微生物合成γ-亚麻酸油脂的方法

专利名称：微生物合成γ-亚麻酸油脂的方法
技术领域：
本发明涉及GLA油脂的制备方法，具体是指一种利用微生物发酵法来生物合成GLA油脂的方法。 二
背景技术：
GLA (Y-Linolenic acid)化学名为十八碳三稀酸，是a-亚麻酸的同分异构体，在某种意义上是人 体必须脂肪酸之一，它在生物体内经过复杂的代谢过程，产生多种次生代谢产物，主要形成二高一Y-— 亚麻酸(DHGL)或花生四烯酸(AA)，进而转化为前列腺素(P)、白三烯(I)和凝血恶烷(T)。由于GLA 和其系列代谢物在免疫系统、心血管系统、生殖系统、内分泌系统中都具有重要而广泛的生理作用，其潜 在的药用价值表现在以下几个方面
GLA对多种革兰氏阴性菌、阳性菌及藻类的生长抑制作用已被证实。 一般认为GLA进入细胞壁后，结 合或插入细胞膜，前列腺素(PG)改变膜的流动性及其它生理性质，从而使生长受到抑制。在革兰氏阴性菌 类群中GLA可以抑制铜绿假单胞菌(Pseudoraonas aeluginosa)和大肠杆菌等。当GLA达到500 ug/ml 时，15分钟即可杀死全部的细菌。同样，许多藻类生物在GLA存在下生长也受到抑制，如绿藻纲(Chloroll yceae)的蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidoa)、莱因衣藻(Chlamydo皿ras reinhardii)以及针胞藻纲 (Raidophyceae)的(Heterosigma akashiwa)。
最新的研究表明GLA具有抗HIV感染作用在添加Y —亚麻酸锂(LiGLA)的培养基中培育四天后，大 约有90X的被HIV感染的细胞被杀死，同时未被感染的对照组细胞只损失了 20%。在添加抗氧化剂后， LiGLA的毒性明显降低，所以认为LiGLA对HIV慢性感染细胞的选择性杀伤效果可能与膜脂过氧化状态的 变化有关。类似的实验也证实了上述结果。
GLA已被确认对40多种肿瘤细胞有明显的抑制作用，包括乳腺癌、肺癌、皮肤癌、子宫癌、卵巢癌、 前列腺癌细胞及胰腺癌细胞等。实验表明在体外培养的3株不同肿瘤细胞中，仅一株不能对吸收的GLA进 行延长和脱氢，GLA对其表现最大毒性(致死量5 u g / ml),其余2株能不同程度地将GLA代谢为DGLA或 M，致死量则为10-20ug/ml，因此GLA的抗肿瘤活性可能在于分子自身而非其代谢产物，供给GLA可能 改变了细胞的脂肪酸组成，增加了多不饱和脂肪酸的含量，改变了细胞膜脂酰基团的组成，正是这些结构 变化影响了膜上运输蛋白、离子通道、 一些受体及酶的性质。Jiang等人发现在体外实验中，LiGLA可以 抑制HGF/SF引起的肝癌细胞转移性及侵袭性，而且细胞表面E—粘着蛋白也发生了变化，E—粘着蛋白 是抑制细胞移动的胞间连接分子，用GLA处理24h后，在肺癌细胞、乳腺癌细胞、黑素癌细胞及肝癌细胞 中，E—粘着蛋白表达量显著增加，亚油酸(LA)和花生四烯酸(AA)均不能导致类似的变化。GLA也可以促 进a—Catenin(-种在E —粘着蛋白和细胞骨架之间的连接蛋白)的表达"，而在许多肿瘤细胞中a— Catenin的含量明显低于正常水平。
近年来的研究发现，GLA对类风湿性关节炎、肠炎、脉管炎、肾炎等多种炎症均具有疗效或改善作用。 实验表明，喂服3 6 g/d的GLA可以导致血清脂类中的GLA、 DHGLA和M增加，嗜中性白细胞磷脂中 DGLA的量亦明显增多，但其中GLA和M水平无任何变化。嗜中性白细胞合成更少的白三烯I34(P<0. 05) 和血小板活化因子，这些数据揭示，GLA的抗炎效果是通过在嗜中性白细胞等炎症相关细胞中升髙DHGLA 含量水平并减弱M生物合成来实现的。
