专利名称：：一种弓形虫的检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
：本发明涉及一种弓形虫的检测试剂盒及其检测方法，尤其涉及一种基于环介导等温扩增技术的弓形虫的检测试剂盒及其相应的检测方法。
背景技术：
：弓形虫病是由刚地弓形虫引起的一种人畜共患的原虫病。弓形虫可感染多种动物45种哺乳动物，70种鸟类和5种冷血动物。猫和猫科动物是弓形虫的终末宿主，在终末宿主体内弓形虫主要侵袭小肠上皮细胞，造成肠道疾病。而在中间宿主体内，如猪、牛、羊等，弓形虫侵入肠壁经血液或淋巴进入单核巨噬细胞系统的细胞内寄生，并扩散到全身各处组织器官，如脑、淋巴结、肝、心、肺、肌肉等，造成全身多器官性的病变，对中间宿主的危害相当大。猪是弓形虫的主要易感动物，据有关报道显示，我国猪场的弓形虫感染率最高，约26.6%，最高可达60%。弓形虫的现有检测方法很多，大致可以分为三大类，即病原学诊断方法、血清学诊断方法和分子生物学诊断法。病原学诊断方法包括组织学诊断、动物接种试验和细胞培养法。病原学诊断需要一定数量实验动物，而且实验周期较长。血清学诊断方法包括美蓝染色试验(DT)、间接荧光抗体试验(IFAT)、凝集试验和酶联免疫吸附试验(ELISA)。分子生物学诊断方法主要是聚合酶链式反应(PCR),该方法比前两种方法快速，灵敏，但需要使用特殊的PCR仪，不适于基层应用。
发明内容本发明的目的是提供一种基于环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)技术的快速检测弓形虫的检测试剂盒及其检测方法。为了实现本发明的目的，本发明的一种弓形虫检测试剂盒，包括如下组分(1)LAMP反应液23(iLLAMP反应液含有0.5|imolTris-HCl、0.25pmolKCl、0.25|imol(NH4)2S04、0.04|imol的Triton-100、0.10.2(imol硫酸镁、535(imol甜菜碱、0.020.04nmol脱氧核苷酸、0.040.06pmol的与弓形虫AF146527基因或Bl基因结合的内侧引物对、0.0040.008|imol的与弓形虫AF146527基因或Bl基因结合的外侧引物对、8U的BstDNA聚合酶和灭菌双蒸水；(2)阳性对照弓形虫DNA;(3)阴性对照灭菌双蒸水；(4)荧光显色剂；其中LAMP反应液阳性对照阴性对照荧光显色剂体积配比为23:2:2:1~3。所述的内侧引物对为上游内侧引物(FIP)和下游内侧引物(BIP),所述的外侧引物对为上游外侧引物(F3)和下游外侧引物(B3)。本发明所述的与弓形虫AF146527基因结合的外恻引物对和与弓形虫AF146527基因结合的内侧引物对为引物组1-7中的一组或两组，其巾引物组1F3:SEQIDN03B3:SEQIDN04FIP:SEQIDN05BIP:SEQIDN06;引物组2:F3:SEQIDN07B3:SEQIDN08FIP:SEQIDN09BIP:SEQIDNO10;引物组3:F3:SEQIDNOlB3:SEQIDNOllFIP:SEQIDN012BIP:SEQIDN013;引物组4:F3:SEQIDN014B3:SEQIDN015FIP:SEQIDN016BIP:SEQIDN017;引物组5:F3:SEQIDN07B3:SEQIDN018FIP:SEQIDN09BIP:SEQIDN019;引物组6:F3:SEQIDNO20B3:SEQIDN021FIP:SEQIDN022BIP:SEQIDN023;引物组7:F3:SEQIDN024B3:SEQIDN021FIP:SEQIDN022BIP:SEQIDN025。本发明所述的与弓形虫Bl基因结合的外侧引物对和与弓形虫Bl基因结合的内侧引物对为引物组8-16中的一组或两组，其中引物组8:F3:SEQIDN026B3:SEQIDN027FIP:SEQIDN028BIP:SEQIDN029;引物组9:F3:SEQIDNO30B3:SEQIDN031FIP:SEQIDN032BIP:SEQIDN033;引物组10:F3:SEQIDN034B3:SEQIDN035FIP:SEQIDN036BIP:SEQIDN037;引物组11:F3:SEQIDN038B3:SEQIDN039FIP:SEQIDNO40BIP:SEQIDNO化引物组12:F3:SEQIDN042B3:SEQIDN043FIP:SEQIDN044BIP:SEQIDN045;引物组13:F3:SEQIDN046B3:SEQIDN047FIP:SEQIDN048BIP:SEQIDN049;引物组14:F3:SEQIDNO50B3:SEQIDN051FIP:SEQIDN052BIP:SEQIDN053;引物组15:F3:SEQIDN054B3:SEQIDN055FIP:SEQIDN056BIP:SEQIDN057;引物组16:F3:SEQIDN058B3:SEQIDN059FIP:SEQIDNO60BIP:SEQIDN061。