专利名称：：重组表达载体和用其转化的宿主细胞发酵甘油高产1,3-丙二醇的方法
技术领域：
：本发明属于生物工程
技术领域：
，尤其涉及含有醇氧化还原酶基因的重组表达载体，以及用其转化的宿主细胞发酵甘油高产1，3-丙二醇的方法。
背景技术：
：1,3-丙二醇(筒称1，3-PD)是一种重要的化工原料，可作为有机溶剂用于油墨、印染、J^t、药物、润滑剂、抗冻剂等行业，还可用作药物合成中间体。1，3-丙二醇最主要的用途是作为聚酯和聚氨酯合成的单体，特别是与对苯二曱酸聚合生成的IW苯二曱酸丙二酯(PTT)是一种高性能、易加工的新型热塑性聚酯材料，具有良好的回弹性、优良的染色性能和膨松性能及生物可降解性，另外PTT纤维可常压印染并具有良好的抗污垢性能、抗磨损性能和抗静电性能，可在地趁领域与尼龙竟争。PTT的优良性能使它被评为美国1998年六"化新产品之一。近年来PTT广泛应用的优良市场前景，大大促进了1,3-丙二醇生产方法的研究。只因1，3-丙二醇生产技术难度大、成本高而限制了PTT的大规模工业化生产。目前，只有Dupont和Shell公司采用传统的化学合成路线，以环氧丙烷或丙烯为原料生产仅供他们合成PTT自用的1,3-丙二醇。化学合成法需要在高温和贵重催化剂作用下进行，副产物多，选择性差，设备投资巨大，生产成^目应较高。生物法生产1，3-丙二醇是利用微生物歧化甘油产生。与化学合成法相比，具有条件温和，操作简便、副产物少，无环境污染等优点，近年来受到特别的重视。自然界中可将甘油转化为1,3-丙二醇的微生物主要是厌氧或兼性厌氧菌，其中肺炎克雷伯氏菌(JOWwW/fl/meww卵/ae)、丁酸梭状芽孢杆菌(Cfo欲W"/w6w印n'c"附)和弗氏軒樣酸菌(C/加6""c/^mw必/)具有较高的1,3-丙二醇转化率，对底物甘油和产物1,3-丙二醇具有较高的耐受力，因此具有较高的开发价值和应用前景。微生物转化甘油生产1,3-丙二醇主要由二羟丙酮(鼎fl)操纵子调控，甘油沿氧化和还原两条路径代谢，维持细胞的氧化还原平衡。在氧化途径中，甘油在依赖NAD+的甘油脱氢酶(GDH)的催化作用下脱氢生成二羟丙酮(DHA)，二羟丙酮在二羟丙酮激酶的作用下磷酸化为磷酸二羟丙酮，进一步代谢生成丙酮酸，然后代谢为各种小分子产物。氧化途径产生ATP和还原当量NADH/NADPH，并伴随微生物细胞生长。在还原途径中，甘油在依赖辅酶B^的甘油脱水酶(GDHt)的作用下变为3-羟基丙醛，然后利用氧化途径产生的NADH，在依赖于NADH的1，3-丙二醇氧化还原酶的作用下生成1，3-丙二醇。近年来，已有许多公司和科研^针对生产1,3-丙二醇的生物法进行了研发。比如，Dupont和Genercor公司近期公开了一系列专利(USPatent6514733;USPatent6013494)，其中共同开发了一种以葡萄糖为底物，利用重组大肠杆菌发酵生产1，3-丙二醇的方法，目前已经投产，年产4.5万吨，为生物法生产1，3-丙二醇与化学法抗衡提供了强大的竟争力。为了提高1，3-丙二醇的生产能力，大连理工大学(王剑锋等，克雷伯氏菌微flJL酵生产1,3-丙二醇的研究。现代化工，2001，21(5):28-31;中国专利ZL01117282.7)采用了微氧条件下发酵生产1,3-丙二醇；清华大学(中国专利ZL03121946.2;中国专利ZL200510011917.2)采用外源添加维生素C、维生素E或反丁烯二酸来促进l，3-丙二醇生产；Biebl等人(Biebl,H"Marten,S.Fermentationofglycerolto1,3-propanediol:useofcosubstrates.j/^/.Af/cro&W.5/0tecA朋,.1995，44:15-19.)则发现添加葡萄糖作为辅助碳源，可以大大提高甘油的转化率。国内也有使用重组大肠杆菌发酵甘油生产1，3-丙二醇的报道，江南大学(中国专利申请200610039670.X)构建了一林重组大肠杆菌，在初始甘油浓度50g/1的单批发酵过程中，最终1,3-丙二醇产量可达3542g/1。另外，为了降低成本，也有通过生物柴油与1,3-丙二醇联产的报道，清华大学(中国专利ZL200510011867.8)开发了一种利用生物柴油生产过程中的副产物甘油作为1，3-丙二醇发酵的碳源以提高原料利用率和生产效率。但是，目前生物法生产1，3-丙二醇存在产物浓度低、生产周期长和甘油转化率低、生产强度低等问题。所以目前在生物法生产1,3-丙二醇中需要改善细胞1,3-丙二醇的合成以克服产物浓度低、生产周期长和甘油转化率低、生产强度低等问题。
发明内容M究发现，对生产1，3-丙二醇的微生物的甘油代谢途径而言，可以利用某些微生物，比如克雷伯氏菌属(/T/^wW/flspp.)或梭菌属(C7仍加V/Z"wspp.)中的菌种，尤其是肺炎克雷伯氏菌(f/^wW/fl/me"歸"/fle)、产气克雷伯氏菌(A/^s/e//"flm^"m)、巴斯德梭菌(C7o欲iVft7i附/;a他w/a腿附)、丁酸梭菌(0o对nV/Z"附6m0^ch附)等本身不含有能够利用NADPH合成l，3-丙二醇的基因的特性，在这些微生物体内表达醇氧化还原酶(w/iZ))基因，从而能够使该微生物有效利用体内还原力，由此导致1，3-丙二醇的浓度和生产强度显著提高。本发明中还发现，通过增加宿主生物体内1^it酶—甘油脱水酶基因的拷贝数，显著提高甘油脱水酶的酶活性，可以进一步提高宿主生物中1，3-丙二醇的产率。因此，本发明一方面提供一种重组表达载体，其中包含一或多拷贝的在启动子控制下的醇氧化还原酶基因。优选地，所述载体中还可以包含一或多拷贝的在所述同一或不同启动子控制下的甘油脱水酶基因。