3GLA的抗粥样硬化作用巨噬细胞和血管平滑肌细胞(VSMC)是粥样硬化中主要反应细胞，将巨噬细胞 从喂以不同剂量GLA的雌鼠腹膜中分离，用不同抗体处理后，与VSMC共培养，发现GLA可明显降低VSMC 的繁殖，升高cAMP水平。类似的研究也证明了VSMC的DNA合成能被8.2X i0. 1X的GLA所阻止。另外， GLA及其代谢物DHGLA、 M、 PGE还具有调节血脂的功能，可以降低血浆总胆固醇、甘油三酯和低密度脂 蛋白，升高高密度脂蛋白含量，并能抑制血小板的聚集和动脉粥样斑块的形成，使实验性心肌梗死区縮小。 所以GLA在临床上可以用于防治冠心病、心肌梗死、阻塞脉管炎等疾病。
治疗高血压GLA在肾脏内可以转化为AA，进一步产生血压调节物质一前列腺素(PGE2), PGE2,能够 通过激活血管平滑肌腺苷酸环化酶，增加cAMP水平而舒张血管，调节机体水和电解质代谢，增加肾血流 量或与其它血管活性激素相互作用等方式来参与血压调节。此外，GLA还被发现可以用于糖尿病的辅助治 疗，锌缺乏症的改善，y射线放疗的增敏，对于亨廷顿氏舞蹈症、苯丙酮尿症、更年期综合症、帕金氏症、 哮喘、湿症、甲状旁腺亢进等多种病症也具有不同的治疗效果。
GLA的生物资源主要有植物和微生物资源两部分。其植物资源主要分布于柳叶菜科(Onagraceae)紫草 科(Boraginaceae)、玄参科(Sccrophulariaceae)、虎耳草科(Saxifragaceae)等高等植物中。GLA最初是 从月见草中发现的，1919年Heidushka和Luft在月见草种籽中发现了这种物质，他们认为它是a -亚麻 酸的同分异构体，把它命名为y-亚麻酸。1949年Riley证实y -亚麻酸为全顺式-6 , 9 ， 12 -十八碳 三烯酸。月见草含油率在23 % 30 %之间，其中含亚油酸70 % 80% ， y -亚麻酸含量在8 % 10 %之间， 其不饱和脂肪酸总量高达90 %以上。目前全世界大约有十多个国家种植这种植物，我国主要产区是东北和 内蒙古。除月见草外，还有其它的含油植物种籽中也存在y-亚麻酸。如后来发现在蛇麻(啤酒花，Hop)和 大麻(洋麻，Hemp)中也含有y-亚麻酸。1994年武丽萍报道了在我国青藏及邻近地区分布的微孔草 (MicroulaSikkimensisHeiiisli)含油量4oX 一5。％ ，亚麻酸8.1%. 1988年Whiskey发现玻璃苣(Borago. offieinalis )中y -亚麻酸含量达21 % 25 %。 1988年和1990年，Traifler和我国的迟仁智分别报 道在黑加仑(Black currant, Ribes nigrum L .)种子油中y-亚麻酸的含量也达到15 % 20 %。近 年来发现的一些GLA含量很高的植物品种。如1998年赵景年报道我国特产的华山松(PinusArmandiFranch) 种子含油量为51.2%， y—亚麻酸含量为37.93% 。 2006年赵虹桥等发现三叶木通籽含油量为此31.8%, 其中GLA为35. 4-42. 4% 。另外侧柏子，马尾松，满天星(starf lower)等也富含GLA。
但是这些植物资源大都分布于高寒地带，来源少，人工种植生长期长，耗费大量土地资源，产量受气 候变化的影响很大，因而原料的来源受到限制，远远不能满足日益增长的市场需求。因此GLA的另一种资 源-微生物受到了重视。
真菌发酵法进行y-亚麻酸生产要综合考虑菌体生物量、菌体油脂含量以及油脂中y-亚麻酸含量三 个因素，这三个指标都较高的菌株才是进行发酵生产的理想菌株。用真菌发酵来生产GLA的研究和开发工 作最初是1976年在英国赫尔大学(University of Hull) Ratledge实验室进行的。经过大量的菌株筛选 工作，找到了一个适合于工业化生产的菌株(Mucor circinelloides)。并由J & E Sturge公司在1985 年率先进行了商业化生产，发酵规模在220吨。日本的科学家们也较早进行了这方面的研究。1986年开 始，日本出光石油化工公司已经采用微生物发酵法制取、生产y -亚麻酸油脂.两国已推出含微生物y-亚 麻酸油脂的功能性食品和系列化妆品，使微生物油脂的综合利用迈出了实用化的第一步。我国在这方面的 研究起步较晚，目前，虽有许多科研单位和高校从事这发面的研究。但大多数还处于实验室研究阶段，尚 未形成大规模工业化生产。
