专利名称：陆地棉抗病基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种陆地棉抗病基因及其在培育抗病转基因植物中的应用。本发明还涉及 包含所述基因的构建体，含有所述的构建体的重组表达载体，由表达载体转化的植物细胞， 以及由转化细胞产生的对病原菌表现高抗性的转基因植物。
背景技术：
用化学农药来防治植物病害会带来环境污染问题，且病原菌会产生耐药性。基因工程 手段是提高植物的抗病性的新途径。
植物在与病原物长期共同进化过程中，形成了错综复杂的防御机制来抵抗病原物的侵
染。在不亲和互作模式中，植物的抗病基因(resistantgene， i gene)识别特异的无毒基因 (avimlencegene， "wgene)，产生小种特异性抗性。"w与i 基因相互识别后形成的激发 子(elicitor)或第二信使ROI(Reactive Oxygen Intermediates, ROI)和水杨酸(Salicylic Acid， SA)能介导产生过敏性反应(Hypersensitive Response, HR)，在侵染部位形成坏死斑， 随后经过一系列信号传导激活植物体内的防卫反应，编码病程相关蛋白的基因表达，诱导 植物产生系统获得性抗性(Systemic Acquired Resistance, SAR)。
通过对拟南芥突变体的研究，发现了一些与植物防卫反应信号传导相关的基因。 NPR1 (none expresser of尸i gene)、 NDRl (non disease resistance)、 EDSl (enhanced disease susceptibility) 、 RAR1 (required for Mla-specified resistance) 、 SGT1 (suppressor of G2 allele of SKP1)及Racl (ras-rdated C3 botulinum toxin substrate 1)是目前已经鉴定的几个参与 植物防卫反应的信号蛋白。这些蛋白本身对病原物没有毒性或抑制作用，但作为信号元件 参与不同植物防卫反应途径的调控，这些信号元件的过量表达能提高植物对病原菌的抗 性。如在水稻中过量表达z^r7对水稻白叶枯病菌的抗性明显提高。组成型表达O^ac/ 的转基因水稻对水稻稻瘟病表现出很高的抗性。组成型表达海岛棉G&Sgd、 和 GW m1的转基因烟草对赤星病的抗性明显提高。
"pW最初是从拟南芥中发现的，不同的研究者将其分别命名为"pr7， W/M7和&4//。 ，rl是SAR途径中的一个中心元件，其作用定位于SA积累之后、SAR基因表达之前。 ，W基因在正常植株中有少量表达，当用SA、 INA处理或病原菌侵染后，其表达量可提高大约两倍。研究发现，过量表达能提高植物对多种病原菌的抗性，如过量表达^W 基因的转基因拟南芥对细菌尸w"(io附w7(Xs s,/"gae pv macw//cao es4326和卵菌病原菌 尸era朋印oraparaw'"ca Noco的侵染产生抗性，PR-1等PR蛋白的表达量也提高。
拟南芥的";^l与哺乳动物的转录调控蛋白I-A;B[I(kappa)B]具有一定的同源性和相似的 结构，均含锚蛋白重复序歹U(ankyrin repeats, ANK)和行使功能所必须的磷酸化Ser残基，据 此认为";^1是哺乳动物I4B的同源物，推测其作用机理也类似。I-AB是真核生物核因子 NF-AB (nuclear factor-kappa B)的抑制剂。I-A:B分子含有3-7个锚蛋白重复序列，每个重复 序列约33个氨基酸残基。NF-ytB是一类具有多功能转录调节作用的核蛋白因子，存在于多 种组织和细胞中，具有广泛的生物学活性，激活后参与许多基因的转录调控。在未受侵染 的细胞(resting cell)中，NF-AB位于细胞质内，与I-Afi单体耦联而无活性(sequestered), 当细胞受到病原物侵染时，IiB激酶被激活，使I-招磷酸化，随后NF-招/I-秘耦联体解聚， NF4B释放，激活防卫基因的表达。研究发现，，rl通常位于细胞质内，通过分子内二硫 键形成寡聚体，当用SA处理或病原菌侵染后，改变细胞内的还原电位(reductionpotential), 促使"; rl单体化(monomerization)，然后这些单体转运至细胞核中，激活尸i 基因的表达。