在该方面的一些实施方案中，所述醇氧化还原酶基因可以是外源或内源基因，其可以来自于大肠杆菌(五sc/^r/cA/"枯草芽孢杆菌(5flc/〃"ssttfe&7/s)、痢疾杆菌(iS7r^〃"/d"m')或沙门氏菌属(5Vi/ffi<me//flspp.)，优选大肠軒菌(JE"sc/im'cA/"co//)。优选地，所述醇氧化还原酶基因具有如SEQIDNO:2所示的序列、其简并性序列、或者编码因一或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加而与SEQIDNO:2所编码序列有所不同但仍具有相同酶活性的酶的核香酸序列。在该方面的一些实施方案中，所述甘油脱水酶基因可以来自于克雷伯氏菌属(A「/"s/e//flspp.)、梭菌属(C7仍的Vf/wwspp.)，优选肺炎克雷伯氏菌(Z/e6>h>//fl/mmitf"/tfe)、产气克雷"f白氏菌(Afefeie//")、巴斯德梭菌(C7o欲Wm挑戸他w/"腿附)、丁酸梭菌(C7仍加VZ/"附6w^vr/c"挑)，最优选肺炎克雷伯氏菌(釘e&iW/fl/me"附朋/fle)。优选地，所述甘油脱水酶基因具有如SEQIDNO:l所示的序列、其简并性序列、或者编码因一或几个氨基酸瓶基的取代、缺失、插入和/或添加而与SEQIDNO:1所编码序列有所不同但仍具有相同酶活性的酶的核普酸序列。在本发明中，对于甘油脱水酶的活性采用MBTH(3-曱基-2-苯并噻唑酮腙)方法来确定(Toraya,T.,Kazutoshi,U.，Fukui,S.，Hogenkamp，H.P.C.,Studiesonthemechanismoftheadenosyl國cobalamindependentdioldehydratasereactionbytheuseofanalogsofthecoenzyme./CAeffi.1977,252,963-970);醇氧化还原酶的活性采用分光光度法来确定(张晓梅等，编码1，3-丙二醇氧化还原酶同工酶基因月AD的克隆与高效表达。食品与生物技术学报，2006,25(4):77-80)。转化前后细胞中的甘油脱水酶及醇氧化还原酶的存在通过本领域普通技术人员所熟知的聚丙烯酰胺凝胶电泳方法来鉴定。在该方面的一些实施方案中，所述启动子可以是组成型启动子或者可诱导型启动子，以及本领域普通技术人员所熟知的能够应用于表达原核基因的合适启动子。在一些实施方案中，所述启动子是选自pk(蛋白激酶)启动子、nif(固氮)启动子或dha(二羟丙酮)启动子之中的组成型启动子，或者是选自lac(乳糖)启动子、T7(噬菌体)启动子、tac启动子(乳糖和色氨酸的杂合启动子)或trp(色氨酸)启动子之中的可诱导型启动子。在该方面的一些实施方案中，所述重组载体可以具有任何合适的载体骨架，例如可选自以下栽体组pBR322，pUC18或pET系列载体。在另一方面中，本发明提供含有前述重组表达载体的宿主细胞。在此方面的实施方案中，所述宿主细胞可以选自如下组中克雷伯氏菌属(A/WW/aspp.)、梭菌属(a0对打V/1Y1/wspp.)，优选肺炎克雷伯氏菌(/meM附0w/fl^)、产气克雷4白氏菌(fleragewes)、巴斯德梭菌(C7as^riV//i//M/wwte附Vmw挑)、丁酸梭菌(C7o对nV/f'M附6wi^n'CM附h最优选肺炎克雷伯氏菌(JT/^wW/"戸e"附o"/fle)。在此方面的优选实施方案中，作为重组微生物的^^有本发明所述重组载体的宿主细胞是肺炎克雷伯氏菌(I/^wW/fl/me"附ww'"e)pKP-rf/^5R其已于2007年7月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏编号为CGMCC2111。仍在另一方面中，本发明提供本发明所述的重组微生物在制备1，3-丙二醇中的用途。应用微生物来发酵获得产物的方法对于本领域的普通技术人员来说是众所周知的。在本发明中，发酵可以在有氧或厌氧条件下进行，其中优选微氧IH，。此外可以采用分批发酵、分批补料发酵或连续发酵法来实现本发明，而已知的任何发酵模式均将是适合的。在发酵中，进行培养的培养基中含有碳源、氮源、无机盐、维生素和在合适的温度、pH条件下菌林生长所需的其它各种成分。本发明优选的培养基为普通的已知成分的工业发酵培养基(如LB培养基、SD培养基、酵母粉磷酸盐培养基)，而合适的培养基是微生物学或发酵学领域技术人员熟知的。本发明的发酵培养基必须含有甘油碳源。辅助碳源可以包括但是不限于诸如葡萄糖的单糖、诸如蔗糖的寡糖、诸如淀粉的多糖，或者它们的混合物等。优选是甘油和葡萄糖的混合物。更优选其中甘油与葡萄糖的重量比为6:1-10:1，特别优选是8:1。可用的氮源实例包括氮、各种有机或者无机酸的铵盐，如氯化铵、硫酸铵、醋酸铵和磷酸铵、胺和其它含氮化合物、蛋白胨、肉骨、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白7jC解物、豆蛋白7jC解物、豆饼水解物和多种发酵的微生物细胞及其消化产物等。可用的无机盐实例包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸铁、硫酸镁、硫酸铜和碳酸钩等。可以采用碳酸钩、有机或者无机酸、碱性溶液(例如，KOH溶液)、氨或者pH緩冲液等来调节培养基的pH值。在另一方面中，本发明提供制备1,3-丙二醇的方法，其包括在含有甘油的培养基中培养本发明所述的重组微生物，进行发酵，以及M酵后培养基中回收l，3-丙二醇的步骤。