专利名称：一种生产l-乳酸的方法及其专用凝结芽孢杆菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生产L-乳酸的方法及其专用凝结芽孢杆菌。
背景技术：
乳酸(Lactic Acid)又名二羟基丙酸，是世界三大有机酸之一，广泛应用于 食品、化妆、制药、纺织和化学工业上。由乳酸制成的聚乳酸具有良好的生物相容 性和生物可降解性，可制成医用缓释材料、生物可降解纤维和生物可降解塑料等， 并有望在不久的将来取代石油基塑料。近年来，由于石油资源的日渐短缺和人们环 保意识的逐渐增强，围绕聚乳酸的研究也越来越多，作为聚乳酸单体的乳酸的需求 也越来越迫切。乳酸是一种手性分子，可分为L-乳酸、D-乳酸和DL-乳酸。在聚乳 酸的生产过程中，聚乳酸的物理性质和稳定性主要受L-乳酸和D-乳酸的组成所影 响，因此在聚合反应中需要高纯度的L-乳酸和D-乳酸。
乳酸的生产方法主要有化学合成法、酶合成法和发酵法三种。其中，化学法直 接合成的乳酸为DL-乳酸，若要得到D-乳酸或L-乳酸则需进行光学拆分，而且由于 合成法所用的原料是乙醛和剧毒物氢氰酸，合成乳酸应用于食品不能被广泛接受， 此外其生产成本也较高。酶法生产可以专一性地得到光学纯乳酸，但生产过程比较 复杂，尚未广泛应用于工业化生产。微生物发酵法生产乳酸，可通过菌种和培养条 件的选择而获得D-乳酸、L-乳酸或是两者一定比例的混合物，能以淀粉、纤维素等 可再生资源为原料发酵生产乳酸，生产成本低，产品安全性高，是生产乳酸的主要 方法。
目前成功应用于乳酸发酵的微生物主要有两类， 一类是霉菌中的米根霉，另一 类是细菌中的乳杆菌。米根霉生产乳酸是好氧发酵，而乳杆菌可厌氧或微好氧发酵 生产乳酸，这两类菌株的共同特点是发酵生产乳酸的温度一般在30 42t:，容易污 染DL-乳酸生产菌(如植物乳杆菌)，因此需要对发酵液进行灭菌，造成能量的浪 费和营养成分的损失。
嗜热的芽孢杆菌是一种新的可用于L-乳酸发酵生产的微生物。由于具有较高的 发酵温度(45 6(TC)，大大减少了发酵过程中污染杂菌的机会，提高了L-乳酸的 光学纯度。同时，以较高的温度进行发酵，可降低发酵液粘度，有利于后续处理步
骤的操作，可以在培养基不灭菌的条件下进行发酵生产，降低了能耗和L-乳酸的生 产成本，并为以淀粉为基质同步糖化发酵生产乳酸提供了基础。
在专利USP 5079164中曾经利用嗜热的凝结芽孢杆菌(SacW7iAs coa^/h/ sDSM 5196)进行发酵，但发酵的转化率较低，19%的初糖仅得到14%的乳酸。专利USP 7183088 B2和CN 1498265 A提到利用另外一株凝结芽孢杆菌(SaciWws coa^/7a/Ls SIM-7 DSM 14043)进行L-乳酸生产，但产酸的速率较低，发酵98小时，产酸12. 3 %，转化率95. 5%。
发明内容
本发明的一个目的是提供一株产L-乳酸的凝结芽孢杆菌(5s"W^
本发明所提供的凝结芽孢杆菌(fe 77m coa^/7^s)菌株CASH从北京门头 沟区的某牛奶厂附近土壤中筛选并诱变得到，已于2007年09月24日保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区 大屯路)，保藏登记号为CGMCC Nq2184。
凝结芽孢杆菌(^aci"ws co3卵7朋s) CASH CGMCC N22184革兰氏阳性，长杆 状细胞，细胞能运动，形成近端卵形内生孢子。其菌落为圆形、凸起、有光泽、透 明、表面光滑、干燥、直径2 3mm。它可利用葡萄糖、麦芽糖、果糖、阿拉伯糖、 糊精以及p-环糊精产酸不产气，不能利用木糖、乳糖、棉子糖、甘露醇和山梨醇， 不能利用丙酸盐，接触酶阳性，不能水解明胶，不产生吲哚，可耐受0.02%的叠氮 化物，在有0.01X的溶菌酶时不能生长，专性同型乳酸发酵生产L-乳酸。其16S rDNA 序列(序列表中的序列l)与多株凝结芽孢杆菌的16S r丽A序列比对相似性达到 99%。
本发明的第二个目的是提供一种利用凝结芽孢杆菌(v^c^7w5" cos^/7朋s)CASH CGMCC Na2184生产L-乳酸的方法。
本发明所提供的生产L-乳酸的方法，是发酵凝结芽孢杆菌(^s"1/m c朋卵7朋s) CASH CGMCC Na2184得到L-乳酸。