拟南芥NPR1蛋白含BTB/POZ(Broad陽Complex， Tramtrack and Brie a brae)/ POZ (poxvirus and zinc fmger)和锚蛋白重复序歹!j(ANK)。 BTB/POZ结构域一般由120个保守的 氨基酸残基组成，主要位于锌指DNA结合蛋白的N末端，如大约有5%-10%的C2H2型 锌指转录因子中含BTB结构域。ANK存在于许多蛋白质家族中，蛋白中ANK重复序列 的数目可介于2到20个之间。以往研究表明，BTB和锚蛋白重复序列参与蛋白与蛋白之 间的互作，推测NPR1可能通过与其它蛋白的相互作用参与调节SA介导的植物防卫反应。 现已证明拟南芥中的一种属于TGA家族的蛋白质可与基因的表达产物相互作用，通 过两者的结合来调节i^基因的表达。TGA蛋白属于bZIP (basic domain/Leu Zipper)转录 因子，作为正负调节子介导植物的防卫反应。在拟南芥中，在无SA时，TGA1以氧化态 存在，两个保守的半胱氨酸(Cys)残基形成二硫键。SA的积累使Cys残基被还原，还原 态的TGA1能与NPR1相互作用。两者之间的相互作用增强还原态的TGA1特异性地与许 多Pi 基因启动子区的SA调控序列结合，调控PR基因的表达。此外，转录因子WRKY 在转录水平对"pr/基因的表达进行调控。WRKY蛋白是一类存在于高等植物中的DNA 结合蛋白，能识别防卫相关基因启动子区的、以TGAC为核心序列的W框，如烟草I型 几丁质酶基因启动子区的激发子反应元件为一个W框，此W框能被病原菌诱导 的WRKY蛋白特异地识别。拟南芥启动子中存在三个W-框，SA诱导表达的WRKY 蛋白能与这些W框特异性结合，在转录水平对^W的表达进行调控。但现有技术中未见开发陆地棉抗病基因",7的报道。
发明内容
本发明的目的是开发编码陆地棉Gh-NPR1蛋白的核苷酸序列，为植物广谱抗病基因工 程提供新的基因源。
本发明提供了编码陆地棉Gh-NPR1蛋白的核苷酸序列G/z-";^，其序列如SEQ ID NO:l所示，或是对所述序列进行一个或几个核苷酸的缺失、添加和/或取代，但功能不变 的序列。
按照本发明所述的核苷酸序列，其中，其编码如SEQIDN02所示的Gh-NPRl的氨基 酸序列，或是对所述序列进行一个或几个氨基酸的缺失、添加和/或取代，但功能不变的 氨基酸序列。
对本发明提供的核苷酸序列进行缺失、添加和/或取代一个或几个核苷酸，而产生的缺 失、添加和/或取代一个或几个氨基酸残基产生的蛋白质，定义为功能性衍生物，它们仍 具有通过本领域内熟知技术可验证的功能。这种功能性衍生物可通过下列方法产生利用 本发明公开的核苷酸序列，通过本领域熟知的方法或公开方法进行的重组技术；利用化学 肽链合成技术；通过修改本发明提供的氨基酸序列，产生与本发明功能一致的氨基酸序列。
本发明还涉及在植物细胞中表达的、含有如上所述的核苷酸序列的植物表达载体。
按照本发明所述的植物表达载体，该载体包括
a) 5'非翻译区
b) 编码G/z-，rl基因的核苷酸序列；
c) 3'非翻译区。
按照本发明所述的植物表达载体，其中a)所述的5'端非编码区包括增强子序列、启 动子序列和翻译增强序列，b) SEQIDN01所示的核苷酸序列单独或组合使用；c)所述 的3'端非翻译区包含终止子序列。
本发明涉及根据本发明如上所述的核苷酸序列，如上所述的植物表达载体用于 提高植物抗病能力的用途和获得对病原菌有抗性的转基因植株。
本发明涉及使用本领域中已知的方法，将本发明提供的SEQ ID NOl所示 G/z-，rl基因的核苷酸序列连接到任何一种可在细菌细胞或植物细胞中自我复制的 载体上。
本发明还涉及将得到的表达载体导入植物细胞中，导入的方法都是本领域技术人员熟知的，这些方法包括但并不仅限于1)农杆菌介导的转化法 (v4gro6a"en.wm-mediated transformation); 2)物理法，如基因枪法(Particle bombardment 或Particle gun或Gene gun)、电击法(Electroporation)、显微注射法(Microinjection)、超声 波法(Ultrasonic)、激光微束法(Laser microwave)、碳化硅纤维介导法(Silicon carbide fiber)、电泳法(Electrophoretic tmnsfection)等；3)化学法，如PEG介导的转化法、脂质 体介导转化法等；4)种质系统转化法，如花粉介导法、花粉管通道法(子房注射法)、浸 泡法等；5)以花椰菜花叶病毒(CaMV)、双生病毒(Geminiviruses)或RNA病毒等病毒 载体所介导的转化法等等。
按照本发明所述的表达载体，其可进一步包括选择标记基因和报告基因。
按照本发明所述的表达载体，所述选择标记基因是新霉素磷酸转移酶基因。
本发明所述植物，指含有如上所述的植物表达载体的植物及其后代，包括植物 种子、整体植物或植物体的部分或组织器官、细胞。
在本发明的一个实施例中，所用的植物为烟草。
