多层光照生物反应器及用其培养光合成微生物的方法

专利名称：多层光照生物反应器及用其培养光合成微生物的方法
技术领域：
本发明涉及一种多层光照生物反应器及用其培养光合成微生物的方法。更具体的说，本发明涉及一种用两种分别适于微生物营养生长和由微生物产生有用代谢物的不同环境来培养光合成微生物的多层光照生物反应器，及一种用这种光照生物反应器培养光合成微生物的方法。
背景介绍近来，藻类生物技术已引起全世界的日益关注，并成为生物技术领域的研究前沿。藻类生物技术是一个从几种光合成微生物中发现并分离各种高价值有用代谢物的领域。获得的有用代谢物可作为医药物质和健康食品，例如高价值抗生素，维生素及生理活性物质，染料，例如类胡萝卜素及biloprotein，纯化的化合物，例如微生物絮凝剂(bioflocculant)、多羟基化合物及碳水化合物，及备选燃料，例如油及碳水化合物。
在光合成微生物中，一些需要不同的环境进行营养生长及产生有用代谢物。因此，典型地用两相方法从具有多阶段生活周期的光合成微生物中获得有用代谢物。两相方法包括维持光合成微生物营养生长的最适生长条件及维持适于被培养微生物在静止期产生有用代谢物的胁迫条件(stressed condition)。由于上述获得的有用代谢物是在细胞分裂已停止的静止期产生的，因此被称为次级代谢物或非生长相关的产物。
具有复杂生活周期的光合成微生物包括红球藻(Haematococcus sp.)、杜氏藻(Dunaliella sp.)、绿球藻(Chlorococcum sp.)、小球藻(Chlorellasp.)、伞藻(Acetabularia sp.)、微囊藻(Microcystis sp.)、念珠藻(Nostocsp.)和颤藻(Oscillatoria sp)。特别是红球藻物种产生作为抗氧化剂及具有其他生物活性功能的虾青素。
例如，如美国专利5,882,849和6,022,701所述，通过两阶段培养方法用光合成微生物生产高价值的有用代谢物，该方法使用两个具有适于营养生长及产生有用代谢物的不同环境条件的培养器。详细地，在第一阶段，通过在一个培养器中维持适于营养生长的最适生长条件而快速达到微生物的大规模培养。在第二阶段，通过在另一个培养器中维持适于产生有用代谢物(次级代谢物)的最适环境条件而用第一阶段获得的生物量有效产生有用代谢物。
与通过浆轮在池系统或在水渠中进行循环培养的户外培养相比较，使用两个分离的分别具有适于营养细胞生长和产生有用代谢物的不同环境的培养器进行培养的传统培养技术具有一定的经济利益，即利于相对高密度培养光合成微生物并抑制非所需微生物的污染。
然而，传统培养技术存在许多问题有待解决，如下所述。由于进行第一阶段营养生长和第二阶段产生有用代谢物的两个培养器是单独制备的，因此传统技术需要较高的土地费用或设备费用及较高的操作费用，而且需要可进行复杂操作的熟练工程师。因此，传统技术不适于用光合成微生物有效进行高价值有用代谢物的工业化生产。

发明内容
本发明进行的全面深入研究旨在解决现有技术中遇到的问题，结果发现，用特定光合成微生物在一种内部分割出营养生长区和有用代谢物产生区的光照生物反应器生产高价值有用代谢物时，可有效降低营养生长及产生有用代谢物所需的劳动力和能量，从而更经济地生产有用代谢物。
因此本发明的一个目的是提供一种多层光照生物反应器，可通过在两个阶段同时使用同一种光源来节约培养光合成微生物的劳动力，从而更经济地生产有用代谢物。
本发明的另一个目的是提供一种用该多层光照生物反应器培养光合成微生物的方法。
为了达到上述目的，本发明提供一种多层光照生物反应器，包括至少一个含微生物及培养基以使微生物营养生长的第一培养区；至少一个与第一培养区侧表面层邻并含有培养基和微生物以生产有用代谢物的第二培养区；及一个置于第一和第二培养区之间的透明分离区以彼此分开第一和第二培养区，在该处光照生物反应器的内部和外部分别提供第一和第二培养区，从而使照射用于培养的光照生物反应器的阳光或人工光源次序通过第二培养区和透明分离区到达第一培养区。
