专利名称：：一种连续检测组织工程支架和组织植入物上活细胞量的方法
技术领域：
：本发明涉及细胞培养、组织工程领域，更具体地涉及连续测定组织工程支架和植入物上活细胞量的方法。技术背景在组织工程领域，活细胞量是一个非常重要的参数，它是分析细胞生长、存活和代谢的基础。台盼蓝法是在细胞培养中最常用的细胞定量方法，由于需要消化细胞，并不适用于定量贴壁生长在复杂形状上的组织细胞。MTT法、LDH法、DNA法、同位素标记法等方法因为可以不必消化细胞，直接对支架上的活细胞进行定量而获得广泛应用。但是上述方法需要破坏细胞导致细胞死亡，使培养过程中断，因此只能作为终点检测使用。如果要连续观察细胞生长及存活情况，需要同时培养大量样品，中间分批取样检测。这会造成支架、种子细胞、培养基及培养设备的很大浪费。对于种子细胞稀缺、培养过程复杂、培养困难的组织培养过程，受到培养规模的限制，培养过程中细胞生长和存活的连续检测和评估就更加难以实现。在设计复杂的组织工程文献中很少有关于细胞连续生长情况的数据。因此，在组织工程领域迫切需要建立简单快速、能够在不损伤细胞活性及生理功能的前提下进行活细胞定量的检测方法。刃天青(AlamarBlue，Resazurin)可以被活细胞吸收，在真核细胞线粒体内作为呼吸链电子最终受体，经酶催化，取代氧而被还原为试卤灵(Resorufin)，试卤灵可以被转运出活细胞。刃天青和试卤灵在光吸收方面有较大差别，最大光吸收波长分别为573nm(试卤灵)和605nm(刃天青)，在605nm刃天青有最大光吸收时，试卤灵的光吸收接近零，这一性质可应用于细胞代谢活性分析。另外，试卤灵具有的荧光性质也可应用于细胞代谢活性分析和以此为指标的其他应用，如化学和生化物质毒性分析、药物筛选等方面。中国专利申请200410084342.2(高通量晡乳动物细胞培养基优化方法2004年)在96孔板中进行培养基成分优化，利用刃天青和试卤灵605nm处光吸收的差异在普通酶标仪上进行终点的细胞活性检测。该专利特别强调用作细胞培养的终点检测，并非用于培养过程的连续检测。HenrykJ.Sakaxinski等(Ahybridcompliantvasculargraftseededwithmicrovascularendothelialcellsextractedfrom...human,omentum,ArtificialOrgans,25(2001'):974:982)在细"胞、接种到血管支架后24小时加入AlamarBlue，其后分别在第4、8、16、24小时取样，使用普通酶标仪，用荧光检测细胞活力。HongliSun等(Proliferationandosteoblasticdifferentiationofhumanonemarrow-derivedstromalcellsonakermanite-bioactiveceramics,Biomaterials，27(2006)5651-5657)在细胞接种到P-TCP支架上后加入AlamarBlue,在0-96小时每隔12小时取样在酶标仪上检测细胞增殖力。上述文献中刃天青溶液均在培养初期加入，在短时间内连续取样测定细胞活力，并未涉及刃天青的反复加入与去除，以及在长期培养过程中进行连续的活细胞定量检测。因此本领域迫切需要建立简单快速、能够在不损伤细胞活性及生理功能的前提下进行活细胞定量的检测方法。