其中，所述的内侧引物对和外侧引物对是以上述的引物组所列出的作为为一个整体组使用，而且引物组两组同时使用的时候，应该尽量避免引物二聚体的形成。本发明所述的脱氧核苷酸包括0.020.04pmo1脱氧核糖腺嘌呤核苷酸、0.020.04nmol脱氧核糖鸟嘌呤核苷酸、0.020.04(imol脱氧核糖胞嘧啶核苷酸及0.020.04pmo1脱氧核糖胸腺嘧啶核苷酸，其中脱氧核糖腺嘌呤核苷酸脱氧核糖鸟嘌呤核苷酸脱氧核糖胞嘧嚏核苷酸脱氧核糖胸腺嘧啶核苷酸的浓度比为1:1:1:1。本发明所述的弓形虫AF146527基因序列为SEQIDNO1。所述的引物组1-7与所述的弓形虫AF146527基因上6个特定结合区域分别为见表l。表l:引物组l-7与所述的弓形虫AF146527基因的结合区域引物组引物名称6个结合区域5'端位置3'端位置<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>本发明所述的弓形虫B1基因序列SEQIDNO2。所述的引物组8-16与所述的弓形虫Bl基因上6个特定结合区域分别为见表2。表2:引物组8-16与所述的弓形虫Bl基因上的结合区域<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>BIP1526154514861505引物组14:F315511570B317461764FIP1588160716331654BIP1718173616571677引物组15:F314621479B316731692FIP1480149715251546BIP1641165915831604引物组16:F319912008B321卯2209HP2029204820692088BIP2161217821132134所述的6个特定区域是每组引物相对结合的特定区域。本发明所述的荧光显色剂为荧光染料SYBRGREENI。本发明的一种弓形虫的检测方法，包括下列步骤(1)待检样品DNA的提取；(2)环介导的等温扩增在三组装有23pL的LAMP反应液的反应管中分别加入2pL待检样品DNA、2pL已知的弓形虫DNA、2jiL灭菌双蒸水，同时在水浴锅上5565。C放置4590分钟，取出；(3)显色检测在反应管中加入13(iL上述的荧光显色剂；优选的在反应管中加入lpL上述的荧光显色剂。装有阳性对照的反应管的颜色变为绿色，装有阴性对照的反应管的颜色为黄色，如果装有待检测样品的反应管颜色为黄色则说明待检样品不含弓形虫，如颜色变为绿色，则说明样品中含有弓形虫。所述的弓形虫的检测方法，在步骤(2)中，取出前还可以再调水洛锅温度到809(TC反应2~10分钟，目的是能够终止反应，以便长期保存反应结果。本发明的反应原理为特殊设计一组用于环介导等温扩增的引物，该组引物包括两对引物，即内侧引物对(内侧上游引物和内侧下游引物)和外侧引物对(外侧上游引物和外侧下游引物)。这两对引物可分别与弓形虫基因上不同的6个特定区域结合，在有高度链置换DNA聚合酶的作用下完成对模板DNA的扩增。扩增过程分为两个阶段(1)反应起始阶段一端内侧引物先与模板结合并启动DNA合成。相同一端的外侧引物随后与模板结合启动DNA合成，并发生链置换释放出含有内侧引物序列的DNA单链。该单链DNA作为模板先后与另一端的内侧引物和外侧引物结合，启动DNA合成并发生链置换，最后形成一个初始的茎环DNA。而后以该茎环DNA为模板进行合成，反应进入循环阶段。(2)反应循环阶段内侧引物与初始茎环DNA结合启动链置换DNA合成，最后可产生另一个初始茎环DNA和一个新的两倍茎长度的茎环DNA。这些茎环DNA可作为模板继续与内侧引物结合启动链置换DNA合成，并且每次合成均可使茎环DNA的茎长度成倍增长。经过一个小时的等温扩增，目的DNA可累积109拷贝。最后通过荧光染料来观察扩增结果。釆用本发明所提供的弓形虫的检测试剂盒检测弓形虫，根据弓形虫基因序列保守区的特定区域设计了两对引物(内侧引物对和外侧引物对)，两对引物和弓形虫基因序列保守区的六个特定区域的序列完全配对，确保反应的彻底进行，也保证了弓形虫检测方法的特异性。本发明的弓形虫的检测方法检测灵敏度高，可检测出610个拷贝的目的DNA。与PCR检测方法比较，本发明的方法不需要昂贵的PCR仪，只需普通的金属水浴锅即可，并且检测结果使用荧光染料来观察即可，操作简单方便。本发明的弓形虫的检测方法特别适于基层临床医学检测工作及现场即时检测。具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例l试剂盒的制备(l)选用引物组1;(2)配制LAMP反应液将0.5(imolTris-HCl、0.25jimo1KC1、0.25(imol(NH4)2S04、0.04拜olTritonx-lOO、0.1(imolMgSO4、5|amol甜菜碱(Betaine)、0.02umol脱氧核苷酸(dNTPs)、0.04jimo1上游内侧引物(FIP)、0.04|imol下游内侧引物(BIP)、0.004pmol上游外侧引物(F3)、0.004)imol下游外侧引物(B3)、8U的BstDNA聚合酶，其余的为灭菌双蒸水，混合配置23pLLAMP反应液；(3)阳性对照2(iL弓形虫DNA;(4)阴性对照2pL灭菌双蒸水；(5)l)iL荧光染料SYBRGREENI。