在本发明中，将包含G/z-"/^1基因的重组植物表达载体通过农杆菌介导法导入烟草， 获得了转基因烟草，通过PCR和Southern杂交检测，结果表明目的基因已整合到烟草基 因组中。用离体叶片接种法对转基因烟草进行抗病性鉴定，发现转基因烟草对赤星病菌的 抗性明显提高。本发明认为，C^-wprl基因能够激发植物的系统获得性抗性，提高植物的 抗病能力，在植物广谱抗病基因工程中具有广阔的应用前景。
本发明利用同源序列克隆法和RACE技术克隆了陆地棉抗病信号元件w; W基因，其 具有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列，该核苷酸序列编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
为了使外源基因在植物细胞中在转录和翻译水平上获得高效表达，在外源基因 侧翼必须连接有适当的表达调控元件。本发明中设计了为在受体植物中高效表达 ( //-^〃1基因所需的启动子、增强子、终止子、多聚腺苷酸序列、以及便于在适当的 培养基中筛选被转化细胞的选择标记基因等。
根据本发明的一个优选实施方案，在本发明所构建的植物表达载体中，所述的 5'非编码区由2个增强子序列、 一个启动子序列。
适于与本发明G/7-^W基因连接，并在植物细胞中启动该编码DNA序列转录开 始的包括组成型、诱导型、组织或器官特异性或发育阶段特异性的启动子。包括但 不限于花椰菜花叶病毒(CaMV)35S或19S启动子，甘露碱合成酶(MAS)启动子，胭脂碱合成酶和章鱼碱合成酶启动子，玉米乙醇脱氢酶启动子，二磷酸核酮糖羧化 酶/加氧酶小亚基启动子、由甘露碱合成酶基因的启动子与花椰菜花叶病毒的35S启动 子相融合而成的启动子、带有两个增强序列的花椰菜花叶病毒的35S启动子、病原菌诱导 启动子、组织或器官或发育特异表达的启动子、以及适于在单子叶植物中表达的Ubi、 Emu、 Actinl启动子等。本发明优选的是带有两个增强子元件的花椰菜花叶病毒的35S 启动子。
根据本发明的一个优选实施方案，在本发明所构建的高效植物表达载体中，所说的3' 非编码区包括一个多联终止密码子序列， 一个mRNA切割序列和一个mRNA切割后加工 序列及多聚腺苷酸序列。
另外，适用于本发明的G/z- ^W高效表达载体还包括终止子序列，如包括质粒pTiA6 的T-DNA7，5，双向终止子、章鱼碱合成酶基因终止子、花椰菜花叶病毒35S RNA终止子 或胭脂碱合酶(Nos)基因或其他基因的终止子等等。本发明优选iV^基因的终止子。
可使用本领域中已知的方法，将本发明提供的适于在植物细胞中表达G/z-"户W 的融合基因构建体，连接到任何一种可在细菌细胞或植物细胞中自我复制的载体 上。这样的载体例如包括衍生于大肠杆菌的质粒载体pUC18、pUC19 (Yanisch-perron etal.， Gene 33: 103-119, 1985)，尤其是植物表达载体pBI101, pBI121 ， pBI131系统 (Jefferson, et al., EMBO J. 16: 3901, 1987)及pCamBia系统(Hajdukiewicz et al.， Plant MolBiol 25: 989-994, 1994; Hieietal.， The Plant J 6: 271-282, 1994)等等。在 本发明的一个优选实施方案中，携带G/z-^W基因构建体的载体是pBlueScriptSK、 pUC18、 pUC19、 pCamBia2301等，后者特别适于作为制备植物双价表达载体的工 具质粒载体。
当然，如前所述，为了正确地选择和鉴定被转化的植物细胞，本发明的上述重 组表达载体还应含有可选择标记基因。所使用的选择标记基因的两侧可带有各自的 调节序列，以促使它们在植物中的表达。适用的选择标记是本领域内已知的。编码 选择标记的外源基因及其他基因可以包含于同一个表达载体中，或者包含于转化 时同时应用的不同的载体中。本发明优选的选择标记基因是A^7V/基因，并一同包 含于同一个重组表达载体内，从而保证了对被转化细胞或植株选择的可靠性。
归纳起来，本发明提供的适于在植物细胞中表达G/2-^W的植物双价表达载体 包含
1) G/z-";^基因表达盒； a)5'非编码区；b) 编码G/2-，W基因的核苷酸序列；
c) 3'非编码区。
2)来源于pCamBia2301的载体部分
a) NPTII表达盒；
b) 起始复制子及与植物转化相关的T-DNA左右边界序列等功能结构。
通过本发明所得到的符合SEQ ID N01的核苷酸序列可以通过DNA重组技术， 连接到上面所述的表达载体中，并使之导入并整合到植物基因组中。而且G/m;;W 基因在目标植物中的表达可赋予该植物对病原菌具有较强的抗性。
应该指出，上面所述的表达载体只是本发明的一个优选实施例，它并不限制本
发明。凡是应用本发明所描述的G/7-^W基因所构建的任何表达载体均包括在本发
明之内。包括如下的实现方式
1与其它一种或多种基因融合，构建多价基因的表达载体并转入植物； 2与其它一种或几种基因重组，构建表达载体并导入植物； 3与其它一种或几种基因相协同，分别构建植物表达载体，同时或分步导入同 一种植物受体。
为了在植物细胞中，特别是整株植物中表达外源基因，必须使用适当的方法将 携带C^-n/^7基因的重组双价表达载体转化或转导到适当的宿主细胞或植物体内。
将携带外源基因的重组载体导入宿主植物或其细胞内的许多方法都是本领域技 术人员熟知的。这些方法包括但并不仅限于1)农杆菌介导的转化法 (yigro6ac/"en.wm匿wediated transformation); 2)斗勿理 去，々口基因枪 去(Particle bombardment 或Particle gun或Gene gun)、电击法(Electroporation)、显微注射法(Microinjection)、超声 波法(Ultrasonic)、激光微束法(Laser microwave)、碳化硅纤维介导法(Silicon carbide fiber)、电泳法(Electrophoretictransfection)等；3)化学法，如PEG介导的转化法、脂质 体介导转化法等；4)种质系统转化法，如花粉介导法、花粉管通道法(子房注射法)、浸 泡法等；5)以花椰菜花叶病毒(CaMV)、双生病毒(Geminiviruses)或RNA病毒等病毒 载体所介导的转化法等等。
因此，本发明涉及编码G/2-，r/基因的DNA序列、氨基酸序列、高效植物表达载体， 以及由此产生的对植物病原菌具有抗性的转基因植物细胞以及由转基因植物细胞得到的 转基因植物。
另外，本发明还提供了获得对病原菌有抗性的植物的方法，该方法包括1 )构建含有基因的植物表达载体；
2)用任何一种本领域已知的方法将1)中得到的表达载体导入植物细胞，并由此得 到对病原菌具有抗性的转基因植物及后代，包括任何植物的整株、部分、器官或组织和种 子。
特别指出的是，虽然在下述实施例中以转基因烟草为例详细描述了本发明，但并不意 味着本发明的GA-，W基因及表达载体只适用于生产具有抗病能力的转基因烟草。因此， 凡是使用本发明所述的，r7基因及其表达载体，以本领域已知的任何一种方法转入任 何植物或其组织或细胞，以及由此获得的具有抗病能力的植物、种子和后代以及植物体的 部分器官、组织或细胞均包括在本发明中。
图l是植物表达载体pFNPRl示意图。其中，Nos P:胭脂碱合成酶基因Nos的启动 子；nptll:新霉素磷酸转移酶基因，提供卡那霉素抗性；Nos T:胭脂碱合成酶基因Nos的 终止子；2E:两个花椰菜花叶病毒CaMV35S增强子；35S P:花椰菜花叶病毒CaMV 35S 启动子；RB:T-DNA右边界；LB:T-DNA左边界。
图2是转基因烟草抗烟草赤星病离体叶片鉴定，其中，左转基因烟草叶片；右非 转基因NC89叶片。
具体实施例方式
实施例1 G/2-^W基因的克隆
1.2.1 G/z-w; W基因片段的克隆 禾U用改良的CTAB法提取棉花DNA，同时根据已知"pW的保守序列设计简并引物p-Fl
(5， agg cac(t) tt(g)g ac(t)t cng atg ata(g) tt(a)g a 3，)， p-Rl (5， tcc(t) c(t)tc(a,t) cg(t)c ata(c) gca gcaat(c)g(a)tgaag3，)，通过Touch-Down PCR扩增基因片段。PCR反应条件为9fC变性 5min; 94°C 30 sec， 60°C 30 sec， 72°C 1 min， 2个循环；94°C 30 sec， 58。C30sec， 72°C 1 min， 2个循环；94。C 30 sec， 56°C 30 sec, 72°C 1 min， 2个循环；94°C 30 sec, 54°C 30 see, 72°C 1 min， 2个循环；94°C 30 see, 52°C 30 sec, 72°C 1 min， 30个循环；72。C延伸5 min。
1.2.2 G/z-;7pH基因cDNA3'末端的获得。
根据得到的基因片段设计特异引物primer F2: 5'taactttggatgatgctactgcactccat 3，。利用 热CTAB法提取陆地棉7124的叶片RNA。参考3'RACE (TaKaRa, Japan)试剂盒说明书， 以3 Sites Adaptor Primer (5'ctgatctagaggtaccggatcc3，)和p-F2为引物，以棉花叶片RNA反 转录得到的cDNA为模板，PCR扩增得到G/z-"; W3'末端产物。PCR反应条件为94。C变性5min; 94。C30s， 66°C 30 s， 72。C2min， 30个循环；72°C延伸5 min。将得到的目的 片段克隆到pMD18-T载体，热击法转化DH5cx，筛选鉴定阳性克隆，对阳性克隆进行测 序，得到基因的3'端序列。