所述凝结芽孢杆菌(5aci7仂s co3^/7朋s) CASH CGMCC Ns2184的发酵培养基 每升中可含有以下五种氮源中的至少一种酵母粉5 15克，蛋白胨5 15克，大 豆肽5 15克，大豆蛋白胨5 15克，棉籽蛋白10 20克。另外每升发酵培养基 中还含有葡萄糖80 170克，用于调控发酵液pH的中和剂，余量为水；所述发酵培养基的pH为5.5 7。该发酵培养基不需灭菌。
其中，所述中和剂为碳酸钙，所述发酵培养基中每升含有50 100克。 所述发酵培养基的PH具体可为5. 5 6. 5。
所述凝结芽孢杆菌(&"77ws cosgW朋s) CASH CGMCC Ns2184的发酵条件具 体可为45。C 60。C培养18 60小时，如50 55。C培养18 48小时。
所述方法中，还可将凝结芽孢杆菌(5aci^iAscoa《〃7朋s) CASHCGMCC N22184 先接入如下种子培养基中，在45 6(TC培养6 8小时，再接入所述发酵培养基； 所述种子培养基每升中含有葡萄糖60 80克，酵母粉10 15克，大豆蛋白胨5 8克，碳酸钙30 40克，余量为水；所述种子培养基的pH为5. 5 6。
所述发酵的培养方式具体可为搅拌培养，搅拌转速为200 300转/分钟，旋转 半径为33mm。
本发明的凝结芽孢杆菌(5aci"^ coa^/2朋s) CASH CGMCC Na2184以葡萄糖 为底物，在45 6(TC条件下以98 99%的糖酸转化率高效发酵生产光学纯度99% 以上的L-乳酸，其中L-乳酸浓度最高可达190克/升，体积生产效率最高可达5. 7 克/升/小时。
本发明的生产L-乳酸的方法，利用高温发酵过程的优势，污染杂菌的机率小， 可不对发酵培养基进行灭菌，减少了能量的消耗和营养物质的损失。
图1为凝结芽孢杆菌(^3ci"^ coa^/2朋s) CASH CGMCC Ns2184发酵生产L-乳酸过程中葡萄糖和L-乳酸的变化曲线。
图2为凝结芽孢杆菌(^3cj77"s c朋卵^"s) CASH CGMCC Na2184发酵生产L-乳酸所得发酵液以及D-乳酸和L-乳酸标准品在液相手性柱下的色谱图。A为L-乳 酸标准品，B为D-乳酸标准品，C为发酵液样品。
具体实施例方式
本发明的利用凝结芽孢杆菌(万scj7〗〃s coa^/7朋s) CASH CGMCC Na2184发酵 生产L-乳酸方法中涉及的步骤顺序如下
(1) 斜面培养将凝结芽孢杆菌(Sa""m coa卵7a"s) CASH CGMCC Nq2184 菌种接种于含有1. 5 2. Og/100ml的琼脂的固体斜面培养基上，培养温度45 60 °C，培养时间8 12小时；
(2) 种子培养用步骤(1)的斜面培养物，在无菌条件下接种到种子培养基
中，培养温度45 6(TC，培养方式为利用漩涡式摇床培养，转速120转/分钟，培 养时间6 8小时；
(3) 发酵培养以5 10%的体积比的接种量，将种子培养液接入发酵培养基， 培养温度45 6(TC，培养方式为搅拌培养，搅拌转速200 300转/分钟，培养时间 18 60小时，制得含有L-乳酸的发酵培养液；
(4) 处理样品取发酵液先加热至80 10(TC，再6，000转/分钟离心5分钟， 取上清液；
(5) 样品检测取上清液稀释，检测葡萄糖含量和L-乳酸、D-乳酸含量； 其中，步骤(1) 、 (2) 、 (3)中所述的菌体培养温度优选是50 55t:。 其中，步骤(1)中所述的菌体培养时间优选是9 10小时。
其中，步骤(2)中所述的菌体培养时间优选是6 7小时。
其中，步骤(3)中所述的菌体培养时间优选是18 48小时。
其中，步骤(2) 、 (3)中所述的菌体培养加入碳酸钙控制pH为5.5 6。
下面通过实施例进一步阐明本发明。
实施例1、凝结芽孢杆菌(万aci"z/s cos卵7朋s) CASH CGMCC Na2184的分离 诱变筛选及鉴定
1、分离诱变筛选
该实施例中所用的培养基的组成如下
营养液体培养基葡萄糖150克/升，酵母粉10克/升，碳酸钙50克/升，pH 为6。
营养琼脂培养基葡萄糖50克/升，酵母粉10克/升，碳酸钙20克/升，琼脂
粉10克/升，pH为6。
发酵培养基葡萄糖150克/升，酵母粉20克/升，碳酸钙90克/升，pH为6。 营养肉汤培养基葡萄糖50克/升，酵母粉10克/升，碳酸钙10克/升，pH为6。
该实施例的具体操作过程如下