本实施例所用的0.02pmol脱氧核苷酸包括0.02|amol脱氧核糖腺嘌呤核苦酸、0.02pmol脱氧核糖鸟嘌呤核苷酸、0.02jxmol脱氧核糖胞嘧啶核苷酸及0.02pmol脱氧核糖胸腺嘧啶核苷酸。实施例2试剂盒的制备(1)选用引物组2;(2)配制LAMP反应液按照0.5pmolTris-HCl、0.25pmolKCl、0.25fimol(NH4)2S04、0.04|imolTritonx-100、0.2(_imolMgSO4、35|imol甜菜碱(Betaine)、0.04,ol脱氧核苷酸(dNTPs)、0.06|imol上游内侧引物(FIP)、0.06pmol下游内侧引物(BIP)、0.008|imol上游夕卜侧引物(F3)、0.008limol下游外侧引物(B3)、8U的BstDNA聚合酶，其余为灭菌双蒸水，配置23iaLLAMP反应液；(3)阳性对照2pl的弓形虫DNA;(4)阴性对照2pl的灭菌双蒸水；(5)3^1的荧光染料SYBRGREENI。本实施例所用的0.04nmol脱氧核苷酸包括0.04jamo1脱氧核糖腺喋呤核苷酸、0.04)imol脱氧核糖鸟嘌呤核苷酸、0.04pmo1脱氧核糖胞嘧嚏核苷酸及0.04pmo1脱氧核糖胸腺嘧啶核苷酸。实施例3试剂盒的制备(1)选用引物组3和4;(2)配制LAMP反应液按照0.5|imolTris-HCl、0.25pmolKC1、0.25pmol(NH4)2S04、0.04(imolTritonx-lOO、0.2|imolMgS04、20|imol甜菜碱(Betaine)、O脚mol脱氧核苷酸(dNTPs)、0.03,1上游内侧引物(FIP)、0.03pmol下游内侧引物(BIP)、0.006pmol上游夕卜侧引物(F3)、0.006,1下游外侧引物(B3)和8U的BstDNA聚合酶；(3)阳性对照2fiL的弓形虫DNA;(4)阴性对照2pL的灭菌双蒸水；(5)2pL的荧光染料SYBRGREENI。本实施例所用的0.03|imol脱氧核苷酸包括0.03|imol脱氧核糖腺喋呤核苷酸、0.03pmol脱氧核糖鸟嘌呤核苷酸、0.03pmol脱氧核糖胞嘧啶核苷酸及0.03pmol脱氧核糖胸腺嘧啶核苷酸。实施例4除引物序列选用引物组5、引物组6、引物组7、引物组8、引物组9、引物组IO、引物组ll、引物组12、引物组13、引物组14、引物组15、引物组16中的一组或两组外，其余的步骤同实施例l。实施例5选取弓形虫血液为检测对象。(1)血液DNA的提取收集血液，按血液抗凝剂=5:1的比例加入抗凝剂柠檬酸葡萄糖溶液，4。C下6000r/min离心15min，去除上清液，吸取血细胞约lmL悬浮于15mL裂解液中，并于37。C温育lh，缓慢加入20mg/mL蛋白酶K至100ug/mL，置于50。C水洛中3h,水洛期间间隔5min旋转液体，冷却至室温，加入等体积苯酚,用O.lmol/LTris-Cl平衡pH8.0，缓慢颠转lh左右使形成乳浊液，室温6500r/min离心15min，收集水相于新离心管。重复苯酚抽提2次。向最后一次抽提的水相中加入0.2倍体积10mol/L醋酸氨以及2倍体积的乙醇，旋转离心管混勻液体，形成沉淀，室温6500r/min离心15min,收集沉淀即为DNA。用70%乙醇洗涤DNA2次。待乙醇挥发后，加入TE溶解DNA，于4'C保存。提取的弓形虫DNA含有弓形虫AF146527基因和B1基因上内侧引物对和外侧引物对所结合的6个特定的区域。(2)环介导的等温扩增在3支装有23pL的LAMP反应液的反应管中加入2pL步骤(1)提取得到的弓形虫DNA,做为检测组；在3支装有23[iL的LAMP反应液的反应管中加入2pL弓形虫DNA，做为阳性对照组；在3支装有23pL的LAMP反应液的反应管中加入2fxL灭菌双蒸水，做为阴性对照组。上述反应管同时在水洛锅上55'C放置90分钟，取出。(3)显色检测在反应管中加入lpL荧光染料SYBRGREENI。检测结果装有阳性对照组的反应管的颜色变为绿色，装有阴性对照组的反应管中的颜色为黄色。装有检测组的反应管的颜色变为绿色，证明样品中含有弓形虫。其中LAMP反应液、弓形虫DNA、灭菌双蒸水和荧光染料SYBRGREENI均如实施例1中所述。本实施例检测的灵敏度最低可检测到6~10个拷贝的检测DNA。实施例6(1)、血液DNA的提取方法同实施例5。(2)、环介导的等温扩增在3支装有LAMP反应液的反应管中加入2pL步骤(1)提取得到的待检血液DNA,做为检测组；在3支装有23|aL的LAMP反应液的反应管中加入2pL弓形虫DNA,做为阳性对照组；在3支装有23|iL的LAMP反应液的反应管中加入2|aL灭菌双蒸水，做为阴性对照组。上述反应管同时在水洛锅上65'C放置45min,取出。(3)、显色检测在反应管中加入lpL荧光染料SYBRGREENI。检测结果装有阳性对照组的反应管的颜色变为绿色，装有阴性对照组的反应管中的颜色为黄色，装有检测组的反应管的颜色变为绿色，说明样品中含有弓形虫。