发明内容本发明的目的是提供一种在组织工程支架和植入物上连续进行活细胞定量的方法，利用酶标仪快速、简便、有效地测定组织工程支架和植入物上的活细胞量，其特点在于通过无细胞毒性的反应物刃天青的反复加入与去除进行连续的活细胞定量，定量检测不影响组织细胞的生长与产物表达，不受细胞生长载体的材质及形状的限制，定量后的细胞仍然可以用于培养或进行其他生化检测。该方法可以也可以作为终点检测法。本方法应用于组织工程支架上细胞生长的连续检测，有助于研究对细胞生长、代谢与存活的生理状态有影响的因素，也有助于设定组织工程培养中的质控指标。本发明公开的一种连续检测组织工程支架和植入物上活细胞量的方法，该方法包括步骤a.在组织工程支架和植入物上接种细胞，在生物反应器中进行培养；b.在培养过程中，每隔1-10天向培养体系中加入检测试剂刃天青，取样，用检测仪器检测活细胞量；c.检测完成后去除培养体系中含有检测试剂及其产物的培养基，用缓冲液冲洗，加入新鲜培养基继续培养细胞；d.在培养过程中重复步骤b、c,完成组织工程支架上和植入物上活细胞量的连续检测。其中组织工程支架和植入物由天然聚合物或人工聚合物构成天然聚合物为海藻酸钠、胶原、羟基磷灰石；人工聚合物为PLA、PLGA、纤维、玻璃其形状为片状、管状、多孑L、微包囊、微阵列、微构化以及其他不规则形状的细胞生长载体。细胞包括原代细胞或细胞系细胞原代细胞为内皮细胞、上皮细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、成骨细胞、皮肤细胞、肝细胞、胰岛细胞、神经细胞以及各种干细胞;细胞系细胞为MC3T3El细胞、ECV304细胞等。培养体系包括生物反应器和培养基；其中生物反应器包括孔板、培养瓶、培养皿、旋转瓶、中空纤维反应器、以及其它组织工程生物反应器及培养灌流装置；培养基包括血清培养基和无血清培养基。步骤b中每隔1-10天向培养体系中加入检测试剂刃天青，刃天青加入的时间根据培养的具体要求而定。步骤b中在活细胞检测中将生物反应器内的培养基体积控制在0.1-100ml，使刃天青的工作浓度为10-400nmol/ml培养基，刃天青的反应时间为0.5-4小时。检测仪器包括酶标仪、分光光度计或荧光仪。步骤b中活细胞检测前一天应接种标准曲线，标准曲线的细胞是与目标细胞相同或相似的细胞，培养条件与目标细胞相同将细胞按照一定的浓度梯度接种到24孔板或96孔板中，培养过夜后加入刃天青溶液检测活细胞量，将获得的数据绘制成标准曲线。步骤c中在定量检测完成后应去除检测试剂刃天青及其产物试卤灵，其步骤包括去除含有上述物质的培养基，用缓冲液(如PBS、Hanks液等)反复冲洗去除残留的反应物和产物，加入新鲜培养基继续培养。步骤d中的连续检测是在培养过程中对两个或两个以上的多个时间间隔进行检测来完成；在每一个时间间隔可以进行一次测定，也可以进行反复多次测定其时间间隔为1-10天。本方法中涉及到的所有试剂如刃天青溶液、PBS、Hanks液等都为无菌溶液；除去在酶标仪、荧光仪或分光光度计上检测以外，所有操作都在无菌状态下进行。较常用的刃天青的加入量为200!il/ml培养基，反应体积为lml，反应时间为1小时；通过测定605nm下光吸收值的变化确定活细胞的量，刃天青在培养过程中加入。对经过刃天青定量细胞继续培养，并进行生化检测，其生长情况和产物表达水平与没有定量过的细胞相比没有明显差异。对MC3T3-E1在PLA支架上的生长进行连续定量，用MTT法定量细胞作为对照，两种方法获得的结果基本相同。但是MTT法获得的结果为终点检测，每次检测均需耗费支架和细胞样品。采用本发明方法检测活细胞量对细胞的生长和功能没有影响，细胞可以在3天至6个月的较长时间内培养，培养过程中可以根据需要连续检测活细胞量。本发明提供的活细胞连续定量方法应用于组织工程支架和植入物上细胞生长的连续检领!l，与现有定量技术相比有如下有益效果1.本发明所提供的活细胞定量方法简单快速，并且不影响细胞的生长状态和生理功能。