在本发明中，从培养物中鉴定l，3-丙二醇可以采用已知的方法，例如高效液相色镨分析、离子交换树脂、浓缩、盐析和沉淀法等(比如，Skraly，F.A"Lytle，B丄.，Cameron,D.C.Constructionandcharacterizationofal，3-propanedioloperon.々/7,.f"viVwi.MiVtM/o/.1998，64:98-105)。回收1,3-丙二醇的方法根据本领域已知的方法，例如通过有机溶剂萃取、浓缩和蒸馏等(比如，周鹏等，发酵液中低浓度l,3-丙二醇浓缩提纯工艺研究选艮。化学与生物工程，2005，22(2):4誦6)。根据前述的方法，其中所述发酵可以是在微生物培养过程中通入空气进行的有氧发酵，或者在微生物培养过程中通入氮气进行的厌氧发酵。在该方面的实施方案中，发酵接种量可以为1%-12%,优选5%-10%。培养温度可以是20。C-50。C，优选30-40°C。发酵时通气量可以为0.1-0.8vvm,优选0.2-0.6vvm。发酵ii考呈中可k乂调节pH维持在5.0-9.0，优选6.0-8.0。发酵罐搅拌转速可以为80rpm-350rpm，优选100rpm-250rpm。可以在发酵开始3-5小时后流加700-900g/1甘油和卯-115g/1葡萄糖混合溶液，其中甘油:葡萄糖为6:1-10:1(w/w)，优选流加约800g/1甘油和约100g/l葡萄糖混合溶液，其中甘油:葡萄糖为8:1(w/w)。发酵过程中可以维持甘油浓度在2-30g/1，优选5-20g/1。本领域的技术人员应该理解地是，对利用本发明的重组微生物在厌氧和/或有氧条件下发酵甘油生产1，3-丙二醇的方法而言，所施加的厌氧和/或有氧条件以及在发酵过程中调节养分和生长因子的方法以使产物形成率达到最大的技术在工业微生物领域是众所周知的，比如由刘海军等和ZhuMM等(刘海军等，克雷伯氏菌微氧发酵生产1,3-丙二醇的研究，现代化工，2001，21(5):28-31;ZhuMM,LawmanPD，CameronDC.Improvingl，3-propanediolproductionsfromglycerolinmetabolicallyengineeredco//byreducingaccumulationofsn~glycerol~3~phosphate.2002,18(4):694-699)所介绍的方法。图1显示重组栽体的构建过程，其是重组栽体pKP-rf/m5F构建示意图。具体实施例方式以下通过优选实施方式具体说明本发明的各个方面和特征。本领域的技术人员应该理解，这些实施例只是用于说明目的，而不限制本发明的范围。本发明的保护范围只受权利要求书的限制。在不背离权利要求书范围的条件下，本领域的技术人员可以对本发明的各个方面进行各种修改和改进，这些修改和改进也属于本发明的保护范围。另外，需要注意的是，除非特别指明，下面实施例中所用的各种材料和试剂都是本领域中常用的材料和试剂，可以通过常规的商业途径获得；所用方法均为本领域技术人员一;^p的常规方法。重组肺炎克雷伯氏菌(A70/>s/>〃ap朋"/m7/7/ae)的构建构建重组表达载体的过程(1)甘油脱水酶基因鼎fl5的克隆根据GenBank(U30卯3)中公开的肺炎克雷伯氏菌甘油脱水酶(rfAfl5)的基因序列设计如下所需引物Bpl:5，画CGAGAATTCATGAAAAGATCAAAACGATTTGCAGT-3,(SEQIDNO:3)Bp2:5，-TTCAAGCTTTTAGCTTCCTTTACGCAGCTTATGCC-3,(SEQIDNO:4)其中，引物Bpl和Bp2中分别引入五"RI和H/iirfin位点(如下划线所示)。以肺炎克雷伯氏菌基因组(例如，制备方法见F.奥斯伯等著，精编分子生物学实验指南。科学出版社，1998)为模板完成PCR反应(例如，参见Sambrook，J.,Russd，D.W"Afo/ec"/flrC7<m/g:爿Ifl60mtorjMa聽fl/,3rded.，ColdSpringHarbor，NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001.):在200p1PCR反应管中加入以下成分Buffer5n1(Tris-HCl100mM,KC1500mM，MgCl215mM),2.5mmol/1dNTPs8"1,模板DNA2pl(50ng/ji1)，TaqDNA聚合酶1Ji1(5U/H1)，Bpl和Bp2各lMl(20pM,由北京三博远志生物技术有限公司合成)，补水至50nl;>^应糾94t:变性4min，经94"Clmin、551Clmin、721C3min30个循环，获得的PCR产物经电泳分析确认，经DNA纯化试剂盒纯化后，EcoRI和好/mfllI双酶切，回收其中的2.7kb的片段，与经过同样双酶切的载体pET28a(可购自Novagen公司)连接，转化大肠杆菌Dh5a,对阳性重组^^进行筛选，获得重组质粒pET28a-rf/^B。(2)1，3-丙二醇氧化还原酶同功酶基因w/^的克隆根据GenBank(U00096.2)中公开的大肠杆菌醇氧化还原酶(^AD)的基因序列设计如下所需引物Ypl:5，画GTCAAGCTTAAGGGAGCAAGTAATGAACAAC國3，(SEQIDNO:5)Yp2:5，-CTCAAGCTTTTAGCGGGCGGCTTCGTATA國3，(SEQIDNO:6)引物两端均引入历'mflll位点，以;^杆菌基因组(例如，制备方法见F.奥斯伯等著，精编分子生物学实验指南。科学出版社，1998)为模板完成PCR反应(例如，参见Sambrook，J.