从北京门头沟区的某牛奶厂附近取得土样，每2克土样放入50ml营养液体培 养基中，55。C富集培养6 10小时。然后稀释涂布到含营养琼脂培养基的培养皿中， 55"C培养24小时。待长出单菌落后，挑选菌落面积和透明圈面积大的菌落，接种
到发酵培养基中，55t:静置培养48小时，测定L-乳酸的产量，挑选产量最高的菌 株，用于下一步离子束诱变。
将初步挑选的菌株在营养琼脂培养皿上划线培养，挑出单菌落，接种于营养肉 汤培养基中，55i:静置培养至对数中期，用生理盐水洗涤后悬浮，制成菌悬液。吸 取100y L涂布于直径为3. 5cm的无菌空白培养皿上，涂布直径约1. 5cm，无菌风吹 干制成菌膜后进行离子注入，离子能量30keV，注入剂量分别为1X1014 ions/cm2、 5X10" ions/cm2、 10X1014 ions/cm2、 50X10" ions/cra2、 100X10" ions/cm2。离 子注入后的平皿用lmL生理盐水洗脱。各不同注入剂量分别吸取100y L，分别接入 含5% (5g/100ml) L-乳酸钠的营养液体培养基中，55"C静置培养24小时，只有注 入剂量为10X10"ions/cr^的培养液出现浑浊，稀释该培养液，涂布在营养琼脂培 养皿中，待长出单菌落后，挑选菌落面积和透明圈面积大的菌落，接种到发酵培养 基中，55。C静置培养48小时，测定L-乳酸的产量，挑选产量最高的菌株。最终得 到产量最高的菌株凝结芽孢杆菌(AscW7ws coa^/73/2s) CASH CGMCC Na2184。
2、菌株的鉴定
根据"伯杰系统鉴定手册(第八版)"和"常见细菌系统鉴定手册"(科学出 版社)提供的鉴定方法对该菌株进行鉴定，鉴定结果表明凝结芽孢杆菌(万s"Wm co3卵2a/^) ASHCGMCCNs2184为革兰氏阳性，长杆状细胞，细胞能运动，形成近 端卵形内生孢子。其菌落为圆形、凸起、有光泽、透明、表面光滑、干燥、直径2 3 mm。它可利用葡萄糖、麦芽糖、果糖、阿拉伯糖、糊精以及P-环糊精产酸不产 气，不能利用木糖、乳糖、棉子糖、甘露醇和山梨醇，不能利用丙酸盐，接触酶阳 性，不能水解明胶，不产生吲哚，可耐受0.02%的叠氮化物，在有0.01%的溶菌 酶时不能生长，专性同型乳酸发酵生产L-乳酸。其16S rDNA序列(序列表中的序 列1)与多株凝结芽孢杆菌的16S rDNA序列比对相似性达到99%。
基于以上特征，将本株L-乳酸生产菌鉴定为凝结芽孢乳杆菌(^fe^7^/s c^^/7朋s)，并将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保 藏号为CGMCC Na2184。
实施例2、利用凝结芽孢杆菌(万s"W"s coa卵7朋s) CASH CGMCC Na2184在 三角瓶中发酵生产L-乳酸
该实施例中所用的培养基的组成如下
斜面培养基葡萄糖20克/升，酵母提取物5克/升，蛋白胨10克/升，牛肉
膏10克/升，七水合硫酸镁0.58克/升，四水合硫酸锰0.25克/升，碳酸钙15克/ 升，琼脂粉15克/升。该培养基的初始pH为6.5。 115'C灭菌20分钟。
种子培养基葡萄糖70克/升，酵母粉10克/升，大豆蛋白胨5克/升，碳酸 钙30克/升。该培养基的初始pH为6.5。 115"C条件下灭菌20分钟。
发酵培养基葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)170克/升，酵母粉(北京奥 博星生物技术责任有限公司，商品目录号01 — 013) 15克/升，碳酸钙80克/升。 该发酵培养基的初始pH为6.5。不灭菌。
该发酵生产L-乳酸的方法包括以下步骤-
(1) 斜面培养将凝结芽孢杆菌(5aci7"s coa《"7朋s) CASH CGMCC N22184 菌种接种于斜面培养基上，5(TC条件下，静止培养10小时；
(2) 种子培养将步骤(1)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1环于装 有30ml种子培养基的100ml三角瓶中，5(TC条件下，摇床培养6小时，转速120 转/分钟(13mm旋转半径)，制得种子液；
(3) 发酵培养在装有100ml发酵培养基的300ml三角瓶中接入10ml步骤(2) 的种子养液，5(TC条件下，摇床培养39小时，结束发酵，该摇床的转速为120转/ 分钟a3mm旋转半径)。实验共设50次重复。每3个小时取发酵液，先加热至80 IO(TC，再6， 000转/分钟离心5分钟，取上清液检测发酵液中L-乳酸浓度、D-乳酸 浓度、葡萄糖浓度，计算糖酸转化率、体积生产效率和L-乳酸光学纯度。