采用本发明方法只需在培养系统中加入一定浓度的刃天青溶液，混匀后取样，测定一定时间内刃天青还原反应所导致的光吸收值的变化即可定量培养系统中的活细胞数量，除去刃天青后细胞可以继续在培养系统中生长；2.采用本发明所提供的是连续的活细胞定量方法，用于评估特定样品的连续生长和存活状况，可以大量节省组织工程支架、种子细胞、培养基及培养设备；如在实施例3中对MC3T3-E1在PLA支架上的生长进行连续定量，用MTT法定量细胞作为对照，两种方法获得的结果基本相同，但是MTT法获得的结果为终点检测，并且检测耗费的样品数量是使用本发明方法的7倍；3.应用本发明方法检测过的样品还可以继续生长用于后续研究，甚至可能用于后续的移植应用。本方法应用于组织工程支架上细胞生长的连续检测，有助于研究对细胞生长、代谢与存活的生理状态有影响的因素，也有助于设定组织工程培养中的质控指标。本发明所提供的活细胞连续定量方法在组织工程领域细胞的生长与存活等生理状态评估方面是一个重要的进步。图l.显示了实施例1中不同浓度的刃天青对于MC3T3-E1细胞的短期和长期毒性；图2.显示了实施例2中骨支架上的MC3T3-E1活细胞数量与刃天青光吸收变化的动态关系；图3.显示了实施例3中MC3T3-E1细胞在骨支架上生长的生长情况；图4.显示了实施例4中用刃天青进行连续的活细胞定量对于MC3T3-E1细胞在骨支架上生长的影响其中图4a、4b为用刃天青连续检测的组织工程支架在培养的第7、21天的生长情况；图4c、4d为没有经过刃天青连续检测的组织工程支架在培养的第7、21天的生长情况；图4e为支架的电镜照片；将经过刃天青定量的支架和未经过刃天青定量的支架染色后在荧光显微镜下观察，看到的都是绿色的活细胞，基本上没有红色的死细胞，细胞都表现了良好的生长状态和较高的活性，在细胞分布和细胞活力方面两种不同的培养条件没有明显差异。图5.显示了实施例5中用刃天青进行连续的活细胞定量对于MC3T3-E1细胞在骨支架上产物表达的影响:其中图5a为ALP基因的表达情况；5b为为BSP基因的表达情况；5c为C0L1基因的表达情况；5d为OCN基因的表达情况；对照组为没有经过刃天青连续定量检测的支架；图6.显示了实施例6中ECV304细胞在血管支架上生长情况；具体实施方式下文提供了实施例进一步说明本发明，但本发明不仅限于以下实施例。实施例1.不同浓度的刃天青对于MC3T3-E1细胞的短期和长期毒性1)在96孔板中以2X1(^细胞/孔的密度接种MC-3T3E1细胞，培养24小时后取出，在孔中依次加入含有2.0mM、1.0mM、0.4mM、0.2mM、0.1mM、0.04mM、0.02mM、0.01mM刃天青的培养基lOOwl,使孔中刃天青的浓度依次为其工作浓度的10倍、5倍、2倍、t倍、0.5倍、0.2倍、0.1倍、0.05倍，以不加刃天青的培养基作为对照；2)将细胞放回培养箱中培养，在加样后的第l、2、4、8、24小时分别取出样品，弃去含刃天青的培养液，用PBS洗涤2遍，每孔加入培养基培养100nl，24小时后再换液一次；3)在培养96小时后，弃去培养基，PBS洗涤2次，用MTT法检测细胞活力；4)将获得的结果与对照相比(细胞存活比率)，以此比值对刃天青浓度的对数做图，获得不同浓度的刃天青在不同作用时间对于MC3T3-E1细胞的毒性影响。每个数据都是三个样本的平均值；实验结果表明(见图1):在l-4小时内，在较大的浓度范围内刃天青对于细胞没有毒性影响8-24小时后，在工作浓度的0.05—2倍范围内，细胞存活比率细胞存活比率在0.8以上，表明低浓度的刃天青对于细胞生长没有明显影响；在工作浓度的5-10倍，细胞存活比率随着刃天青浓度和作用时间的延长而迅速下降，说明高浓度刃天青的长时间存在对细胞有较大毒性。