，Russel,D.W.，Motoi/arOtm/"g.'爿Z^6ora似o;她/iMfl/，3rded.，ColdSpringHarbor,NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001.):永200p1PCR反应管中加入以下成分Buffer5n1(Tris-HC1lOOmM，KCl500mM，MgCl215mM)，2.5mmol/1dNTPs8jLU，模板DNA2jul(50ng/nl),TaqDNA聚合酶lyl(5U/nl)，Ypl和Yp2各lnl(20pM,由北京三博远志生物技^Pf限公司合成)，补水至50pl;反应条件94X:变性4min，经lmin、58t:lmin、721C90s30个循环，获得的PCR产物经电泳分析确i^，经DM纯化试剂盒纯化后通过T-A克隆^克隆载体pMD18T(可购自Takara公司)，得到质粒pMD18T-^A/),及/"rf111酶切质粒pMD18T-y《AD，回收其中的1.16kb的片段，与经过同样酶切的栽体pET28a-rf/m5连接，通过测序鉴定y一Z)插入方向正确的载体，转化大肠杆菌Dh5a,对阳性重组体进行筛选，获得重组质粒pET28a-(3)启动子基因序列pk的克隆及重组质粒pKP-必fl必y的构建根据肺炎克雷伯氏菌林组成型启动子pkDNA序列设计如下所需引物Kpl:3，-GTACAGATCTCGTTATTTTGTCGCCCGCCAT画5，(SEQIDNO:7)Kp2:3，-CATGAATTCTCGGCTCAAAAGGTGAAATCCG画5，(SEQIDNO:8)引物Kpl和Kp2中分别引入fig氾和EcoRI位点(如下划线所示)。以肺炎克雷伯氏菌基因组(例如，制备方法见F.奥斯伯等著，精编分子生物学实验指南。科学出版社，1998)为模板完成PCR反应在200jli1PCR反应管中加入以下成分Buffer5p1(Tris-HCl100mM，KCl500mM，MgCl215mM)，2.5mmol/1dNTPs2|a1,模板DNA2u1(50ng/|i1)，TaqDNA聚合酶lpl(5U/nl),Kpl和Kp2各liul(20|iM，由北京三博远志生物技^7艮公司合成)，补水至50nl;反应*:94"C变性4min，经94t;lmhi、60"C30s、30s30个循环，获得的PCR产物经电泳分才斤确认，经DNA纯化试剂盒纯化后，5#氾和双酶切，回收其中的0，3kb的片段，与经过同样双酶切的载体pET28a-rfA"5连接，转化大肠杆菌Dh5ot，对阳性重组体进行筛选，获得重组质粒pKP-W。上述过程具体地说，如图1中所示，首先利用PCR技术以肺炎克雷伯氏菌(/wie"wwwW)基因组为模板扩增得到编码甘油脱水酶的基因UA"必)，箭头所指的M因的转录方向，DNA片段上方斜体为限制性内切酶位点(五"RI和历VidIII)，将载体pET28a和基因rf/^5分别用限制酶五coRI和/T,VidIII消化后(斜体五和丑分别代表五"RI和及/"dIII)，回收片段进行连接，得到载体pET28a-d/^B。另外，以大肠杆菌基因组为模板PCR扩增得到编码醇氧化还原酶基因(丹/iD)，通过T-A克隆联入克隆载体，得到质粒pMD18T-j;一i),箭头所指的是基因的转录方向，DNA片段上方斜体为限制性内切酶位点(历VidIII)，将载体pET28a-和pMD18T-j;《A/)分别用限制酶H/"dIII消化后(斜体H代表HiVidIII)，回收目的片段进行连接，通过测序鉴定拜/^D的插入方向，方向正确的命名为载体pET28a-d/ifl丑此夕"以肺炎克雷伯氏菌(A/^wW/"/we"挑o"/M)基因组为模板扩增得到一^i且成型启动子(pk)的基因序列，两端分别引入5g/II和^^RI位点，将载体pET28a--y《M)和启动子基因户A:分别用限制酶必g/II和I^'化后(斜体必和F分别代表5g/H和HiVidIII)，回收片段进行连接，得到重组载体pKP一d/i"脱重组质粒pKP—Wa^^的转化及表达将所得的重组质粒pKP-rf/^BF使用本领域的技术人员熟知的方法转化肺炎克雷伯氏菌，肺炎克雷伯氏菌感受态的制备方法同大肠杆菌感受态的制备方法参见SambrookJ，RusselDW(2001)Mo/ecw/wC7柳/"g:^厶"6omtorj;她朋《/，3rded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY.。涂布于含硫酸^"那霉素的LB培养基平板(硫酸卡那i素浓度25jig/ml)，*沐阳性转化子，提取质粒，以5g瓜、和FiVirflII酶切，电泳鉴定结果显示，所用质粒可被切成四条带，分别为5.1kb、2.7kb、1.16kb和0.3kb，此重组质粒即为表达载体pKP-rf/^gy，所得的重组菌即为重组肺炎克雷伯氏菌(X/WsiW/fl/mei/w(mV^)(pKP重组微生物有氧以及厌氧发酵甘油生产1，3-丙二醇厌氧发酵培养(1)菌种肺炎克雷伯氏菌(1/Ws,W/fl/mew附卵/fle)DSM2026，重组肺炎克雷4白軒菌(AfeAsie//"/me"附ow/"e)(pKP誦rf/r"丑l0。(2)培养基LB斜面培养基每升培养基含酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g,NaCl10.0g,琼脂粉15.0g，pH调至7.0。种子;SJL酵培养基见下表1。表1.