其中，葡萄糖的测定方法为，发酵液稀释后离心，采用生物传感分析仪SBA-40C (山东省科学院)测定。
L-乳酸和D-乳酸含量的测定方法为，采用Agilent IIOO液相色谱仪，配备手 性分离柱(日本三菱化学公司，MCI GEL-CRS10 W(3u) 4.6 IDX50mm，光学异体 分离用)。具体操作条件为0.002mol/L硫酸铜作为流动相，流量0.5ml/min，进 样量20uL，紫外检测器，检测波长254nra，操作温度25。C。利用L-乳酸和D-乳酸 标准品做出标准曲线，再根据标准曲线计算出发酵液中L-乳酸和D-乳酸的含量。
本发明中，作为标准品的D-乳酸为德国Sigma-Aldrich公司的产品，其货号为 L0625-25MG;作为标准品的L-乳酸为德国Sigma-Aldrich公司的产品，其货号为 L1750-IOG。在如上色谱条件下，D-乳酸保留时间为10. 150分钟，L-乳酸保留时间 为12.293分钟。L-乳酸标准品、D-乳酸标准品和发酵液的色谱图见附图2。
光学纯度(optical purity)是衡量旋光性样品中一个对映体超过另一个对映体的量的量度，它可用对映体过量值(enantiomeric excess)表示。本发明中L-
乳酸的光学纯度按以下公式计算(L-乳酸含量一D-乳酸含量)+ (L-乳酸含量+D-
乳酸含量)X100X。
糖酸转化率定义为L-乳酸产量(克/升)+葡萄糖的消耗量(克/升)X100X。 体积生产效率定义为L-乳酸产量(克/升)+发酵时间(小时)。 发酵结束后，葡萄糖的浓度为2.3克/升±0.5克/升(平均值士标准差)，L-
乳酸浓度165. 1克/升±1.0克/升(平均值土标准差)，糖酸转化率98.5%±0.6
% (平均值土标准差)，体积生产效率4.2克/升/小时±0.3克/升/小时(平均值
士标准差)，卜乳酸光学纯度99.3%±0. 3% (平均值士标准差)。
实施例3、利用凝结芽孢杆菌(AacW7ws co3^Wa/^) CASH CGMCC Na2184在
三角瓶中发酵生产L-乳酸
凝结芽孢杆菌(AaciWwsco^Wa;^) CASH CGMCC Ns2184的培养温度为55°C。
发酵培养基的组成为葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)118克/升，大豆蛋白胨 (北京奥博星生物技术责任有限公司，商品目录号01 — 004) 15克/升，碳酸钙80
克/升。该发酵培养基的初始pH为5. 5。发酵时间是24小时。其它方法均与实施例
2相同。
发酵结束，葡萄糖的浓度为3.2克/升±1. l克/升(平均值土标准差)，L-乳 酸浓度113.5克/升±1.9克/升(平均值士标准差)，糖酸转化率98.9%±0.3% (平均值土标准差)，体积生产效率4.7克/升/小时±0.2克/升/小时(平均值土 标准差)，卜乳酸光学纯度99.3%±0.2% (平均值土标准差)。
实施例4、利用凝结芽孢杆菌(万aci"^ co3^/2朋s) CASH CGMCC他2184在 三角瓶中发酵生产L-乳酸
凝结芽孢杆菌(jS3ci77wsco3gw7a; s) CASH CGMCC N22184的培养温度为60°C 。 发酵培养基的组成为葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)83克/升，大豆肽(哈 尔滨乐能生物工程股份有限公司，乐能大豆蛋白肽3#粉)15克/升，碳酸l丐80克 /升。该发酵培养基的初始pH为5.5。发酵时间是24小时。其它方法均与实施例2 相同。
发酵结束，葡萄糖的浓度为2. 1克/升±0.5克/升(平均值士标准差)，L-乳 酸浓度79. 0克/升± 1. 5克/升(平均值±标准差)，糖酸转化率98. 8。％ ± 0. 3 % (平 均值士标准差)，体积生产效率3.3克/升/小时±0.2克/升/小时(平均值士标准
差)，L-乳酸光学纯度99. 1%±0. 1% (平均值士标准差)。
实施例5、利用凝结芽孢杆菌(^a""i/s coa卵7朋s) CASH CGMCC Na2184在 三角瓶中发酵生产L-乳酸