从上述结果来看，使用工作浓度的刃天青，将作用时间控制在1小时左右，对于长期检测细胞在支架上的生长没有毒性的影响。实施例2.骨支架上的MC3T3-E1活细胞数量与刃天青光吸收变化的动态关系1)配制浓度为25X105、12.5X105、6.25X105、3.125X105、1.56X105、7.88X105细胞/ml的MC-3T3El细胞种子液，分别接种到处理好的骨支架上，每个支架接种40yl，使得接种后的支架上细胞量为100X104、50X104、25X104、12.5X104、6.25X104、3.125X()4细胞;2)在24孔板中每孔加入lml.培养基，..将接种好的支架放入24孔板中培养；3)培养1天以后，取出24孔板，向各孔中加入200ul刃天青溶液，混匀；4)每孔取样100ul放入96孔板，在酶标仪中读取605nm处的光吸收值；5)将24孔板放入细胞培养箱中，1小时后取出24孔板，每孔取样100y1放入96孔板，用酶标仪读取605nm处的光吸收值；6)弃去24孔板中的反应液，将支架用PBS洗3遍，加入新鲜的培养基，放入培养箱中继续培养；7)在接种后的第3、5天用同样的方法对支架进行活细胞定量；实验结果表明(见图2):细胞密度与刃天青在605mn处光吸收值的减少成线性关系，并且随着培养时间的延长，各个接种密度的支架的光吸收值的减少值逐渐增长，说明随着细胞的生长，支架上的活细胞对刃天青的代谢能力也相应的增加。实施例3.对骨支架上生长的MC3T3-E1活细胞连续定量1)在定量的前一天接种标准曲线配制浓度为100乂104细胞/ml的MC-3T3E1细胞种子液，在24孔板的第1列孔加入2ml种子液，在第2,6列加入lml培养基；将第1列的种子液混匀后，吸取lml加入第2列，将第2列中的种子和培养基混匀后吸取lml加入第3列；按上面描述的方法对第2-6列进行倍比稀释，第6列的细胞和培养基混匀后弃去lml，使得最终各孔中的细胞量分别为100X104、50X104、25X104、12.5X104、6.25X104、3.125乂104细胞；将24孔板放入细胞培养箱内过夜，使接种后的细胞充分贴壁；2)弃去待测标准曲线各孔中的旧培养基，加入lml新鲜培养基，在培养箱中稳定l小时后，向各孔中加入200ul刃天青溶液，混匀；3)每孔取样100ul放入96孔板，在酶标仪中读取605mn处的光吸收值；4)将标准曲线放入细胞培养箱中培养，l小时后再次取样，用酶标仪读取605nm处的光吸收值；5)将标准曲线的各个孔的细胞量与其605mn光吸收值的减少量作图绘制出标准曲线；6)在骨支架上接种MC-3T3E1细胞，每个支架接种2乂104个细胞；在接种后的第1天对支架进行第一次活细胞定量，弃去支架的旧培养基，加入lml新鲜培养基，在培养箱中稳定1小时后，向各孔中加入200ul刃天青溶液，混匀；7)每孔取样100ul放入96孔板，在酶标仪中读取605nm处的光吸收值；8)将支架放入细胞培养箱中培养，l小时后再次取样，用酶标仪读取605nm处的光吸收值；9)弃去24孔板中的反应液，将支架用PBS洗三遍，加入新鲜的培养基，放入培养箱中继续培养；计算反应前后各孔在605nm光吸收值的减少量，利用绘出的标准曲线计算出支架上的活细胞量；10)在接种后的第4、7、10、14、18、21天用同样的方法对支架进行活细胞定量；11)在接种后的第1、3、7、10、14、17、21天，在用刃天青进行定量的同时用MTT法对支架进行活细胞定量，作为刃天青方法定量的结果的对照；实验结果表明(见图3):分别用刃天青和MTT法测得的细胞在支架上的生长曲线，基本上是一致的，两种方法具有可比性。实施例4.