种子及发酵培养基培养基组分种子培养基(/1)发酵培养基(/1)甘油20g20gK2HP043H203.4g1.5gKH2P041.3g0.5g(NH4)2S042.0g2.0gMgS040.24g0.24g酵母粉2.0g2.0g微量元素溶液2.0ml5.0mlCaC030.5g葡萄糖5g8g其中上表中的微量元素溶液的具体组分及含量见下表2。表2.微量元素溶液组分及其含量<table>complextableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>培养基灭菌前调节pH为7.0，接种前加入硫酸卡那霉素20"g/ml。(3)培养方式A.种子培养湘^L甘油管保藏的菌种转接至LB斜面，30X:下活化12小时。种子培养采用有氧培养，使用250ml三角瓶，装液量50ml。培养温度37t:，摇床转速150rpm，培养时间14-16小时。B.发酵培养发酵使用5L发酵罐，初始装液量2L，培养温度37X:，接种量10%,发酵时通入氮气，通气量为0.2-0.6vvm，用5MKOH调节pH维持在7.0。发酵罐搅拌转速为100rpm-250rpm。发酵开始3-5小时后流加800g/l甘油和100g/l葡萄糖混合溶液，其中甘油葡萄糖=8:1(w/w)，发酵过程中維M油浓度在5~20g/l。对照罐使用原始肺炎克雷伯氏菌作为菌种，实g使用所述重组肺炎克雷伯氏菌作为菌种。c.发酵结果发酵共进行36小时，发酵结束时对照罐发酵液中1，3-丙二醇浓度为58.4g/l，共消耗甘油385.5g,1，3-丙二醇得率为0.55mol/mol，甘油消^Ci4率为3.57g/(lh)，1,3-丙二醇生产强度为1.62g/(lh)。发酵结束时实，发酵液中1,3-丙二醇浓度为65.8g/l，共消耗甘油404.9g，1,3-丙二醇得率为0.59mol/mol，甘油消耗速率为3.75g/(lh),1，3-丙二醇生产强度为1.83g/(lh)。由此可见，使用重组肺炎克雷伯氏菌作为发酵菌种进行厌氧发酵，1，3-丙二醇浓度比对照提高13%，甘油消M度比对照提高5.0%，转化率比对照提高7.3%，生产强度比对照提高13%。有氧发酵培养(1)菌种肺炎克雷伯氏菌(I/Ws/e//fl/meMwwiiVie)DSM2026，重组肺炎克雷4白氏菌(iOe^sie//"/mew附wiiVie)(pKP-flfAflLBlO。(2)培养基LB斜面培养基每升培养基含酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl10.0g，琼脂粉15.0g,pH调至7.0。种子^JL酵培养基见下表3。表3.种子及发酵培养基<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>CaC030.5g葡萄糖5g8g其中上表中的微量元素溶液的具体组分及含量见下表4。表4.微量元素溶液组分及其含量<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>培养基灭菌前调节pH为7.0。(3)培养方式A.种子培养挑取甘油管保藏的菌种转接至LB斜面，30匸下活化12小时。种子培养采用有氧培养，使用250ml三角瓶，装液量50ml。培养温度37C，摇床转速150rpm，培养时间14—16小时。B.发酵培养发酵使用5L发酵罐，初始装液量2L，培养温度37X:,接种量10%，发酵时通入空气，通气量为0.2-0.6vvm，用5MKOH调节pH维持在7.0。发酵罐搅拌转速为100rpm-250rpm。发酵开始3-5小时后流加800g/l甘油和100g/l葡萄糖混合溶液，其中甘油葡萄糖=8:1(w/w),发酵过程中维持甘油浓度在5~20g/l。对照罐使用原始肺炎克雷伯氏菌作为菌种，实,使用重组肺炎克雷伯氏菌作为菌种。C.发酵结果发酵共进行30小时，发酵结束时对照罐发酵液中1,3-丙二醇浓度为67.4g/l，共消耗甘油407.9g,1,3-丙二醇得率为0.60mol/mol，甘油消^Cit率为4.53g/(lh)，1，3-丙二醇生产强度为2.25g/(lh)。发酵结束时实,发酵液中1，3-丙二醇浓度为84.8g/l，共消耗甘油473.7g，1,3-丙二醇得率为0.65mol/mol，甘油消^il率为5.26g/(lh)，1,3-丙二醇生产强度为2.83g/(lh)。由此可见，使用重组肺炎克雷伯氏菌作为发酵菌种进行有氧发酵，1，3-丙二醇浓度比对照提高26%，甘油消^Cil度比对照提高16%,转化率比对照提高8.3%，生产强度比对照提高26%。3.30L发酵g大发酵(1)菌种重组肺炎克雷伯氏菌(J0e6s,W/fl/me"附卯/fl^)(pKP國W"5r)。(2)培养基培养基成分同有氧发酵培养基。(3)培养方式A.种子培养同有氧发酵种子培养方式。B.发酵培养发酵使用30L德国Braun发酵罐，初始装液量15L，培养温度37匸，接种量10%,发酵时通入空气，通气量为0.2-0.6vvm，用5M/0.5M的KOH/NH3'H20调节pH维持在7.0。发酵罐搅拌转速为120rpm。发酵开始4-6小时后流加800g/l甘油和100g/l葡萄糖混合溶液，其中甘油葡萄糖=8:1(w/w)，发酵过程中维持甘油浓度在520g/1。C.发酵结果发酵共进行32小时，发酵结束时发酵罐发酵液中1,3-丙二醇浓度为89.8g/1，共消耗甘油3344g，1,3-丙二醇得率为0.65mol/mol，甘油消llit率为5.23g/(lh)，1，3-丙二醇生产强度为2.81g/(lh)。由此可见，在10倍放大的发酵罐中，获得了较高的1,3-丙二醇浓度，1，3-丙二醇的生产强度提高，降低了发酵成本，为以后的工业化奠定了基础。