其中LAMP反应液、弓形虫DNA、灭菌双蒸水和荧光染料SYBRGREENI均如实施例1中所述。本实施例检测的灵敏度最低可检测到6~10个拷贝的检测DNA。实施例71、血液DNA的提取同实施例5。2、环介导的等温扩增在3支装有23nL的LAMP反应液的反应管中加入2pL步骤(1)提取得到的待检血液DNA,做为检测组；在3支装有23jiL的LAMP反应液的反应管中加入2pL弓形虫DNA，做为阳性对照组；在3支装有23|iL的LAMP反应液的反应管中加入2pL灭菌双蒸水，做为阴性对照组。上述反应管同时在水洛锅上60。C放置70min,取出。3、显色检测在反应管中加入3pL荧光染料SYBRGREENI。检测结果装有阳性对照组的反应管的颜色变为绿色，装有阴性对照组的反应管中的颜色为黄色。装有检测组的反应管的颜色变为绿色，说明样品中含有弓形虫。其中LAMP反应液、弓形虫DNA、灭菌双蒸水和荧光染料SYBRGREENI均如实施例2中所述。本实施例检测的灵敏度最低可检测到610个拷贝的检测DNA。实施例81、血液DNA的提取同实施例5。2、环介导的等温扩增在3支装有23(aL的LAMP反应液的反应管中加入2pL步骤(1)提取得到的待检血液DNA，做为检测组；在3支装有23|iL的LAMP反应液的反应管中加入2pL弓形虫DNA,做为阳性对照组；在3支装有23pL的LAMP反应液的反应管中加入2pL灭菌双蒸水，做为阴性对照组。于水洛锅上65'C放置90min，调水浴锅温度到80'C反应10min,取出。3、显色检测在反应管中加入l)iL荧光染料SYBRGREENI。检测结果装有阳性对照组的反应管的颜色变为绿色，装有阴性对照组的反应管中的颜色为黄色。装有检测组的反应管的颜色变为绿色，说明检测组的样品中含有弓形虫。其中LAMP反应液、弓形虫DNA、灭菌双蒸水和荧光染料SYBRGREENI均如实施例1中所述。本实施例检测的灵敏度最低可检测到6~10个拷贝的检测DNA。实施例91、血液DNA的提取同实施例5。2、环介导的等温扩增在3支装有23pL的LAMP反应液的反应管中加入2(iL步骤(1)提取得到的待检血液DNA，做为检测组；在3支装有23(iL的LAMP反应液的反应管中加入2iiL弓形虫DNA，做为阳性对照组；在3支装有23pL的LAMP反应液的反应管中加入2pL灭菌双蒸水，做为阴性对照组。上述反应管同时在水洛锅上6(TC放置70min，调水洛锅温度到90。C反应2min,取出。3、显色检测在反应管中加入2pL荧光染料SYBRGREENI。检测结果装有阳性对照组的反应管的颜色变为绿色，装有阴性对照组的反应管中的颜色为黄色。装有检测组的反应管的颜色变为绿色，说明检测组的样品中含有弓形虫。其中LAMP反应液、弓形虫DNA、灭菌双蒸水和荧光染料SYBRGREENI均如实施例3中所述。本实施例检测的灵敏度最低可检测到610个拷贝的检测DNA。注其他组织的DNA可按照本领域常用的方法提取。序列表<110>中国农业大学<120〉一种弓形虫的检测试剂盒及其检测方法<130><160〉61<170>Patentlnversion3.3<210〉1<211>529<212>DNA<213>丐形虫<■>1ctgcsgggsggttgttttttt3tttttttttctttttgtttttctgsttt60ttgttttttttgactcgggcccsgctgcgtctgtcgggstgagaccgcggagccgaagtg120cgttttctttttttgscttttttttgttttttcacaggcssgctcgcctgtgcttggsgc180cacagssggg3csg33gtcg3aggggsctacagacgcgstgccgctcctccsgccgtctt240tstcaggsctgtagstgaaggcg3gggtgsggatgagggggtggcgtggt300tggg33gcg3cgagsgtcgggatgtttccggcttggctgcttttcctggs360gggtgg333agastgcgstccagscgagacgacgctttcctcgtggtg3t420ggcggsgsg33ttg33g3gtgcgagggsgacsgsgtcggaggcttggscg480gaggggtagg3g3gg33tccagstgcsctgtgtctgcsg529<210>2<211>2214<212>DNA<213>丐形虫<400>2gaattcgttcgacagaaagggagcaagagttgggactasi3tcg33gctgsgatgctcas360gtcgsccgcgsg3tgc3cccggctgsctcgaaccagatgtgct333ggcg1201"1"1"rrni"rrt1"「1"rr1~n广十a1~180cgcctccttcgtccgtcgt3ststcaggccttctgttctgttcgctgtctgtctagggc3240cccttactgctttgsggtcstatcgtcccatgaagtcgacC3cctgtttc300CtCtCttC3Ctgtcacgtacgscstcgcsttcasgggsagg3tctcgttc360gtgtattcgsgtccgccccctgaagaatgc33csttcttg420tgctgcctcctctcstggc3aatgccagaagsagggtscgtgttgcatca480tgt3tttcccgctggcs33ttgtscctccag3a33gcc3cctsgtstcgt540gcggc33tgtgccscctcgcctcttgggsg3g3g3cgctgccgctgtttt600gca33tga33sggsttC3ttttcgcagtacacc3gg3gt"tgg3ttttgtagsgcgtctct660cttcasgcsgcgt3ttgtcg3gt3gstcsg33sggaactgC3tccgttc3tgagtataag720gagacgctaatgtgtttgc3taggttgcagtcsctg3cga780gctcccctctgctggcgaaasgtga33ttcatgagtatctgtgc3sctttggtgtattcg840cag3ttggtcgcctgcs3tcg3tsgttg3catcgtgasagactgcggatg3CttC3CtCCcgtcgcaccagatgcctagacgtgttatgaggaacatattsggg3tgctcagaaaatggc3C3gtatcsc3cg3sagggggtcgcacc3aagagatggsgtgaaccaccacttcsctttgtgc3g33gc3ttgcccgtccctccattccgt3C3gtcttcttcttttagcctc33七3gcaggstgscgcccaccgacgssctctctgtsgtscsgsgacgtgtcatcsggagcsttttt3gastgcacctttcggscctcgtctcttcaagasctatctgtgtcgacascagaacagctgcsgtccgg33sgt3gc3cctasactgctaagsscgtcgccgctsctgcccagttgtcstga33ttsatattgttagtaaagC3ttC3333tgca33ccatgcgcagccatC3gctt33C3cttctgaaaatggsttscttcta33gcgtttctaaagtagccgc3csatgcatgttgtgcctcsccccccsgctcgtgcg<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>33aggcgsgggtgsgg3tg<210>4<211〉18<212>DNA<213>人工序列<400>4sgcctccgsctctgtctc<210>5<211>42<212〉DMAC3cgascgcttt333g33c3ggaga3g33g900gagatagaagtcgctgcggagacagcgaag960gcagcagaggagtgccgggcaagaaaatga1020acaastctattgaggtttcgcgsagaggag1080sgscgtgccgcatgtcgctaagcc3tcgg31140attacagttccgttgattcgtctgatggtg1200sactggct3gttgtt3ttttgaagasgacg1260aaaatcgatggtgtcacgttttttgtcaga1320aaactgcaacaactgctctagcgtgttcgt1380a3g3ga3cattcc3gc3scttctgcctttg1440tccctcct3tctttcsgcc33cccagc33a15Q03g33ggc3333cgcgccatc3cg33csctc1560acs3ggttggtcgcttasttttctgt3tst162033caaccgtgcsa33gg3tcgccacctggt1680tatatctctcaaggaggactggcaacctgg1740atsgaaagccstgaggc3Ctccaacgggcg1800acggtccgggtga33cwtagagagtsctg1860ccatcgacgtagacccagaaatgaggcgag1920agttccggtcgagaggctaaaccacaaaag1980aaagcagttggtgatggttgcctcgagttc2040cccaccacgcagaatcatgctttcccagtg2100cggastgctaaggggstcgcctaLcgtagc32160ctcattctcctttcgtgcgcggct22141818<213>人工序列<400〉5caggaaaagcagccaagccgttttgttgggaagcgacgagag42<210〉6<211>43<212>DNA<213>人工序列<400〉6gac3ccggaatgcgstccsgatttttcgccctcttctccaetc43<210〉7<211>18<212〉D船<213