另外，本发明提供一种多层光照生物反应器，包括用于营养细胞生长的第一培养区，产生有用代谢物的第二培养区，透明分离区及发射光到光照生物反应器的光照射单元，其中第一培养区不与光照射单元接触，而第二培养区与光照射单元接触，这样可使从光照射单元发出的光次序通过第二培养区和透明分离区到达第一培养区。
此外，本发明提供一种用多层光照生物反应器培养光合成微生物的方法。
附图简述本发明上述及其他目的、特征及其他优点将在以下结合附图的详细描述中得到更详细的了解

图1a和1b是依照本发明的一个实施方案中具有外部照射的双层平板式光照生物反应器的透视图和横切面视图；图2a和2b是依照本发明的另一个实施方案中具有外部照射的双层垂直圆柱式光照生物反应器的透视图和横切面视图；图3a和3b是依照本发明的另一个实施方案中利用阳光的管式光照生物反应器的透视图和横切面视图；图4a和4b是依照本发明的另一个实施方案中具有内部照射的双层平板式光照生物反应器的透视图和横切面视图；图5a和5b是图4a和4b中具有内部照射的双层平板式光照生物反应器连续排列的透视图和横切面视图；图6a和6b是依照本发明的另一个实施方案中具有内部和外部照射的三层平板式光照生物反应器的透视图和横切面视图；图7a和7b是图6a和6b中具有内部和外部照射的三层平板式光照生物反应器连续排列的透视图和横切面视图；图8a和8b是依照本发明的另一个实施方案中具有内部照射的双层垂直圆柱式光照生物反应器的透视图和横切面视图；
图9a和9b是图8a和8b中具有内部照射的双层垂直圆柱式光照生物反应器连续排列的透视图和横切面视图；图10a和10b是依照本发明的另一个实施方案中具有内部和外部照射的三层圆柱式光照生物反应器的透视图和横切面视图；图11a和11b是图10a和10b中具有内部和外部照射的三层垂直圆柱式光照生物反应器连续排列的透视图和横切面视图；图12a和12b是具有外部光源的双层垂直圆柱式气升(air-lift)光照生物反应器的透视图和横切面视图，其中气体通过其底部注入光照生物反应器；图12c所示的是使用图12a的光照生物反应器，依照实施例1的培养时间新鲜细胞重量的变化；图12d所示的是使用图12a的光照生物反应器，依照实施例1的培养时间虾青素水平的变化；图13a和13b是具有外部光源的双层垂直圆柱式气升光照生物反应器的透视图和横切面视图，其中气体通过其底部和上部注入光照生物反应器；图13c所示的是使用图13a的光照生物反应器，依照实施例2的培养时间新鲜细胞重量的变化；图13d所示的是使用图13a的光照生物反应器，依照实施例2的培养时间虾青素水平的变化；图14a所示的是使用图13a的光照生物反应器，依照实施例3的培养时间新鲜细胞重量的变化；和图14b所示的是使用图13a的光照生物反应器，依照实施例3的培养时间虾青素水平的变化。
实施本发明的最佳方式本发明提供一种多层光照生物反应器。
本发明的多层光照生物反应器包括含有微生物和培养基以使微生物进行营养生长的第一培养区，及与第一培养区侧表面层邻的含有培养基和微生物的产生有用代谢物的第二培养区，其中这两个培养区用一个透明分离区彼此隔离开。
由于本发明的多层光照生物反应器的上述结构，可对直接暴露在光照中的第二培养区提供过多的光能量以产生有用代谢物，从而诱导第二培养区的特定微生物利用高密度光能量并积累代谢物。在通过第二培养区的传播过程中，光能量被培养基中的生物量的相互光栅效应(mutual shadingeffect)消弱，从而对第二培养区的光照射表面的相对表面释放较低的密度。然后向位于第二培养区侧表面并位于多层光照生物反应器内部的第一培养区中的光合成微生物提供低密度的残余光能量，在该处，微生物利用提供的光进行光合作用而进行营养生长。