三

发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种菌种优良、工艺先进、生产成本低、产量高、无环境污染的工业化 生产Y-亚麻酸(GLA)油脂的方法。
本发明的制备方法包括
1. 一种高表达苹果酸酶及Y-亚麻酸合成酶的巻枝毛霉(Mucor circinelloides)菌株的筛选。筛选是通过 紫外线和甘草酸进行诱变的方法而获得Y -亚麻酸的高产菌株。
2. 巻枝毛霉的发酵工艺，其步筹包括
(1) 原始菌种的保持和活化将冷冻保藏的巻枝毛霉108. 16菌种接种到斜面培养基上，在25。C培养四至 五天。
(2) 液体培养将活化后的菌种接种于500ml的液体培养介质中培养，培养器皿为带磁力搅拌的1L培养 瓶，搅拌速度为120转/分，温度为28-30。C,时间为16-24小时。
(3) 扩大培养液体菌种以10%的比例接种到5L实验室用发酵罐中培养。通气量为1. 0-1. 5L/min，搅拌 400-500转/分，pH为5. 5-6. 5，温度为此30。C，时间为18-24小时。
(4) 一级发酵将扩大培养的菌种以1(^的接种量加入到50-500L的发酵罐中，通气量为1. 0-1. 5L/rain， 搅拌400-500转/分，pH为5.5-6.5，温度为此3(TC,时间为18-24小时。用显微镜观察，无细菌污染， 可转入二级发酵。
(5) 二级发酵将一级发酵得到的茵种以10%的比例加入到500-5000L 二级发酵灌中，通气量为 1. 0-1. 5L/min，搅拌400-500转/分，pH为5.5-6.5，温度为此3(fC,时间为18-24小时。经观察菌丝粗 壮健康无污染，可转入三级发酵。
(6) 三级发酵将二级发酵得到的菌种以10%的比例加入到5000-50000L三级发酵灌中，通气量为 1. 0-1. 5L/min，搅拌400-500转/分，pH为5.5-6.5,温度为此30°C，时间为18-24小时。经观察菌丝粗 壮健康无污染，可转入四级发酵。
(7) 四级发酵将三级发酵得到的菌种以5-l(m的比例加入到50000-500000L四级发酵灌中，培养液为产 脂培养介质。通气量为1. 5-2. OL/min，搅拌400-500转/分，pH为5.5-6.5,温度为此3(TC,时间为四到 五天。
(8) 菌丝体收藏经离心过滤收取菌丝体，然后将菌丝体与GLA促进剂混合在4。C下保存16-24小时。
(9) 四级发酵可采用流加式连续化生产工艺，提高生产效率，降低成本。
3. 微生物菌丝体的油脂抽提工艺，其步骤包括
(1) 将菌丝体在60-90° C下真空干燥15-20分钟。
(2) 将干菌丝体机械粉碎后用有机溶剂萃取。萃取剂为石油醚或异己烷，萃取酸度在pH4.5-5.5，最佳配 比为50g干菌体/lL石油醚，萃取时间为8-16h，操作温度宜低于50'C。
(3) 有机溶剂通过蒸溜后回收循环使用。最大程度上减少环境污染。
4. 斜面培养基配方葡萄糖3-5%， NH4C1 0. 25-0. 35%,酵母提取液0. 15%，磷酸盐0. 3-0. 7%， MgS04 0.15%， 琼脂2%，马铃薯汁10% 。
5. 液体培养基配方糖蜜3-4%,酵母提取液0. 15%,尿素0. 5-1. 0%,磷酸盐0. 3-0. 7%, MgS04 0. 15%, CaC12 0.005-0.01% 。