>人工序列<綱>7gettggsgeescag33gg18<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列〈400>8ctttttccsccctccsggsa20<210>9<211>46<212>DNA<213>人工序列<400>9atctctcctccaagacggctggttttgacagaagtcgaaggggact46<210>10<211>44<212>DNA<213>人工序列<400>10tgaaggcgagggtgaggatgagttttgccaagccggaaacatct44<210>11<211〉18<212>DNA<213〉人工序列<400>11gtccaagcctccgactct18<210>12<211>44<212>DNA<213〉人工序列<400>12ttccaccctccsggsa3agcsgttttttgggsagcgscgagagt44<210>13<211>43<212>DNA<213>人工序列<■>13acaccggaatgcgatccagacttttctcgccctcttctccact43<210>14<211>18<212>DMA<213〉人工序列<400>14gttgggsagcgacgsgag18<210>15<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>15cagtgcatctggattcct18<210〉16<211〉46<212>DNA<213>人工序列<400>16ccggtgtctctttttcc3cccttttttcgg3g3ggg3ga3gstgtt46<210>17<211>42<212>DNA<213〉人工序列<400>17cctcgtggtgatggcggagsttttctcccttcgtcc3agcct42<210>18<211>19<212>DNA<213>人工序列<■>18tcgcattccggtgtctctt19<210>19<211>46<212>DNA<213>人工序列<■>19gtggttgggsagcgacgsgattttcaccctccsggaaaagcag43<210〉20<211>18<212〉DNA<213〉人工序列<400>20tgggaagcgscgsgsgtc18<210>21<211>20<212>DMA<213〉人工序列<■〉21tggattcctctcctscccct20<210>22<211〉45<212>DNA<213>人工序列<400>22ggatcgcattccggtgtctcttttttsagatgtttccggcttggc45<210〉23<211>43<212>DMA<213〉人工序列<400〉23tcgtggtgstggcgg3gsga3ttttcctcctcccttcgtccsa43<210〉24<211>18<212>DNA<213>人工序列<400〉24acgagagtcggagaggga18<210>25<211〉44<212〉DNIA<213〉人工序列<400>25gacgacgctttcctcgtggtgttttcaagcctccgactctgtct44<210>26<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>26gggagc33gagttgggscts20<210>27<211>20<212>DNA<213>人工序列<■〉27<210>28<211>45<212>DMA<213>人工序列<400〉28tgacgcctttagcacatctggtttttgatgctcaaagtcgaccgc45<210>29<211>45<212>DNA<213〉人工序列<400〉29tcgcaacggagttcttcccagttttggcctgatattacgacggac45<210〉30<211〉20<212>DNA<213>人工序列<400>30cagstgtgct333ggcgtcs20<210>31<211>20<212>DNA<213>人工序列<■>31acgtgscsgtgssgsgsgga20<210〉32<211〉45<212>DNA<213>人工序列<400>32aggcggascc33cgg333tccttttttgctgttctgtcct3tcgc45<210〉33<211〉45<212>DMA<213>人工序列<400>33gttcgctgtctgtct3gggc3cttttggtggtcg3Cttcstgggs45<210>34<211〉19<212>DNA<213>人工序列<400>34caaagtcgaccgcgagatg19<210>35<211>19<212>DMA<213>人工序列<■>35ggtggtcgacttcatggga19<210〉36<211>46<212>DNA<213>人工序列<■>36gtctgggasg3actccgttgcgttttgctg3ctcg3acc3gstgtg46<210