如以下公式1所述，根据Beer-Lambert定律，光能量随距光源的距离(如δ增加)及培养基中微生物的浓度(如p增加)而成指数衰减[公式1]I＝Ioexp(-σρδ)其中I是通过光吸收体系传输的光的光密度，Io是光源的起始密度，σ是吸收系数，ρ是光吸收体系中微生物的浓度，δ是光吸收体系的厚度。
当光通过用于产生有用代谢物的第二培养区传播时，光的衰减受起始密度(Io)，第二培养区中生物量的浓度(ρ)，微生物的体积及色素含量和光穿过的深度(δ)影响。另外，应该向第一培养区提供适于营养细胞生长水平的光能量，从而进行营养细胞生长。当提供的光能量很低时，则不能在第二培养区积累有用代谢物。相反，当提供的光能量太高时，第一培养区的营养细胞生长则受到抑制，未用于光合作用的光能量转化成热能，从而增加培养基的温度。
对本发明的多层光照生物反应器进行光照射的典型实例是阳光，为了使阳光穿过第二培养区以产生有用代谢物，并穿过透明分离区以到达第一培养区进行营养细胞生长，将第二培养区置于光照生物反应器的外侧，而将第一培养区置于光照生物反应器的内侧。
除了阳光，本发明包括一个作为人工光源的光照射单元。为了使光照射单元发出的光传送到第二培养区以产生有用代谢物，并穿过透明分离区而到达第一培养区进行营养细胞生长，将光照射单元安装在紧邻第二培养区而不紧邻第一培养区的位置。本发明可用的光源可以是一个或多个从荧光灯、卤素灯、光纤、氖管、发光二极管及其他光合有效辐射物(PARs)中选择的光源。也就是说，光照生物反应器可单独利用阳光或与一个或多个人工光源联合使用。对后者而言，当阳光作为基本光能量源时，根据季节(特别是冬季)、时间(特别是晚上)及天气(特别是多云天气)因素和营养细胞生长及代谢物的积累情况，可对不足的光能量通过使用附加光源进行补充。具体来说，如图6、7和10所示，当产生有用代谢物的第二培养区在光照生物反应器的最外表面和最内表面形成时，阳光照射到光照生物反应器最外表面的第二培养区，而光照射单元的人工光则照射在光照生物反应器最内表面的另一个第二培养区。
另外，为了避免整个光密度被严重破坏，例如短路，光照射单元包含多个独立的由单独动力源操作的单元。
当使用人工光源时，可对光的提供的数量、波长及照射时间和照射时段进行控制，从而适于在多层光照生物反应器的第二培养区中进行营养细胞生长，或在第一培养区中产生有用代谢物，但并不仅限于上述控制方式。
本发明的光照生物反应器可设计成各种形状。优选地，光照生物反应器可设计为从包括矩形平板状、圆柱状、管状和其他三维几何形状的组中选择的形状。
另外，为了达到工业应用的大规模培养体积，光照生物反应器可作为单元模块进行连续堆积。如果需要，平板状光照生物反应器和光源可排列为一维多层的三明治形式，而垂直圆柱式光照生物反应器可排列为二维多层形式。另外，本发明的光照生物反应器可排列为三维多层形式。优选地，光照生物反应器的体积由产生有用代谢物的生物加工的体积和厂址的面积所决定。而且可容易地通过从多层结构中除去一些含有光照生物反应器和光源的单元模块或阻断单元模块的管线连接而使培养体积按比例缩小。
另一方面，为了向第一和第二培养区的底部注入气体，从而使提供的CO2和培养基向上流动，光照生物反应器可设计为气升形式，或附加机械搅动工具(例如叶轮和磁力搅拌器)的搅拌池形式。
在夏季，培养基的温度由于光源产生的热、外部的高温、培养微生物的代谢热及微生物未吸收的光能转化的热能而增加。相反，在冬季或晚上，由于培养温度降低到最适范围以下，则营养细胞生长和有用代谢物的产生受到抑制。关于这一点，如果培养基温度需要维持在适于光合作用微生物生长和产生有用代谢物的最适范围，可用冷水或热水通过热交换器和喷雾器控制温度或使用遮光单元。
参考附图，如下描述本发明的光照生物反应器的优选实施方案。