6. 产脂培养基配方糖蜜10-15%,酵母提取液0. 15-0. 3%，尿素0. 3-0. 5%,磷酸盐0. 3-0. 7%, MgS04 0. 15%, CaC12 0.005—0.01% 。7.油脂抽取后的菌饼，可作为氮源加入到培养基中，纤维素可作为造纸工业的原料。 微生物油脂产品质量测定方法
1. 油脂含量的测定索氏抽提法。
2. GLA含量的测定
油脂经甲脂化后，进行气相色谱分析 柱3mmX2000mm,担体Chromosorbw 检测鉴定器氢火焰，柱温195°C
本发明的优点
1. 其菌种优良，生产量大，本发明所采用的菌种为巻枝毛霉(Mucorcircinelloides)菌种编号为108. 16。 该菌种生长快，三天就形成孢子，在连续的四级发酵中，该菌生长健康迅速，工业生产性能稳定，在50 吨以上的发酵罐中达到很高的发酵水平。干菌体收率10-30%,油脂35-55%, Y-亚麻酸18-29%，是目 前生产GLA油脂的高产菌株。
2. 原材料成本低。在发酵工艺中，采用炼糖厂的下脚料-糖蜜作碳源，无机氮以及豆饼或菌饼为氮源。在 最大程度上降低了生产成本，可比原有的生产工艺降低成本约80% 。
3. 工艺先进科学。本发明工艺流程先进成熟，从一级到三级发酵采用间歇式操作流程，而四级发酵采用连 续式发酵工艺流程，大大提高了生产率，是目前国内外最先进的发酵工艺。在连续50吨的规模生产中， 保持稳定及高产量。本发明的技术指标与国内外同行业比较见下表。
微生物发酵生产GLA油脂的产量 生产或研究单位 干菌体(%) 油脂/菌体(%) GLA(%)
上海工业微生物所8. 96
南开大学天津药业1. 9-2. 844-44. 79. 76
南开大学生物工程25-29.332. 8-44. 79. 44
北京医学院生化室1.9515.4327.16
安徽大学生物工程系1. 45-2. 0519.31
华南理工大学生物系1.8524. 8-44. 811.27
山东农科院原子能所3. 1226. 2814. 13
沈阳药科大学制药4. 9238.612.7
长春圣洁生物科技有限公司3. 5-4.125-3920-24
日本出光石油公司28-308-10
英国J & E Sturge Ltd2015-18
本发明10-3035-5518-29
月见草12-157-8
6
。气相色谱分析条件GC-16A气相色谱仪，G-R3A数据处理器。色谱 ，固定液5呢乙二酸二乙二醇聚酯(DEGS),载气N2，流量42ral/min, ，进样温度245° C ,检测器温度245° C。4.发酵水平已达到大规模工业化生产阶段。本发明技术已达到50-500吨四级发酵水平，而目前国内的几 家研究单位工艺水平尚处以实验室或中试研究阶段，并未形成工业化生产规模。
四具体实施方案
实施例1
(1) .原始菌种的保持和活化将巻枝毛霉108. 16菌种接种到斜面培养基上，在25。C培养四至五天。
(2) .液体培养将活化后的菌种接种于500ml的液体培养介质中培养，培养器皿为带磁力搅拌的1L培养 瓶，搅拌速度为120转/分，温度为28-30。C,时间为18小时。
(3) .扩大培养液体菌种以K^的比例接种到5L实验室用发酵罐中培养。通气量为1. 2L/min,搅拌420 转/分，pH为5. 5-6. 0，温度为此30°C,时间为18-24小时。
(4) . 一级发酵将扩大培养的菌种以10%的接种量加入到50-500L的发酵罐中，通气量为1. 2L/miri，搅 拌420转/分，pH为5.5-6.0，温度为此30°(:,时间为18-24小时。用显微镜观察，无细菌污染，可转入 二级发酵。
(5) . 二级发酵:将一级发酵得到的茵种以1(^的比例加入到500-5000L二级发酵灌中，通气量为1.2L/min， 搅拌420转/分，pH为5.5-6.0,温度为此30。C，时间为18-24小时。经观察菌丝粗壮健康无污染，可转 入三级发酵。