1.2.3 G/2-"; W基因cDNA5'末端的获得
根据得到的基因序列设计并合成引物P-R2: 5'tgccttcaccatcagagagagact3'和p-R3: 5'acagtggaaagcaaccacgaggat 3'， 根据GeneRacerTM RACE Ready cDNA i式齐ll盒(Invitrogen, USA)说明书，首先对叶片RNA进行脱磷、脱帽，然后在5'末端加上GeneRacer RNA Oligo，利用SuperScirpt 反转录酶，以oligo dT为引物进行反转录，最后以5'RACE引 斗勿(5'cgactggagcacgaggacactga 3，) 禾口 p-R2 (5'tgccttcaccatcagagagagact3，)， 巢式弓l #勿 (5，ggacactgacatggactgaaggagta 3，)禾口 p-R3 (5'acagtggaaagcaaccacgaggat 3，)进《亍嵌套PCR 得到5'末端产物。PCR反应条件为94。C变性4 min; 94°C 45 s， 64°C 1 min， 72°C 1.5 min， 30个循环；72。C延伸5min。
RACE得到的产物连接到pMD 18T-Vector (TaKaRa， Japan) 上，筛选鉴定阳性克隆，并进行序列测定，得到基因的5'端序列。
1.2.4 G/z-w;^基因全长cDNA的获得
用DNAMAN软件分析组装5'和3'序列获得G/w^W全长cDNA，
实施例2植物表达载体的构建
根据获得的陆地棉wpr7 cDNA序列，分别设计引物p-F3 ( 5' ggcctcgagatggcttatttgtctgagccatcatct 3，)禾tl p-R4 (5' cgtctcgagtcacaatttcctatacttgtagg 3，)。为 方便载体构建，在p-F3的5'端和p-R4的3'端引入Z/wI酶切位点。以叶片RNA反转 录得到的第一链cDNA为模板进行PCR扩增，反应条件为94。C变性4min; 94°C 45 s， 62°C 45 s， 72°C 1.5 min， 30个循环；72。C延伸5 min。目的基因片段连接到pMDl8-T-Vector 中，获得pMD-";^1，用Z7zo I酶切pMD-"pH质粒，回收G/z-";^基因片段备用。用￡coR I//// d III酶切pBI121和pTQ4A，分别回收12 kb和1.4 kb大小的条带，连接后构成中间 载体pB4A。用Z7wI酶切此中间载体，回收13.4kb大小的条带，与Gh-w; W片段重组成 植物表达载体pF-，rl 。 G/z-，r/基因由带有两个enhancer的CaMV 35S启动子驱动，3， 末端为poly(A)n尾巴和NOS终止子(图1)。
实施例3农杆菌介导法获得双价转基因烟草
本实施例利用农杆菌介导法，成功的获得了具有G/z-"pW基因的转基因烟草。采用的烟草受体材料为NC89，农杆菌为LBA4404，具体操作步骤如下 1 )根癌农杆菌LBA4404感受态的制备
(1) 从平板上挑取单菌落，接种到5 ml YEB液体培养基(含链霉素Strep 125 mg/L)， 28°C、 250rpm振荡培养过夜；
(2) 取2ml菌液，加入50 ml YEB液体培养基(含Strep 125 mg/L)中，28°C、 250 rpm振荡培养至OD6oo约0.6左右；
(3) 将菌液转至50ml无菌离心管中，冰浴30min。 5000 rpm离心5 min;
(4) 弃上清，沉淀用2 ml 20 mM CaCI2重悬，每份100 Ml分装到1.5 ml离心管中， 液氮中保存备用。
2) 重组质粒DNA转入农杆菌
(1) 将约I吗的p2301GAT、p2301G2以及p2301G2-gat质粒DNA分别加入到100 (alLBA4404感受态细胞中，混匀，冰浴5 min;
(2) 将离心管置液氮中冷冻8min，迅速转至37°C水浴中温浴5 min;
(3) 加入1 ml YEB液体培养基，在28°C摇床上250 rpm复苏4 - 5 h;
(4) 取适量菌液涂布到含Strep 250-300 mg/L、Rif(利福平)250-300 mg/L和Kan (卡 那霉素)100 mg/L的YEB固体培养基上，置28°C培养24 - 48 h。
3) 叶盘法转化烟草品种NC89
(1) 农杆菌的活化
从平板上挑取农杆菌单菌落，接种到5 ml YEB液体培养基中(Kan 100 mg/L， Strep 100 mg/L, Rif 300 mg/L),振荡培养过夜；取1 ml菌液接种到50 ml YEB液体培养基(Kan 100 mg/L, Strep 100 mg/L, Rif 300 mg/L)中，剧烈振荡培养至OD,为0.4 - 0.5 (约3 - 4 h); 5,000 rpm离心5 min，菌体用MSo培养基(不含激素)重悬，使OD6oo为0,1 - 0.2;