>37<211>43<212>DNA<213>人工序列<400〉37ttccgcctccttcgtccgtcttttctcttgcagt3agggtgcc43<210>38<211>20<212>DNA<213>人工序列<彻>38tgtacctccagsassgccsc20<210>39<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>39gcgtctctttcsttcccac320<210>40<211>46<212>DNA<213>人工序列<400>40cggcsgcgtctcttcctcttttttttct3gt3tcgtgcggcsstgt46<210>41<211>46<212〉DNA<213>人工序列<400>41agagcgtctctcttcaagcagcttttatgaacggatgcsgttcctt46<210>42<211〉18<212>DMA<213>人工序列<400>42gcggsg3c3gcgsagsct18<210>43<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>433Ctgtgcc3ttttctgsgcs20<210>44<211〉45<212>DNA<213>人工序列<■〉44ggcatctcattttcttgcccggttttcggstgscttcsctcccgt45<210〉45<211>44<212>DNA<213〉人工序列<400>45gaggtttcgcgs3gaggsgggttttcgatggcttagcgacatgc44<210>46<211〉20<212>DNA<213〉人工序列<400>46cgtctcc3ttccgtscsgtc20<210>47<211>19<212>DNA<213〉人工序列<400>47tctgcgsgtgttcgtgstg19<210〉48<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>48t3ggsgggaggcgtc3tcctgttttsc3ttccsgcsscttctgcc45<210>49<211〉44<212>DMA<213〉人工序列<400>493gccs3cccagcaa3C3Ccgttttcgcgttttgccttctctttg44<210>50<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>50scg33cactcgcagsgstga20<210>51<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>51actgcagctgttctgttgt19<210>52<211>46<212>DNA<213〉人工序列<400>52tgttgsggtccgasaggtgcstttttsggsc33ggttggtcgctt346<210>53<211>44<212>DNA<213〉人工序列<400>53cgtgcs3saggstcgccscctttttgttgccsgtcctccttgsg44<210>54<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>54gatgacgcctccctcct318<210>55<211>20<212>DNA<213〉人工序列<400>55gcttgaagagscaccaggtg20<210〉56<211>44<212〉DNA<213>人工序列<400〉56gcgcgttttgccttctctttgttttttctttcagccsacccage44<210〉57<211〉45<212>DNA<213〉人工序列<400〉57tcatc3gg3C3sggttggtcgcttttscggttgttgaggtccg3345<210〉58<211>18<212>DNA<213>人工序列〈400>58gcgcsgccatcsgctt3318<210>59<211〉20<212>DNA<213>人工序列<400〉59cgcscgsasggag33tg3gc20<210>60<211〉44<212>DNA<213〉人工序列<400〉60atgattctgcgtggtgggcttttttgcctcgsgttccttctgsa44<210>61<211>44<212>DNA<213>人工序列<400>61t333gt3gccgcac33tgcggsttttggggtg3ggc3ca3C3tg4权利要求1、一种弓形虫检测试剂盒，包括如下组分(1)LAMP反应液23μLLAMP反应液含有0.5μmolTris-HCl、0.25μmolKCl、0.25μmol(NH4)2SO4、0.04μmolTriton-100、0.1～0.2μmol硫酸镁、5～35μmol甜菜碱、0.02～0.04μm脱氧核苷酸、0.04～0.06μmol的与弓形虫AF146527基因或B1基因结合的内侧引物对、0.004～0.008μmol的与弓形虫AF146527基因或B1基因结合的外侧引物对、8U的BstDNA聚合酶和灭菌双蒸水；(2)阳性对照弓形虫DNA；(3)阴性对照灭菌双蒸水；(4)荧光显色剂；其中LAMP反应液∶阳性对照∶阴性对照∶荧光显色剂体积配比为23∶2∶2∶1～3。