(6) .三级发酵将二级发酵得到的菌种以10%的比例加入到5000-50000L三级发酵灌中，通气量为 1.2L/min,搅拌420转/分，pH为5.5-6.0,温度为此30°C，时间为18-24小时。经观察菌丝粗壮健康无 污染，可转入四级发酵。
(7) .四级发酵将三级发酵得到的菌种以5%的比例加入到50000-500000L四级发酵灌中，培养液为产脂 培养介质。通气量为1. 2L/min,搅拌420转/分，pH为5.5-6.0，温度为此30。C，时间为四到五天。
(8) .菌丝体收藏经离心过滤收取菌丝体，然后将菌丝体与GLA促进剂混合在4。C下保存16-24小时。
(9) .将菌丝体在60-90。C下真空干燥15-20分钟。得干菌体裁20g/1。
(10) .将干菌丝体机械粉碎后用有机溶剂萃取。萃取剂为石油醚，萃取酸度在pH 5.0，配比为50g干菌 体/lL石油醚，萃取时间为9h,操作温度宜低于50'C。油脂得率39%, GLA 25% 。
上述实施例中培养基配方
斜面培养基配方葡萄糖3.5%, NH4C1 0.3%,酵母提取液O. 15%，磷酸盐0.4%, MgS04 0.15%,琼脂2%， 马铃薯汁10% 。液体培养基配方糖蜜3-4%,酵母提取液0. 15%,尿素0. 5-1. 0%,磷酸盐0. 3-0. 7%， MgS04 0. 15%, CaC12 0.005-0.01% 。
产脂培养基配方糖蜜10-15%,酵母提取液0. 15-0. 3%,尿素0. 3-0. 5%，磷酸盐0. 3-0. 7%, MgS04 0. 15%， CaC12 0.005-0.01% 。
实施例2
(1) .原始菌种的保持和活化将巻枝毛霉108. 16菌种接种到斜面培养基上，在25-C培养四至五天。
(2) .液体培养将活化后的菌种接种于500ml的液体培养介质中培养，培养器皿为带磁力搅拌的1L培养 瓶，搅拌速度为125转/分，温度为28-30°(:，时间为19小时。
(3) .扩大培养液体菌种以10y。的比例接种到5L实验室用发酵罐中培养。通气量为1. 3L/min,搅拌450 转/分，pH为6.0-6.5，温度为此3(fC，时间为18-24小时。
(4) . 一级发酵将扩大培养的菌种以10%的接种量加入到50-500L的发酵罐中，通气量为1.3L/min,搅 拌450转/分，pH为6.0-6.5,温度为此30。C,时间为18-24小时。用显微镜观察，无细菌污染，可转入 二级发酵。
(5) . 二级发酵将一级发酵得到的菌种以10%的比例加入到500-5000L二级发酵灌中，通气量为1. 3L/min, 搅拌450转/分，pH为6.0-6.5,温度为此3(TC，时间为18-24小时。经观察菌丝粗壮健康无污染，可转 入三级发酵。
(6) .三级发酵将二级发酵得到的菌种以10%的比例加入到5000-50000L三级发酵灌中，通气量为 1.3L/min,搅拌450转/分，pH为6.0-6.5，温度为此30。C，时间为18-24小时。经观察菌丝粗壮健康无 污染，可转入四级发酵。
(7) .四级发酵将三级发酵得到的菌种以6%的比例加入到50000-500000L四级发酵灌中，培养液为产脂 培养介质。通气量为1.3L/min，搅拌450转/分，pH为6.0-6.5，温度为此3(TC,时间为四到五天。
(8) .菌丝体收藏经离心过滤收取菌丝体，然后将菌丝体与GLA促进剂混合在4nC下保存16-24小时。
(9) .将菌丝体在60-90°C下真空干燥15-20分钟。得干菌体15g/1。
(10) .将干菌丝体机械粉碎后用有机溶剂萃取。萃取剂为石油醚，萃取酸度在pH 5.1，配比为52g干菌 体/lL石油醚，萃取时间为llh，操作温度宜低于5CTC。油脂得率51%， GLA 19% 。
本实例中培养基配方斜面培养基配方'.葡萄糖3-5%, NH4C1 0. 25-0. 35%，酵母提取液0. 15%,磷酸盐0. 3-0. 7%, MgS04 0.15%, 琼脂2%,马铃薯汁10% 。