用刃天青进行连续的活细胞定量对于MC3T3-E1细胞在骨支架上生长的影响1)在支架培养的第7天，分别取用刃天青定量和未用刃天青定量的支架，用Hanks液洗2遍，放入24孔板中，加入0.5mlLive/Dead染色液(5iig/ml的FDA溶液和2.5yg/ml的PI溶液)，在室温放置孵育20分钟，弃去染色液，用Hanks液洗涤支架3次，将支架放在荧光显微镜下观察细胞的活性和细胞的生长情况；2)在支架培养的第21天，按照步骤1)染色，将支架放在荧光显微镜下观察细胞的活性和细胞的生长情况；实验结果表明(见图4):在经过刃天青定量的支架(图4a、b)和未经过刃天青定量的支架(图4c、d)上细胞都表现了良好的生长状态，在所有照片中细胞均表现出较高的活性，看不到死亡的细胞，在细胞分布和细胞活力方面两种不同的培养条件没有明显差异。说明用刃天青对活细胞进行定量不影响细胞在支架上的生长。图4e为空白支架在电镜下的结构照片。实施例5.用刃天青进行连续的活细胞定量对于MC3T3-E1细胞在骨支架上产物表达的影响1)在培养的第7、14、21Day,分别取用刃天青定量和未用刃天青定量的支架，每3个支架为一个样品，每种培养方法取三个样品，用PBS洗2遍，将支架放入1.5ml离心管中，每个样品加Trizol溶液400in，震荡20分钟后离心，取上清，按照提RNA的标准操作提取RNA。2)将提取的RNA按照标准Real-timeRT-PCR方法操作。基因ALP、C0L1、BSP、OCN的引物序列见表1。表l.定量PCR中各基因的引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>实验结果表明(见图5):在经过刃天青定量的支架和未经过刃天青定量的支架MC-3T3El细胞特征基因的表达水平没有明显差异。说明用刃天青对活细胞进行定量对于细胞的的产物表达影响不大。实施例6.ECV304细胞在血管支架上生长情况的连续检测1)在定量的前一天接种标准曲线配制浓度为100X10"细胞/ml的ECV304细胞种子液，在24孔板的第1列孔加入2ml种子液，在第2.-6列加入lml培养基；将第1列的种子液混匀后，吸取lml加入第2列，将第2列中的种子和培养基混匀后吸取lml加入第3列；按上面描述的方法对第2-6列进行倍比稀释，第6列的细胞和培养基混匀后弃去lml，使得最终各孔中的细胞量分别为100X104、50X104、25X104、12.5X104、6.25X104、3.125Xl(^细胞；将24孔板放入细胞培养箱内过夜，使接种后的细胞充分贴壁；2)弃去待测标准曲线各孔中的旧培养基，加入lml新鲜培养基，在培养箱中稳定l小时后，向各孔中加入200ul刃天青溶液，混匀；3)每孔取样100yl放入96孔板，在酶标仪中读取605nm处的光吸收值；4)将标准曲线放入细胞培养箱中培养，1小时后再次取棒r甩酶标仪读取605nm处的光吸收值；5)将标准曲线的各个孔的细胞量与其605nm光吸收值的减少量作图绘制出标准曲线6)在血管支架上接种ECV304细胞，每个支架接种2乂104个细胞；在接种后的第3天对支架进行第一次活细胞定量，弃去支架的旧培养基，加入lml新鲜培养基，在培养箱中稳定1小时后，向各孔中加入200tU刃天青溶液，混匀；7)每孔取样100ul放入96孔板，在酶标仪中读取605nm处的光吸收值；8)将支架放入细胞培养箱中培养，l小时后再次取样，用酶标仪读取605nm处的光吸收值；9)弃去24孔板中的反应液，将支架用PBS洗三遍，加入新鲜的培养基，放入培养箱中继续培养；计算反应前后各孔在605nm光吸收值的减少量，利用绘出的标准曲线计算出支架上的活细胞量10)在接种后的第6、9、12天用同样的方法对支架进行活细胞定量；11)在接种后的第3、6、9、12天，在用刃天青进行定量的同时用MTT法对支架进行活细胞定量，作为刃天青方法定量的结果的对照；实验结果表明(见图6):分别用刃天青和MTT法测得的细胞在支架上的生长曲线.