(2) 烟草的遗传转化
a) 共培养将侵染过的叶块摆放在铺有2层滤纸的烟草芽分化培养基(MS + IAA 0.5 mg/L + 6-BA 2 mg/L)上，25°C暗培养4天；
b) 抗性芽的筛选将经过共培养的烟草外植体转移到抗性芽筛选培养基(MS + IAA 0.5 mg/L + 6-BA 2 mg/L + Kan 100 mg/L + Cef (噻孢霉素)500 mg/L)上，
2 3周后即可生芽；
生根待抗性芽长到lcm左右时，将其转移到生根培养基(MS + Kan 100 mg/L + Cef 500 mg/L)上，1 2周后即有不定根形成。实施例4转基因烟草的抗病性鉴定
1) 烟草赤星病菌的培养用接种针挑取赤星病菌培养物，重新接种于马铃薯固体
培养基(PDA培养基2%马铃薯薯块；2%蔗糖；2%琼脂)上，置25。C培
养箱中暗培养。
2) 孢子制备在生长两周的赤星病病原菌平板上加入2ml灭菌的蒸馏水，过夜， 收集孢子，镜检调整孢子浓度为5xl04/mL。
3) 取长势良好、均一的15株转G/ -^W的烟草植株和10株受体烟草(对照)用 于检测，摘取顶部第3片叶，叶背朝上置于无菌的湿纱布上，用石英砂制造微 伤，于伤口处接种lOpl孢子悬浮液，接禾中24h内，保持100%的相对湿度。
4) 接种后1 7天调查发病情况。待所选植株长出新叶后重复接菌试验，共重复3 次。
试验结果如图2所示，用离体叶片法鉴定转基因烟草对烟草赤星病的抗性。对照组叶 片在接种2 3天后，接种部位开始坏死，5天时，接种部位形成黑色病斑，并赘生白色 菌丝，病斑周围变黄，表明烟草赤星病孢子萌发后，已成功侵染到叶片组织中。在供试的 转C^-"/7r7的烟草中，有5株(1,3,5,6,11)抗性水平显著提高，接种3天时，接种部位 无明显变化，接种5天时，接种部位制造的创伤处轻微坏死，表现出明显的过敏性坏死反 应，病斑未见进一步扩大。
SEQIDNO:l的信息
(D 序列特征
(A) 名称G/7-"pW基因
(B) 长度1764碱基对
(C) 类型核苷酸
(D) 链型单链
(E) 拓扑结构线性
(ID 分子类型编码G/7-"; W基因的核苷酸序列
(III) 假定的非
(IV) 反义非
SEQ ID NO:2的信息
(I) 序列特征(A) 名称Gh-NPR1蛋白
(B) 长度587个氨基酸
(C) 类型氨基酸
(D) 链型单链
(E) 拓扑结构线性
(II) 分子类型G/7-^pW基因的氨基酸序列
(III) 假定的非
(IV) 反义非序列表SEQUENCE LISTING
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<212> DNA <213>人工序列
<400> 1
atggcttatt tgtctgagcc atcatcttct ttgagtttca gttcatcttc tcatctatct 60
aatggctcaa tcactcacaa tataccccct ttttctgttc ctgaaactgg ggctaacctt 120
gaagctctaa gtttgaccaa gctcagctct agtttggagc aactaattgt tgaaaattgt 180
cctgttttta gtgatgctga tatagttgtt gaaggtgttg ctgttggtgt tcatagatgt 240
attttagctg ttaggagtaa gtttttcaat gaggttttta aggatgggtc tgggtcttct 300
gagaaagatg gaaagccaag ttataacatg tctgagttgt tgccttatgg caagattgga 360cttgaagctt tccaggtgtt cttgagttat ttgtatactg gaaagctcaa gccttctcct 420
atggaggttt caacttgtgt tgataatgtt tgtgctcatg atgcttgtcg acccgccata 480
agtttcgccg tggagttgat gtatgcatca tccatatttc aaataccgga gcttgttcct 540
ctttttcagc ggcggcttct taacttcgtt gagaaggctc tcctagagga tatcatccca 600
atcctcgtgg ttgctttcca ctgtcaatgc agtcaactag tttctcaatg tgttgataga 660