综上所述，与已有技^M目比，在本发明的发酵结果中，产物l，3-丙二醇浓度提高了20%以上。前面通过举例的方式描述了本发明。普通技术人员十分清楚，可以通过本发明作出各种改变和修"饰，而不偏离本发明的精神和范围。本发明的范围并不仅仅局限于这些具体实施例，而是以所附权利要求书为准。序列表<110>北京化工大学<120>重组表达载体和用其转化的宿主细lfciC酵甘油高产1,3-丙二醇的方法<130><160>8<170>Patentlnversion3.2<210>1<211>2693<212>DNA<213>肺炎克雷伯氏菌<400>1atgaaaagatcaaaacgatttgcagtactggcccagcgccccgtcaatcaggacgggctg60attggcgagtggcctgaagaggggctgatcgccatggacagcccctttgacccggtctct120tcagtaaaagtggacaacggtctgatcgtcgaactggacggcaaacgccgggaccagttt180gacatgatcgaccgatttatcgccgattacgcgatcaacgttgagcgcacagagcaggca240atgcgcctggaggcggtggaaatagcccgtatgctggtggatattcacgtcagccgggag300gagatcattgccatcactaccgccatcacgccggcc肌agcggtcgaggtgatggcgcag360atgaacgtggtggagatgatgatggcgctgcagaagatgcgtgcccgccggaccccctcc420aaccagtgccacgtcaccaatctcaaagataatccggtgcagattgccgctgacgccgcc480gaggccgggatccgcggcttctcagaacaggagaccacggtcggtatcgcgcgctacgcg540ccgtttaacgccctggcgctgttggtcggttcgcagtgcggccgccccggcgtgttgacg600cagtgctcggtggaagaggccaccgagctggagctgggcatgcgtggcttaaccagctac660gccgagacggtgtcggtctacggcaccgaagcggtatttaccgacggcgatgatacgccg720tggtcaaaggcgttcctcgcctcggcctacgcctcccgcgggttgaaaatgcgctacacc780tccggcaccggatccgaagcgctgatgggctattcggagagcaagtcgatgctctacctc840gaatcgcgctgcatcttcattactaaaggcgccggggttcagggactgcaaaacggcgcg900gtgagctgtatcggcatgaccggcgctgtgccgtcgggcattcgggcggtgctggcggaa960aacctgatcgcctctatgctcgacctcgaagtggcgtccgccaacgaccagactttctcc1020cactcggatattcgccgcaccgcgcgcaccctgatgcagatgctgccgggcaccgacttt1080attttctccggctacagcgcggtgccgaactacgacaacatgttcgccggctcgaacttc1140gatgcggaagattttgatgattacaacatcctgcagcgtgacctgatggttgacggcggc1200ctgcgtccggtgaccgaggcggaaaccattgccattcgccagaaagcggcgcgggcgatc1260caggcggttttccgcgagctggggctgccgccaatcgccgacgaggaggtggaggccgcc1320acctacgcgcacggcagcaacgagatgccgccgcgtaacgtggtggaggatctgagtgcg1380gtggaagagatgatgaagcgcaacatcaccggcctcgatattgtcggcgcgctgagccgc1440agcggctttgaggatatcgccagcaatattctcaatatgctgcgccagcgggtcaccggc1500gattacctgcagacctcggccattctcgatcggcagttcgaggtggtgagtgcggtcaac1560gacatcaatgactatcaggggccgggcaccggctatcgcatctctgccgaacgctgggcg1620gagatcaaaaatattccgggcgtggttcagcccgacaccattgaataaggcggtattcct1680gtgcaacagacaacccaaattcagccctcttttaccctgaaaacccgcgagggcggggta1740gcttctgccgatgaacgcgccgatgaagtggtgatcggcgtcggccctgccttcgataaa1800caccagcatcacactctgatcgatatgccccatggcgcgatcctcaaagagctgattgcc1860ggggtggaagaagaggggcttcacgcccgggtggtgcgcattctgcgcacgtccgacgtc1920tcctttatggcctgggatgcggccaacctgagcggctcggggatcggcatcggtatccag1980tcgaaggggaccacggtcatccatcagcgcgatctgctgccgctcagcaacctggagctg2040ttctcccaggcgccgctgctgacgctggagacctaccggcagattggcaaaaacgctgcg2100cgctatgcgcgcaaagagtcaccttcgccggtgccggtggtgaacgatcagatggtgcgg2160ccgaaatttatggccaaagccgcgctatttcatatcaaagagaccaaacatgtggtgcag2220gacgccgagcccgtcaccctgcacatcgacttagtaagggagtgaccatgagcgagaa肌2280ccatgcgcgtgcaggattatccgttagccacccgctgcccggagcatatcctgacgccta2340ccggcaaacca付gaccgatattaccctcgagaaggtgctctctggcgaggtgggcccgc2400aggatgtgcggatctcccgccagacccttgagtaccaggegcagattgccgagcagatgc2460agcgccatgcggtggcgcgcaatttccgccgcgcggcggagcttatcgccattcctgacg2520agcgcattctggctatctataacgcgctgcgcccgttccgctcctcgcaggcggagctgc2580tggcgatcgccgacg汪gctggagcacacctggcatgcgacagtgaatgccgcctttgtcc2640gggagtcggcggaagtgtatcagcagcggcataagctgcgtaaagg肌gctaa2693<210>2<211>1164<212>DNA<213>大肠杆菌<400>2atgaacaactttaatctgcacaccccaacccgcattctgt付ggtaaaggcgcaatcgct60ggtttacgcgaacaaattcctcacgatgctcgcgtattgattacctacggcggcggcagc120gtgaaaaaaaccggcgttctcgatcaagttctggatgccctgaaaggcatggacgtgctg180gaatttggcggtattgagccaaacccggcttatgaaacgctgatgaacgccgtgaaactg240gttcgcgaacagaaagtgactttcctgctggcggttggcggcggttctgtactggacggc300accaaatttatcgccgcagcggctaactatccggaaaatatcgatccgtggcacattctg360caaacgggcggtaaagagattaaaagcgccatcccgatgggctgtgtgctgacgctgcca420gcaaccggttcagaatccaacgcaggcgcggtgatctcccgtaaaaccacaggcgacaag480caggcgttccattctgcccatgttcagccggtatttgccgtgctcgatccggtttatacc540tacaccctgccgccgcgtcaggtggctaacggcgtagtggacgcctttgtacacaccgtg600gaacagtatgttaccaaaccggttgatgccaaaattcaggaccgtttcgcagaaggcatt660ttgctgacgctaatcgaagatggtccgaaagccctgaaagagccagaaaactacgatgtg720cgcgtcaacgtcatgtgggcggcgactcaggcgctgaacggtttgattggcgctggcgta780ccgcaggactgggcaacgcatatgctgggccacgaactgactgcgatgcacggtctggat840cacgcgcaaacactggctatcgtcctgcctgcactgtggaatgaaaaacgcgataccaag900cgcgctaagctgctgcaatatgctgaacgcgtctggaacatcactgaaggttccgatgat960gagcgtattgacgccgcgattgccgcaacccgcaaattctttgagcaattaggcgtgccg1020acccacctctccgactacggtctggacggcagctccatcccggctttgctgaaaaaactg1080gaagagcacggcatgacccaactgggcgaaaatcatgaca"acgttggatgtcagccgc1140cgtatatacgaagccgcccgctaa1164<210>3<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物Bpl<400>3cgagaattcatgaaaagatcaa肌cgatttgcagt35<210>4<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物Bp2<400>4ttcaagcttttagcttcctttacgcagcttatgcc<210>5<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物Ypl<400>5gtcaagcttaagggagcaagt肌tgaacaac3531<210>6<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物Yp2<400>6ctcaagcttttagcgggcggcttcgtata29<210>7<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物Kpl<400>7gtacagatctcgttattttgtcgcccgccat31<210>8<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物Kp2<400>8catgaattctcggctcaaaaggtgaaatccg3权利要求1.