凝结芽孢杆菌(fecj77i/scoa卵7朋s) CASHCGMCCNa2184的培养温度为45°C。 发酵培养基的组成为葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)120克/升，棉籽蛋白(北 京康明威培养基技术有限责任公司)20克/升，碳酸钙80克/升。该发酵培养基的 初始pH为6。发酵时间是27小时。其它方法均与实施例2相同。
发酵结束，葡萄糖的浓度为2.5克/升±0.6克/升(平均值士标准差)，L-乳 酸浓度116.0克/升±1.5克/升(平均值土标准差)，糖酸转化率98.7%±0.4% (平均值土标准差)，体积生产效率4.3克/升/小时±0.3克/升/小时(平均值土 标准差)，L-乳酸光学纯度99.2%±0.2% (平均值士标准差)。
实施例6、利用凝结芽孢杆菌(&ciL^s co3^/7a^s) CASH CGMCC Na2184在 三角瓶中发酵生产L-乳酸
凝结芽孢杆菌(^aciW^ c朋卵7朋s) CASH CGMCC Na2184的发酵培养基的组 成为葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)118克/升，蛋白胨(北京奥博星生物技 术责任有限公司，商品目录号01 — 001 — 2) 15克/升，碳酸钙80克/升。该发酵培 养基的初始pH为7。发酵时间是28小时。其它方法均与实施例2相同。
发酵结束，葡萄糖的浓度为2.7克/升±0.3克/升(平均值土标准差)，L-乳 酸浓度113.5克/升±1.7克/升(平均值士标准差)，糖酸转化率98.5%±0.4% (平均值土标准差)，体积生产效率4.1克/升/小时±0.2克/升/小时(平均值土 标准差)，卜乳酸光学纯度99.3%±0.2% (平均值土标准差)。
实施例7、利用凝结芽孢杆菌(&d'"ws coa^^朋s) CASH CGMCC Na2184在5 升发酵罐中发酵生产L-乳酸
该实施例中所用的培养基的组成如下
斜面培养基葡萄糖20克/升，酵母提取物5克/升，蛋白胨10克/升，牛肉 膏10克/升，七水合硫酸镁0.58克/升，四水合硫酸锰0.25克/升，碳酸l丐15克/ 升，琼脂粉15克/升。该培养基的初始pH为6.5。 115。C灭菌20分钟。
种子培养基葡萄糖70克/升，酵母粉10克/升，大豆蛋白胨5克/升，碳酸 钙30克/升。该培养基的初始pH为6.5。 115。C条件下灭菌20分钟。
发酵培养基葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)125克/升，酵母粉(北京奥博星生物技术责任有限公司，商品目录号01 — 013) 9.8克/升，大豆蛋白胨(北京 奥博星生物技术责任有限公司，商品目录号01—004) 5克/升，碳酸钙100克/升。 该发酵培养基的初始pH为6.5。不灭菌。
该发酵生产L-乳酸的方法包括以下步骤
(1) 斜面培养将凝结芽孢杆菌(&ciWiAs c朋gw2朋s) CASH CGMCC Nq2184 菌种接种于斜面培养基上，5CTC条件下，静止培养10小时；
(2) 种子培养将步骤(1)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于装 有100ml种子培养基的300ml三角瓶中，50。C条件下，摇床培养6小时，转速120 转/分钟(13mm旋转半径)，制得种子液；
(3) 发酵培养德国贝朗(BIOSTAT B， B. Braun) 5升发酵罐中加入3升发 酵培养基。在发酵培养基中接入300ml种子培养液，发酵罐搅拌转速200转/分钟
(33mm旋转半径)，50。C条件下发酵21小时。实验共设10次重复。按照实施例2 的方法每3个小时取发酵液，先加热至80 10(TC，再6，000转/分钟离心5分钟， 取上清液检测发酵液中L-乳酸浓度、D-乳酸浓度、葡萄糖浓度，计算糖酸转化率、 体积生产效率和L-乳酸光学纯度。
发酵结束后，葡萄糖的浓度为3.4克/升±0.6克/升(平均值土标准差)，L-乳酸浓度120克/升±1.8克/升(平均值土标准差)，糖酸转化率99.0% ±0.5% (平均值士标准差)，体积生产效率5.7克/升/小时±0.4克/升/小时(平均值士 标准差)，卜乳酸光学纯度99.2%±0. 1% (平均值士标准差)。
实施例8、利用凝结芽孢杆菌(&ci"^ co3^^朋s) CASH CGMCC Na2184在5 升发酵罐中发酵生产L-乳酸
