酸该实施例中所用的培养基的组成如下斜面培养基和种子培养基同实施例2。发酵培养基工业葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)200克/升，豆粕水解液(制备方法同实施例1)200克/升，玉米浆(上海西王淀粉糖有限公司)30克/升，碳酸钙100克/升。该培养基的初始pH为6.5。115t:条件下灭菌20分钟。本发明发酵法生产L-乳酸的方法包括以下步骤(1)斜面培养同实施例2;(2)种子培养将步骤(1)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于装有30ml种子培养基的100ml三角瓶中，37。C静置培养20小时；1升三角瓶中加入400ml种子培养基，将30ml种子培养液接入400ml种子培养基，37。C静止培养20小时；5升三角瓶中加入2升种子培养基，将400ml种子培养液接入2升种子培养基，37°C静置培养20小时，制得种子培养液；(3)发酵培养上海保兴BIOTECH30升发酵罐中加入18升发酵培养基，在发酵培养基中接入2升种子培养液，42。C静置培养48小时,其中，每隔12小时搅拌一次，搅拌转速50转/分，旋转半径为42mm，搅拌时间30分钟。实验共设3次重复。发酵结束时，取发酵液，6,000转/分钟离心5分钟，取上清液，按照上述检测方法，检测发酵液中葡萄糖浓度、L-乳酸浓度和D-乳酸浓度，计算L-乳酸光学纯度和转化率。结果表明葡萄糖的浓度为9克/升±0.3克/升，L-乳酸浓度182克/升±4克/升，转化率95.3%±0.4%，L-乳酸光学纯度98.3%±0.3%。实施例14、利用鼠李糖乳杆菌aactoZ)flc/〃^r/^m"ay^)CASLCGMCCW2183在30升发酵罐中发酵法生产L-乳酸该实施例中所用的培养基的组成如下斜面培养基和种子培养基同实施例2。发酵培养基工业葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)200克/升(发酵初始浓度)，豆粕水解液(制备方法同实施例1)230克/升，玉米浆(上海西王淀粉糖有限公司)25克/升，碳酸钙100克/升。该培养基的初始pH为6.5。115。C条件下灭菌20分钟。本发明发酵法生产L-乳酸的方法包括以下步骤(1)斜面培养同实施例2;(2)种子培养同实施例13;(3)发酵培养上海保兴BIOTECH30升发酵罐中加入18升发酵培养基，在发酵培养基中接入2升种子培养液，37t:静置培养68小时,其中，每隔12小时搅拌一次，搅拌转速100转/分，旋转半径为42mm，搅拌时间20分钟。其中，在48小时补加1000克工业葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)和500克碳酸钙。实验共设3次重复。发酵结束时，取发酵液，6,000转/分钟离心5分钟，取上清液，按照上述检测方法，检测发酵液中葡萄糖浓度、L-乳酸浓度和D-乳酸浓度，计算L-乳酸光学纯度和转化率。结果表明葡萄糖的浓度为15克/升±0.6克/升，L-乳酸浓度226克/升±3克/升，转化率96.3%±0.5%，L-乳酸光学纯度98.0X土0.3X。权利要求1、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)CASL，其保藏号为CGMCC№2183。2、一种生产L-乳酸的方法，是发酵鼠李糖乳杆菌(丄acto6ac/〃wsAam"w^)CASLCGMCC処2183得到L-乳酸。3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述鼠李糖乳杆菌aacto^c/〃wA函朋ms)CASLCGMCCWs2183的发酵培养基中含有碳源、氮源和用于控制发酵液pH的中和剂；所述发酵培养基中的碳源为葡萄糖150—200克/升；所述发酵培养基中的氮源为下述l)至3)中的任意一种1)豆粕水解液100—300克/升，优选为220克/升；2)豆粕粉20—30克/升；3)豆粕水解液100—300克/升，玉米浆10—30克/升。4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于当所述发酵培养基中的氮源为豆粕粉时，所述发酵培养基中还可含有0.05—0.1克/升的蛋白酶。5、根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述发酵培养基中的中和剂为碳酸钙，所述碳酸钙的浓度为75—100克/升，优选为90克/升。6、根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述发酵培养基的pH为5.5一7。7、根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述发酵条件为35—5(TC培养48—80小时。8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述发酵条件为35—45'C培养50一68小时。9、根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述发酵的培养方式在三角瓶中采用间歇振动培养，发酵罐中采用间歇搅拌培养，间隔时间均为12小时，所述搅拌的转速为30—100转/分钟，旋转半径为33或42mm，搅拌时间为20—40分钟。10、根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述搅拌转速为50转/分钟；搅拌时间为30分钟。全文摘要本发明公开了一种生产L-乳酸的方法及其专用鼠李糖乳杆菌。本发明所提供的鼠李糖乳杆菌是鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)CASLCGMCC№2183。培养鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)CASLCGMCC№2183即可得到L-乳酸。该菌株的发酵培养基中含有碳源、氮源和用于控制发酵液pH的中和剂；所述碳源为葡萄糖150-200克/升(发酵初始浓度)；所述氮源为豆粕水解液、豆粕水解液+玉米浆或豆粕粉；当所述氮源为豆粕粉时，还可含有蛋白酶0.05-0.1克/升；所述中和剂为碳酸钙75-100克/升，余量为水，该发酵培养基的pH为5.5-7。鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)CASLCGMCC№2183，以葡萄糖为底物，在35℃-45℃条件下以94.5％-96.5％的转化率，生产光学纯度97.6％-98.7％的L-乳酸，其浓度最高可达235克/升。文档编号C12N1/20GK101173241SQ20071017605公开日2008年5月7日申请日期2007年10月18日优先权日2007年10月18日发明者帅周,秦加阳,平许,博赵,马翠卿申请人:中国科学院微生物研究所