基本上是一致的，两种方法具有可比性。权利要求1、一种连续检测组织工程支架和植入物上活细胞量的方法，其特征在于，该方法包括步骤a.在组织工程支架和植入物上接种细胞，在生物反应器中进行培养；b.在培养过程中，每隔1-10天向培养体系中加入检测试剂刃天青，取样，用检测仪器检测活细胞量；c.检测完成后去除培养体系中含有检测试剂及其产物的培养基，用缓冲液冲洗，加入新鲜培养基继续培养细胞；d.在培养过程中重复步骤b、c，完成组织工程支架上和植入物上活细胞量的连续检测。2、如权利要求l所述的一种连续检测组织工程支架和植入物上活细胞量的方法，其特征在于所述的组织工程支架和植入物由天然聚合物或人工聚合物构成，其中天然聚合物为海藻酸钠、胶原、弹性蛋白、羟基磷灰石；人工聚合物为PLA、PLGA、纤维、玻璃；其形状为片状、管状、多孔、微包囊、微阵列、微构化以及其他不规则形状的细胞生长载体。3、如权利要求1所述的一种连续检测组织工程支架和植入物上活细胞量的方法，其特征在于所述的细胞包括原代细胞或细胞系细胞，其中原代细胞为内皮细胞、上皮细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、成骨细胞、皮肤细胞、肝细胞、胰岛细胞、神经细胞以及各种干细胞；细胞系细胞为MC3T3El细胞、ECV304细胞。4、如权利要求1所述的一种连续检测组织工程支架和植入物上活细胞量的方法，其特征在于所述的培养体系包括生物反应器和培养基；其中生物反应器包括孔板、培养瓶、培养皿、旋转瓶、中空纤维反应器、以及其它组织工程生物反应器及培养灌流装置；培养基包括血清培养基和无血清培养基。5、如权利要求l所述的一种连续检测组织工程支架和植入物上活细胞量的方法，其特征在于检测仪器包括酶标仪、分光光度计或荧光仪。6、如权利要求1所述的一种连续检测组织工程支架和植入物上活细胞量的方法，其特征在于所述的缓冲液为PBS、Hanks液。7、如权利要求1所述的一种连续检测组织工程支架和植入物上活细胞量的方法，其特征在于:步骤d中的连续检测是在培养过程中对两个或两个以上的多个时间间隔进行检测来完成；在每一个时间间隔可以进行一次测定，也可以进行反复多次测定；其时间间隔为l-10天。8、如权利要求4所述的一种连续检测组织工程支架和植入物上活细胞量的方法，其特征在于将培养基体积控制在O.l-lOOml，使刃天青的工作浓度为10-400nmol/ml培养基，刃天青的反应时间为0.5-4小时。全文摘要本发明公开了一种组织工程中连续检测组织工程支架和组织植入物上活细胞量的方法，本发明克服了组织工程中常用的活细胞定量检测方法会损伤细胞的缺点，提供了一种简单快速，不损伤细胞活性及生理功能，不受细胞生长载体的材质及形状限制的活细胞定量检测方法，该方法包括步骤a.在组织工程支架和植入物上接种细胞，在生物反应器中进行培养；b.在培养过程中，在规定的时刻向培养体系中加入检测试剂刃天青，取样，用检测仪器检测活细胞量；c.检测完成后去除培养体系中含有检测试剂及其产物的培养基，用缓冲液冲洗，加入新鲜培养基继续培养细胞；d.在培养过程中的规定时刻重复步骤b、c，完成活细胞量的连续检测。文档编号C12Q1/06GK101153317SQ200710176100公开日2008年4月2日申请日期2007年10月19日优先权日2007年10月19日发明者樊瑜波,贡向辉申请人:北京航空航天大学