2、如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的与弓形虫AF146527基因结合的外侧引物对和与弓形虫AF146527基因结合的内侧引物对为引物组1-7中的一组或两组，其中引物组1F3:SEQIDN03B3:SEQIDN04FIP:SEQIDNO5BIP:SEQIDN06;引物组2:F3:SEQIDN07B3:SEQIDN08FIP:SEQIDNO9BIP:SEQIDNO10;引物组3:F3:SEQIDNOlB3:SEQIDNOllFIP:SEQIDN012BIP:SEQIDN013;引物组4:F3:SEQIDN014B3:SEQIDN015FIP:SEQIDN016BIP:SEQIDN017;引物组5:F3:SEQIDN07B3:SEQIDN018FIP:SEQIDNO9BIP:SEQIDN019;引物组6:F3:SEQIDNO20B3:SEQIDN021FIP:SEQIDN022BIP:SEQIDN023;引物组7:F3:SEQIDN024B3:SEQIDN021FIP:SEQIDN022BIP:SEQIDN025。3、如权利要求1或2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的与弓形虫Bl基因结合的外侧引物对和与弓形虫Bl基因上结合的内侧引物对为引物组8-16中的一组或两组，其中引物组8:F3:SEQIDNO26B3:SEQIDNO27FIP:SEQIDNO28BIP:SEQIDNO29;引物组9:F3:SEQIDNO30B3:SEQIDNO31FIP:SEQIDNO32BIP:SEQIDNO33;引物组10:F3:SEQIDNO34B3:SEQIDNO35FIP:SEQIDNO36BIP:SEQIDNO37;引物组11:F3:SEQIDNO38B3:SEQIDNO39FIP:SEQIDNO40BIP:SEQIDNO41;引物组12:F3:SEQIDNO42B3:SEQIDNO43FIP:SEQIDNO44BIP:SEQIDNO45;引物组13:F3:SEQIDNO46B3:SEQIDN047FIP:SEQIDN048BIP:SEQIDN049;引物组14:F3:SEQIDNO50B3:SEQIDN051FIP:SEQIDN052BIP:SEQIDN053;引物组15:F3:SEQIDN054B3:SEQIDN055FIP:SEQIDN056BIP:SEQIDN057;引物组16:F3:SEQIDN058B3:SEQIDN059FIP:SEQIDNO60BIP:SEQIDN061。4、如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的脱氧核苷酸包括如下组分0.020.04nmo1脱氧核糖腺嘌呤核苷酸、0.020.04pmo1脱氧核糖鸟嘌呤核苷酸、0.020.04|imol脱氧核糖胞嘧啶核苷酸及0.02~0.04pmol脱氧核糖胸腺嘧啶核苷酸，其中脱氧核糖腺嘌呤核苷酸脱氧核糖鸟嘌呤核苷酸脱氧核糖胞嘧嗖核苷酸脱氧核糖胸腺嘧啶核苷酸的浓度比为1:1:1:1。5、如权利要求1-4任一所述的检测试剂盒，其特征在于所述的荧光显色剂为荧光染料SYBRGREENI。6、一种利用权利要求1-5任一项所述的试剂盒检测弓形虫的方法，其包括下列步骤(1)待检样品DNA的提取；(2)环介导的等温扩增在三组装有23pL的LAMP反应液的反应管中分别加入2pL待检样品DNA、2pL弓形虫DNA、2pL灭菌双蒸水，在水洛锅上5565。C放置4590分钟，取出；(3)显色检测在反应管中加入l3pL的荧光显色剂。7、如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤(3)中在反应管中加入lpL的荧光显色剂。8、如权利要求6或7所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤(2)还包括调水浴锅温度到8090。C反应210分钟。全文摘要本发明提供了一种弓形虫的检测试剂盒，其包括如下组分(1)LAMP反应液；(2)阳性对照；(3)阴性对照；(4)荧光显色剂。本发明还提供了一种应用本发明的弓形虫检测试剂盒检测弓形虫的检测方法。采用本发明的弓形虫检测试剂盒和检测方法，检测灵敏度高，6～10个拷贝即可检测出目的DNA，操作简单方便，特别适于基层临床医学检测工作及现场即时检测。文档编号C12Q1/68GK101182583SQ200710178190公开日2008年5月21日申请日期2007年11月27日优先权日2007年11月27日发明者吴文学,凯师,张跃伟,朱引洁,王文欢,勋索,杰邹,郭盼盼申请人:中国农业大学