该实施例中所用的培养基的组成如下
斜面培养基葡萄糖20克/升，酵母提取物5克/升，蛋白胨10克/升，牛肉 膏10克/升，七水合硫酸镁0.58克/升，四水合硫酸锰0.25克/升，碳酸钙15克/ 升，琼脂粉15克/升。该培养基的初始pH为6.5。 115。C灭菌20分钟。
种子培养基葡萄糖70克/升，酵母粉10克/升，大豆蛋白胨5克/升，碳酸 钙30克/升。该培养基的初始pH为6.5。 115。C条件下灭菌20分钟。
发酵初始培养基葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)122克/升，蛋白胨(北 京奥博星生物技术责任有限公司，商品目录号01 —001 — 2) 5克/升，大豆肽(哈 尔滨乐能生物工程股份有限公司，乐能大豆蛋白肽3#粉)12.8克/升，碳酸i丐IOO
克/升。该发酵培养基的初始pH为6.5。不灭菌。
该发酵生产L-乳酸的方法包括以下步骤
(1) 斜面培养将凝结芽孢杆菌(feci"ws coa卵7朋s) CASH CGMCC Ns2184 菌种接种于斜面培养基上，55。C条件下，静止培养10小时；
(2) 种子培养将步骤(1)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于装 有100ml种子培养基的300ml三角瓶中，55。C条件下，摇床培养6小时，转速120 转/分钟(13rara旋转半径)，制得种子液；
(3) 发酵培养德国贝朗(BIOSTAT B， B. Braun) 5升发酵罐中加入3升发 酵初始培养基。在发酵培养基中接入300ml种子培养液，发酵罐搅拌转速200转/ 分钟(33mm旋转半径)，55。C条件下共发酵39小时。其中，发酵到15小时(经检 测，此时发酵液中葡萄糖的浓度为30克/升)，按照每升发酵液中补加42克葡萄 糖的量补加葡萄糖，即每个发酵罐中再加入126克葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公 司)。实验共设10次重复。按照实施例2的方法取发酵液，先加热至80 10(TC， 再6,000转/分钟离心5分钟，取上清液检测发酵液中L-乳酸浓度、D-乳酸浓度、 葡萄糖浓度，计算糖酸转化率、体积生产效率和L-乳酸光学纯度。
结果表明发酵结束后，葡萄糖的浓度为4.6克/升±0.7克/升(平均值土标准 差)，L-乳酸浓度160克/升±3.2克/升(平均值士标准差)，糖酸转化率98.5% ±0.4% (平均值土标准差)，体积生产效率4. 1克/升/小时±0.3克/升/小时(平 均值土标准差)，卜乳酸光学纯度99.2%±0.2% (平均值士标准差)。
实施例9、利用凝结芽孢杆菌(&""ws c朋卵h/Ls) CASH CGMCC N22184在5 升发酵罐中发酵生产L-乳酸
凝结芽孢杆菌(^3cj77wscm卵^3/js) CASHCGMCC Ns2184的培养温度为60°C， 发酵培养基的配方为葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)83克/升，酵母粉(北 京奥博星生物技术责任有限公司，商品目录号01 — 013) 10克/升，大豆肽(哈尔 滨乐能生物工程股份有限公司，乐能大豆蛋白肽3#粉)5克/升，碳酸钙80克/升。 该发酵培养基的初始pH为7。发酵时间是18小时。其它方法均与实施例7相同。
结果表明发酵结束后，葡萄糖的浓度为3.2克/升±0.4克/升(平均值士标准 差)，L-乳酸浓度为78.5克/升±0.9克/升(平均值土标准差)，糖酸转化率为 98. 4% ±0.3。％ (平均值土标准差)，体积生产效率4.4克/升/小时±0. 1克/升/ 小时(平均值士标准差)，卜乳酸光学纯度为99.2%±0. 1% (平均值士标准差)。 实施例10、利用凝结芽孢杆菌(万scj77m co3卵J朋s) CASH CGMCC Ns2184在 5升发酵罐中发酵生产L-乳酸
该实施例中所用的培养基的组成如下
斜面培养基葡萄糖20克/升，酵母提取物5克/升，蛋白胨10克/升，牛肉 膏10克/升，七水合硫酸镁0.58克/升，四水合硫酸锰0.25克/升，碳酸钙15克/ 升，琼脂粉15克/升。该培养基的初始pH为6.5。 115'C灭菌20分钟。