液体培养基配方糖蜜3-4%,酵母提取液0.亂尿素0. 5-1. 0%,磷酸盐0. 3-0. 7%， MgS04 0. 15%， CaC12 0.005-0.01% 。
6.产脂培养基配方糖蜜10-15%,酵母提取液0. 15-0. 3%,尿素0. 3-0. 5%，磷酸盐0. 3-0. 7%, MgS04 0. 15%， CaC12 0. 005-0. 01% 。
实施例3
(1) 原始菌种的保持和活化将巻枝毛霉108.16菌种接种到斜面培养基上，在25-C培养四至五天。
(2) 液体培养将活化后的菌种接种于500ml的液体培养介质中培养，培养器皿为带磁力搅拌的1L培养瓶， 搅拌速度为130转/分，温度为28-30°C，时间为20小时。
(3) 扩大培养液体菌种以1(W的比例接种到5L实验室用发酵罐中培养。通气量为1. 5L/min，搅拌480转 /分，pH为5.8-6. 2，温度为此30。C,时间为18-24小时。
(4) 一级发酵将扩大培养的菌种以10%的接种量加入到50-500L的发酵罐中，通气量为1.5L/min,搅拌 480转/分，pH为5.8-6.2，温度为此30°C,时间为18-24小时。用显微镜观察，无细菌污染，可转入二 级发酵。
(5) 二级发酵将一级发酵得到的菌种以10y。的比例加入到500-5000L二级发酵灌中，通气量为1. 5L/min, 搅拌480转/分，pH为5.8-6.2，温^K为此30。C,时间为18-24小时。经观察菌丝粗壮健康无污染，可转 入三级发酵。
(6) 三级发酵:将二级发酵得到的菌种以10%的比例加入到5000-50000L三级发酵灌中，通气量为1. 5L/min， 搅拌480转/分，pH为5.8-6.2,温度为此3(fC，时间为18-24小时。经观察菌丝粗壮健康无污染，可转 入四级发酵。
(7) 四级发酵将三级发酵得到的菌种以7%的比例加入到50000-500000L四级发酵灌中，培养液为产脂培 养介质。通气量为1. 5L/min，搅拌480转/分，pH为5.8-6.2，温度为此30。C，时间为四到五天。
(8) 菌丝体收藏经离心过滤收取菌丝体，然后将菌丝体与GLA促进剂混合在4aC下保存16-24小时。
(9) 将菌丝体在60-90。C下真空干燥15-20分钟。得干菌体25g/1。
(10) 将干菌丝体机械粉碎后用有机溶剂萃取。萃取剂为异己烷，萃取酸度在pH5.2,配比为49g干菌体/lL 异己垸，萃取时间为12h，操作温度低于50'C。油脂得率46%， GLA 22% 。有机溶剂通过蒸溜后回收循环 使用。
本实例中培养基配方斜面培养基配方葡萄糖3-5%， NH4C1 0. 25-0. 35%,酵母提取液0. 15%,磷酸盐0. 3-0. 7%， MgS04 0. 15%, 琼脂2%,马铃薯汁10% 。
液体培养基配方糖蜜3-4%，酵母提取液O. 15%,尿素O. 5-1.0%,磷酸盐0.3-0. 7%， MgS04 0. 15%, CaC12 0.005-0.01% 。
产脂培养基配方糖蜜10-15%,酵母提取液0. 15-0. 3%，尿素0. 3-0. 5%,磷酸盐0. 3-0. 7%， MgS04 0. 15%， CaC12 0.005—0.01% 。
权利要求
1. 一种微生物合成高含γ-亚麻酸(GLA)油脂的方法，其特征在于先通过发酵法来培养卷枝毛霉本(Mucorcircinelloides 108.16)，然后用萃取的方法从卷枝毛霉的菌丝体中提取油脂，即得成品高含γ-亚麻酸(GLA)油脂.萃取后所得菌饼可作为氮源加入到发酵培养液中.
2. 根据权利要求1所述一种微生物合成高含Y-亚麻酸(GLA)油脂的方法，其特征在于所述巻枝毛霉 (Mucor circinelloides 108.16)是一枝高表达苹果酸酶及Y-亚麻酸合成酶的菌枝.