gtagcaaggt cggatcttga tagcatctgt atcgagaaag agcttcctta tgaagttacg 720
gagagtattc ggttgcttcg ccgcaagtct ccctctgatg gtgaaggcaa tgaggcagtg 780
gttgatcctt tgcgagagaa aagaattcgg agaatacata aagcattgga ttctgatgat 840
gtcgaacttg ttaaattact tttaactgag tctgacataa ctttggatga tgctactgca 900
ctccattatg ctgcagcata ttgtgacccc aaagttgtct ctgaggtact tggcctgcgt 960
ctggctgatg tcaatctgcg gaattctcgt ggttacacag ttcttcacat agctgcaatg 1020
cgaaaagaac catcggtgat aatggcactt ctagcaaaag gggcatctgc ttcaacacta 1080
acattggatg gacaaagtgc tgttaacatc tgccggaggt tgacaagacc aaaggattat 1140
catgccaaga cagagcaagg gaaggaaacg aataaagacc ggatatgcat tgatatttte 1200
gagaggg謹tgaggagaaa tccaatggct ggagatgttt ctgttgcttc ccatgcattg 1260tctgatgatc tgcatatgag acttctgtac ctagagaatc gagtggcatt ggcaaggtta 1320
cttttcccta gtgaagcaaa acttgccatt gacatagcac atgccgaaac aacctccgag 1380
ttagctactg gctttccatc aaaatgttca aatggaaact taaggcaggt tgatttgaat 1440
gagacaccca ttatgcagaa gcaaagactt cttgctagga tgcaagccct tatgaaaaca 1500
gtggagatgg gtcggcgcta tttccctcat tgctcggaag tgctcgataa gttcatggag 1560
gatgaccttc ctgatttgtc ttaccttgag acaggcaccc cggaagagca aaggatagag 1620
agatcacgct tcagggagct taaggaggac gttcaaaggg catttaagaa ggacaaggcc 1680
gagtttaacc gcaacggttt gtcttcatca tcatcgtcat cttctttgag agatggtggc 1740
ccctacaagt ataggaaatt gtga 1764
<210> 2
<211> 587
<212> PRT <213>人工序列
<400> 2
Met Ala Tyr Leu Ser Glu Pro Ser Ser Ser Leu Ser Phe Ser Ser Ser 1 5 10 15Ser His Leu Ser Asn Gly Ser lie Thr His Asn lie Pro Pro Phe Ser 20 25 30
35
40
45
Ser Ser Ser Leu Glu Gin Leu lie Val Glu Asn Cys Pro Val Phe Ser 50 55 60
Asp Ala Asp lie Val Val Glu Gly Val Ala Val Gly Val His Arg Cys 65 70 75 80
lie Leu Ala Val Arg Ser Lys Phe Phe Asn Glu Val Phe Lys Asp Gly 85 卯 95
Ser Gly Ser Ser Glu Lys Asp Gly Lys Pro Ser Tyr Asn Met Ser Glu 100 105 110
Leu Leu Pro Tyr Gly Lys lie Gly Leu Glu Ala Phe Gin Val Phe Leu 115 120 125
Ser Tyr Leu Tyr Thr Gly Lys Leu Lys Pro Ser Pro Met Glu Val Ser130 135 140
Thr Cys Val Asp Asn Val Cys Ala His Asp Ala Cys Arg Pro Ala lie 145 150 155 160
Ser Phe Ala Val Glu Leu Met Tyr Ala Ser Ser He Phe Gin lie Pro 165 170 175