种子培养基葡萄糖70克/升，酵母粉10克/升，大豆蛋白胨5克/升，碳酸 钙30克/升。该培养基的初始pH为6.5。 115'C条件下灭菌20分钟。
发酵初始培养基葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)122克/升，酵母粉(北 京奥博星生物技术责任有限公司，商品目录号01—013) 5克/升，棉籽蛋白(北京 康明威培养基技术有限责任公司)20克/升，碳酸钙100克/升。该发酵培养基的初 始pH为6.5。不灭菌。
该发酵生产L-乳酸的方法包括以下步骤
(1) 斜面培养将凝结芽孢杆菌(fed7Jws co3卵7a/Ls) CASH CGMCC Ns2184 菌种接种于斜面培养基上，55"C条件下，静止培养10小时；
(2) 种子培养将步骤(1)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于装 有100ml种子培养基的300ml三角瓶中，55"C条件下，摇床培养6小时，转速120 转/分钟(13rara旋转半径)，制得种子液；
(3) 发酵培养德国贝朗(BIOSTAT B, B. Braim) 5升发酵罐中加入3升发 酵初始培养基。在发酵培养基中接入300ral种子培养液，发酵罐搅拌转速300转/ 分钟(33mm旋转半径)，55。C条件下共发酵48小时。其中，发酵到18小时(经检 测，此时发酵液中葡萄糖的浓度为16克/升)，按照每升发酵液中补加76克葡萄 糖的量补加葡萄糖、按照每升发酵液中补加3克酵母粉的量补加酵母粉、按照每升 发酵液中补加6克棉籽蛋白的量补加棉籽蛋白和按照每升发酵液中补加30克碳酸 钙的量补加碳酸钙；即每个发酵罐中再加入228克葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公 司)、9克酵母粉(北京奥博星生物技术责任有限公司，商品目录号01—013)、 18克棉籽蛋白(北京康明威培养基技术有限责任公司)和90克碳酸然。实验共设 IO次重复。按照实施例2的方法取发酵液，先加热至80 10(TC，再6，000转/分 钟离心5分钟，取上清液检测发酵液中L-乳酸浓度、D-乳酸浓度、葡萄糖浓度，计 算糖酸转化率、体积生产效率和L-乳酸光学纯度。
结果表明凝结芽孢杆菌(^aci"〃s cos卵7朋s) CASH CGMCC Ns2184发酵生产 L-乳酸过程中葡萄糖和L-乳酸的变化曲线如图1所示，表明通过补料葡萄糖可迅速 转化为高浓度的L-乳酸。发酵结束后，葡萄糖的浓度为5.0克/升±0.8克/升(平 均值士标准差)，L-乳酸浓度190克/升±5.2克/升(平均值土标准差)，糖酸转 化率98. 2% ±0.3% (平均值士标准差)，体积生产效率4.0克/升/小时±0.4克/ 升/小时(平均值士标准差)，卜乳酸光学纯度99.5%±0.2% (平均值土标准差)。
序列表
<160> 1
<210〉 1 <211〉 612 <212〉 DNA
〈213〉凝结芽孢杆菌(5ac272ws coa^/7a/7s)
〈400〉 1
agagtttgatcctggctcaggacgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgtgc60
ggaccttttaaaagcttgcttttaaaaggttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggc120
aacctgcctgt朋gactgggataacgccggg3犯CCggggctaataccggatcgtttttt180
cctccgcatggaggaaaaaggaaaggcggcttcggctgccacttacagatgggcccgcgg240
cgcattagctagttggcggggtaacggccc8cca^ggc肌cgatgcgtagccgacctgag300
agggtgatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagta360
gggaatcttccgcaMggacgaaagtctgacggagcaacgctgcgtgagtgaagaaggcc420
ttcgggtcgtaaasctctgttgccggggaagaacaagtgccgttcgaacagggcggcgcc480
ttgacggtacccggccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaa^3cgt540
aggtggcaeigcgttgtccggaattattgggcgtsa^gcgcgcgc娜cggcttcttaagt600
ctgatgtgaaat61权利要求
1、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASH，其保藏号为CGMCC №2184。
2、 一种生产L-乳酸的方法，是发酵凝结芽孢杆菌(&ci^ws cos^/7朋s) CASH CGMCC N22184得到L-乳酸。
3、 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述凝结芽孢杆菌(53 7A^ coa^/7朋"CASH CGMCC N。_2184的发酵培养基每升中含有以下五种氮源中的至少一种 酵母粉5 15克，蛋白胨5 15克，大豆肽5 15克，大豆蛋白胨5 15克，棉籽蛋 白10 20克；所述发酵培养基每升中还含有葡萄糖80 170克，用于调控发酵液 pH的中和剂，余量为水；所述发酵培养基的pH为5.5 7。
4、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述中和剂为碳酸钙，所述发酵 培养基中每升含有50 100克。
5、 根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述发酵培养基不灭菌。
6、 根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述凝结芽孢杆菌(^feci'7J"s coa卵J朋s) CASH CGMCC Ns2184的发酵条件为45。C 60。C培养18 60小时。
7、 根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述培养温度为50 55t:。
8、 根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述培养时间为18 48小时。
9、 根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述方法中，将凝结芽孢杆 菌(fecy"〃s c朋卵7朋s) CASH CGMCC Ns2184先接入如下种子培养基中，在45 60 。C培养6 8小时，再接入所述发酵培养基；所述种子培养基每升中含有葡萄糖60 80克，酵母粉10 15克，大豆蛋白胨5 8克，碳酸钙30 40克，余量为水；所述 种子培养基的pH为5. 5 6。
10、 根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述发酵的培养方式为搅拌 培养，搅拌转速为200 300转/分钟，旋转半径为33mm。
全文摘要
本发明公开了一种生产L-乳酸的方法及其专用凝结芽孢杆菌。本发明所提供的凝结芽孢杆菌是凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASH CGMCC № 2184。培养凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASH CGMCC № 2184即可得到L-乳酸。该菌株的发酵培养基每升中含有以下五种氮源中的至少一种酵母粉5～15克，蛋白胨5～15克，大豆肽5～15克，大豆蛋白胨5～15克，棉籽蛋白10～20克；另外每升发酵培养基中还含有葡萄糖80～170克(初糖含量)，碳酸钙50～100克，余量为水；该发酵培养基的pH为5.5～7。凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASH CGMCC № 2184以葡萄糖为底物，在45～60℃条件下以98～99％的糖酸转化率高效发酵生产光学纯度99％以上的L-乳酸，其中L-乳酸浓度最高可达190克/升，体积生产效率最高可达5.7克/升/小时。
文档编号C12N1/20GK101173242SQ200710176060
公开日2008年5月7日 申请日期2007年10月18日 优先权日2007年10月18日
发明者波 于, 秦加阳, 平 许, 博 赵, 马翠卿 申请人:中国科学院微生物研究所