3. 根据权利要求1所述一种微生物合成高含Y -亚麻酸(GLA)油脂的方法，其特征在于所述:巻枝毛霉的 发酵工艺包括如下步骤:(l)原始菌种的活化巻枝毛霉108.16将菌种接种到斜面培养基上，在25。C培养 四至五天.(2)液体培养将活化后的菌种接种于500ml的液体培养介质中培养，培养器皿为带磁力搅拌的 1L培养瓶搅拌速度为120转/分，温度为28-30°C，时间为16-24小时.(3) 扩大培养液体菌种以10% 的比例接种到5L实验室用发酵罐中培养.通气量为1.0-1.5L/min,搅拌400-500转/分，pH为5.5-6.5,温度 为此30°C,时间为18-24小时.(4) 一级发酵将扩大培养的菌种以10%的接种量加入到50-500L的发酵 罐中，通气量为1.0-1.5L/min,搅拌400-500转/分，pH为5.5-6.5,温度为30°C,时间为18-24小时.用显微 镜观察，无细菌污染，可转入二级发酵.(5) 二级发酵将一级发酵得到的菌种以10%的比例加入到 500-5000L二级发酵灌中，通气量为1.0-1.5L/min,搅拌400-500转/分，pH为5.5-6.5,温度为30。C,时间为 18-24小时.经观察菌丝粗壮健康无污染，可转入三级发酵.(6)三级发酵将二级发酵得到的菌种以10% 的比例加入到5000-50000L三级发酵灌中，通气量为1.0-1.5L/min，搅拌400-500转/分，pH为5.5-6.5,温度 为30°C,时间为18-24小时.经观察菌丝粗壮健康无污染，可转入四级发酵.(7)四级发酵将三级发酵得 到的菌种以5-10%的比例加入到50000-500000L四级发酵灌中，培养液为产脂培养介质.通气量为 1,5-2,0L/min，搅拌400-500转/分，pH为5.5-6.5,温度为30°C,时间为四到五天.(8)菌丝体收藏经离心过 滤收取菌丝体，然后将菌丝体与GLA促进剂混合在4°C下保存16-24小时.
4. 根据权利要求3所述一种微生物合成高含Y-亚麻酸(GLA)油脂的方法，其特征在于所述四级发酵可采 用流加式连续化生产工艺，提高生产效率，降低成本.
5. 根据权利要求1所述一种微生物合成高含Y -亚麻酸(GLA)油脂的方法，其特征在于所述微生物菌丝体 的油脂抽提工艺包括:(1)将菌丝体在60-卯。C下真空干燥15-20分钟.(2)将干菌丝体机械粉碎后用 有机溶剂萃取.萃取剂为石油醚或异己烷，萃取酸度在pH 4.5-5.5,最佳配比为50g干菌体/lL石油醚，萃 取时间为8-16h，操作温度宜低于50°C.(3) 有机溶剂通过蒸溜后回收循环使用.最大程度上减少环境污 染.
6. 根据权利要求3所述一种微生物合成高含Y -亚麻酸(GLA)油脂的方法，其特征在于所述斜面培养基 配方为葡萄糖3-5%， NH4C10.25-0.35%,酵母提取液0.15°/。，磷酸盐0.3-0.7%， MgS04 0.15%，琼脂2%，马 铃薯汁10%.
7. 根据权利要求3所述一种微生物合成高含Y -亚麻酸(GLA)油脂的方法，其特征在于所述液体培养基 配方为糖蜜3-4%，酵母提取液0.15%，尿素0.5-1.0%，磷酸盐0.3-0.7%， MgS04 0.15%, CaCl2 0.005-0.01%.
8. 根据权利要求3所述一种微生物合成高含Y -亚麻酸(GLA)油脂的方法，其特征在于所述产脂培养基配 方为糖蜜10-15%，酵母提取液0.15-0.3%,尿素0.3-0.5%,磷酸盐0.3-0.7%， MgS04 0.15%, CaCl2 0.005-0.01%
全文摘要
一种微生物发酵生产γ-亚麻酸油脂的方法。包括培育苹果酸酶及γ-亚麻酸合成酶的高表达菌株，原始菌种的活化扩大培养、一级发酵、二级发酵、三级发酵、四级发酵、脱水、烘干、油脂抽提等工艺步骤，其菌种优良，生产量大，干菌体收率10-30％，油脂35-55％，γ-亚麻酸18-29％，生产成本低，生产工艺原材料成本可降低50-70％，半连续或连续发酵工艺先进科学、成熟，可大规模工业化生产，已达到50-500吨的四级发酵水平。
文档编号C12P7/64GK101445815SQ20071017806
公开日2009年6月3日 申请日期2007年11月26日 优先权日2007年11月26日
发明者宋元达 申请人:北京有容建业科技发展有限责任公司