Glu Leu Val Pro Leu Phe Gin Arg Arg Leu Leu Asn Phe Val Glu Lys 180 185 190
Ala Leu Leu Glu Asp lie lie Pro lie Leu Val Val Ala Phe His Cys 195 200 205
Gin Cys Ser Gin Leu Val Ser Gin Cys Val Asp Arg Val Ala Arg Ser 210 215 220
Asp Leu Asp Ser lie Cys lie Glu Lys Glu Leu Pro Tyr Glu Val Thr 225 230 235 240
Glu Ser lie Arg Leu Leu Arg Arg Lys Ser Pro Ser Asp Gly Glu Gly 245 250 255Asn Glu Ala Val Val Asp Pro Leu Arg Glu Lys Arg lie Arg Arg lie 260 265 270
His Lys Ala Leu Asp Ser Asp Asp Val Glu Leu Val Lys Leu Leu Leu 275 280 285
Thr Glu Ser Asp lie Thr Leu Asp Asp Ala Thr Ala Leu His Tyr Ala 2卯 295 300
Ala Ala Tyr Cys Asp Pro Lys Val Val Ser Glu Val Leu Gly Leu Arg 305 310 315 320
Leu Ala Asp Val Asn Leu Arg Asn Ser Arg Gly Tyr Thr Val Leu His 325 330 335
lie Ala Ala Met Arg Lys Glu Pro Ser Val lie Met Ala Leu Leu Ala 340 345 350
Lys Gly Ala Ser Ala Ser Thr Leu Thr Leu Asp Gly Gin Ser Ala Val 355 360 365
Asn He Cys Arg Arg Leu Thr Arg Pro Lys Asp Tyr His Ala Lys Thr370 375 380
Glu Gin Gly Lys Glu Thr Asn Lys Asp Arg lie Cys lie Asp lie Leu 385 390 395 400
Glu Arg Glu Met Arg Arg Asn Pro Met Ala Gly Asp Val Ser Val Ala 405 410 415
Ser His Ala Leu Ser Asp Asp Leu His Met Arg Leu Leu Tyr Leu Glu 420 425 430
Asn Arg Val Ala Leu Ala Arg Leu Leu Phe Pro Ser Glu Ala Lys Leu 435 440 445
Ala lie Asp lie Ala His Ala Glu Thr Thr Ser Glu Leu Ala Thr Gly 450 455 460
Phe Pro Ser Lys Cys Ser Asn Gly Asn Leu Arg Gin Val Asp Leu Asn 465 470 475 480
Glu Thr Pro lie Met Gin Lys Gin Arg Leu Leu Ala Arg Met Gin Ala 485 490 495<formula>formula see original document page 21</formula>
权利要求
1. 一种提高植物抗病性的DNA序列，如SEQ ID NO1所示。
2. 权利要求1所述DNA序列编码的氨基酸序列，如SEQ ID NO:2所示。
3. 包含SEQ ID NO:l所述DNA的重组载体。
4. 用权利要求3所述的重组载体转化的宿主细胞。
5. 权利要求1所述的DNA序列在培育提高抗病性的转基因植物的应用。
全文摘要
本发明涉及一种陆地棉抗病基因及其在培育抗病转基因植物中的应用。本发明首次发现了可提高植物抗病性的npr1基因，构建了包含上述基因的组成型表达的植物表达载体，并转化至植物细胞。实验证实，本发明将所述基因在植物中表达后，所获得的转基因植物显著提高了对病原菌的抗病能力。
文档编号C12N15/82GK101418301SQ20071017615
公开日2009年4月29日 申请日期2007年10月22日 优先权日2007年10月22日
发明者唐巧玲, 王志兴, 王旭静, 贾士荣 申请人:中国农业科学院生物技术研究所