一种重组表达载体，其包含一或多拷贝的在启动子控制下的醇氧化还原酶基因。2.根据权利要求l的重组表达载体，其还包含一或多拷贝的在所述同一或不同启动子控制下的甘油脱水酶基因。3.根据权利要求2的重组表达载体，其中所述甘油脱水酶基因来自于克雷伯氏菌属(AZWwW/flspp.)、梭菌属(C7仍加VZ/m附spp.)，优i^炎克雷4白氏菌(^7e6'e///7/f)、产气克雷"f白氏菌d/e6s/e/Zflflengewes)、巴斯德梭菌(C7ostnV//w/;flW^i/flww附)、丁^^菌(C7o对nVft'w附6時n'CM附),最优选肺炎克雷伯氏菌(i^/^s/e//"/mew柳o"/fle)。4.根据前述权利要求任一项的重组表达栽体，其中所述甘油脱水酶基因具有如SEQIDNO:l所示的序列、其简并性序列、或者编码因一或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加而与SEQIDNO:1所编码序列有所不同但仍具有相同酶活性的酶的核苷酸序列。5.根据前述权利要求任一项的重组表达载体，其中所述醇氧化还原酶基因来自于大肠杆菌(fsc/^nV^/co//)、枯草芽孢杆菌(丑""7/"s幼6"7/s)、痢疾杆菌(57i/ge//fl/7eA7ien')或沙门氏菌属(5W腳"e/,flspp.)，最优选大肠軒菌(￡"sc/i肌.c/r,Vico//)。6.根据前述权利要求任一项的重组表达载体，其中所述醇氧化还原酶基因具有如SEQIDNO:2所示的序列、其筒并性序列、或者编码因一或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加而与SEQIDNO:2所编码序列有所不同但仍具有相同酶活性的酶的核苷酸序列。7.根据前述权利要求任一项的重组表达载体，其中所述启动子是组成型启动子或可诱导型启动子。8.根据前述权利要求任一项的重组表达栽体，其中所述启动子是选自pk(蛋白激酶)启动子、nif(固氮)启动子或dha(二羟丙酮)启动子之中的组成型启动子，或者是选自lac(乳糖)启动子、T7(噬菌体)启动子、tac启动子(乳糖和色氨酸的杂合启动子)或trp(色氨酸)启动子之中的可诱导型启动子。9.根据前述权利要求中任一项的重组表达载体，其中所述载体的骨架选自包括以下载体的组pBR322，pUC18，pET系列载体。10.含有权利要求1-9中任一项所述重组表达载体的宿主细胞。11.根据权利要求10所述宿主细胞，其选自如下组中克雷伯氏菌属(1/^>//"spp.)、梭菌属(ao对打vft'"附spp.)，优选肺炎克雷伯氏菌(iT/e65^〃a/m^l挑0/l/fle)、产气克雷4白氏菌(flCIY)geweS)、巴斯德梭菌(C7(Wr/rf/w柳/7fl对c"iVmM附)、丁^_梭菌(Cto对n'rf/m附6w^t/cm附),最优选肺炎克雷伯氏菌(/7"eM腳"/fle)。12.根据权利要求10或11的重组微生物，其是肺炎克雷伯氏菌()pKP-^"5F，其生物保藏编号为CGMCC2111。13.权利要求10-12中任一项的重组微生物在制备1,3-丙二醇中的用途。14.制备l，3-丙二醇的方法，其包括在含有甘油的培养基中培养权利要求10-12中任一项所述重组微生物以及从发酵后培养基中回收1,3-丙二醇的步骤。15.根据权利要求14的方法，其中所述发酵在如下条件下进行发酵接种量1%—12%,和/或培养温度20匸-50'C，和/或发酵时通气量为0.1-0.8vvm，和/或调节pH维持在5.0-9.0，和/或发酵罐搅拌转速为80rpm-350rpm,和/或发酵开始3-5小时后^>700-卯0g/1甘油和90-115g/1葡萄糖混合溶液，其中甘油:葡萄糖为6:1-10:1(w/w)，和/或发酵过程中维持甘油浓度在2-30g/1。16.根据权利要求15的方法，其中所述的发酵优选以下条件进行发酵接种量5%—10%,和/或培养温度30X:-40C和/或发酵通气量为0.2-0.6vvm，和/或pH维持在6.0-8.0，和/或发酵罐搅拌转速为100rpm-250rpm，和/或流加800g/1甘油和100g/l葡萄糖，其中甘油葡萄糖为8:l(w/w)，和/或发酵过程维M油浓度在5-20g/1。17.根据权利要求14-16中任一项的方法，其中所述发酵是在微生物培养过程中通入空气进行的有氧发酵，或者在微生物培养过程中通入氮气进行的厌氧发酵。全文摘要本发明提供一种重组表达载体，其包含一或多拷贝的在启动子控制下的醇氧化还原酶基因，以及用所述载体转化的合适的宿主细胞。本发明还提供用所述宿主细胞在有氧或厌氧条件下发酵甘油高产1，3-丙二醇的方法，由此1，3-丙二醇的产量得到明显提高。文档编号C12N15/63GK101205541SQ20071017606公开日2008年6月25日申请日期2007年10月18日优先权日2007年10月18日发明者吴家鑫,王凤寰,谭天伟申请人:北京化工大学