在第一个实施方案中，本发明提供一种利用阳光的光照生物反应器。
图1a和1b举例说明具有外部照射的双层平板式光照生物反应器。光源3照射平板式光照生物反应器的相对表面。两个产生有用代谢物的第二培养区1形成于光照生物反应器的相对侧表面，其包括两个发射光的表面。进行营养细胞生长的第一培养区2层邻在两个第二培养区1之间。光穿过第二培养区1到达第一培养区2。
图2a和2b举例说明具有外部照射的双层垂直圆柱式光照生物反应器。光源3照射垂直圆柱式光照生物反应器的外表面。产生有用代谢物的第二培养区1形成于光照生物反应器的外部周围，其包括发射光的表面，从而形成环状横截面，而进行营养细胞生长的第一培养区2紧接置于第二培养区1的内部。光穿过第二培养区1到达第一培养区2。
图3a和3b举例说明在外部培养利用阳光的管状光照生物反应器。光3直接照射用于产生有用代谢物并置于被阳光3照射的光照生物反应器一部分的第二培养区1的外表面。进行营养细胞生长的第一培养区2层邻第二培养区1底层侧表面。阳光穿过第二培养区1到达第一培养区2。
图4a和4b举例说明具有内部照射的双层平板式光照生物反应器。对光照生物反应器提供光3的光照射单元置于平板式光照生物反应器的中心部分。两个产生有用代谢物的第二培养区1形成于光照射单元的相对侧面的光照生物反应器中，其包括光照射表面。两个进行营养细胞生长的第一培养区2分别层邻第二培养区1的外表面。光穿过第二培养区1到达第一培养区2。
图5a和5b举例说明图4a和4b的具有内部照射的双层平板式多层光照生物反应器的连续排列，其中每个光照生物反应器用作一个单元模块。单元模块的排列和光照方向如图5a和5b所示。
图6a和6b举例说明具有内部和外部照射的三层平板式多层光照生物反应器，它是图1和4的光照生物反应器的复合形式。光线3照射平板式多层光照生物反应器的相对侧表面和中心部分。用于产生有用代谢物的第二培养区1形成于包括光照生物反应器的发射光表面的区域，而进行营养细胞生长的第一培养区2层邻第二培养区1之间。光穿过第二培养区1到达第一培养区2。
图7a和7b举例说明图6a和6b的具有内部和外部照射的三层平板式多层光照生物反应器的连续排列，其中每个光照生物反应器用作一个单元模块。单元模块的排列和光照射方向如图7a和7b所示。
图8a和8b举例说明具有内部照射的双层垂直圆柱式多层光照生物反应器。向光照生物反应器提供光源3的光照射单元位于垂直圆柱状多层光照生物反应器的中心部分。用于产生有用代谢物的第二培养区1形成于围绕光照射单元的内部区域并包括光照生物反应器的发射光表面。进行营养细胞生长的第一培养区2层邻第二培养区1的外表面。光穿过第二培养区1到达第一培养区2。
图9a和9b举例说明具有内部照射的双层垂直圆柱式光照生物反应器的连续排列，其中每个光照生物反应器用作一个单元模块。单元模块的排列和光照射方向如图9a和9b所示。
图10a和10b举例说明具有内部和外部照射的三层垂直圆柱式光照生物反应器。两个向光照生物反应器提供光源3的光照射单元位于垂直圆柱式多层光照生物反应器的外部和中心部分。一个用于产生有用代谢物的第二培养区1形成于包括光照生物反应器的发射光表面的外部。另一个第二培养区1形成于围绕着在光照生物反应器中心的光照射单元的内部区域，并在其中包括光照生物反应器的发射光表面。进行营养细胞生长的第一培养区2层邻第二培养区1之间。光穿过第二培养区1到达第一培养区2。
图11a和11b举例说明三层垂直圆柱式光照生物反应器的连续排列，其中每个光照生物反应器用作一个单元模块。单元模块的排列和光照射方向如图11a和11b所示。
另外，本发明提供一种用多层光照生物反应器培养光合成微生物的方法。具体来说，本方法基于分批式、连续式和补料分批式培养。但这些培养技术仅用于举例说明本发明，本发明不受这些培养技术的限定。
更具体来说，在用本发明的多层光照生物反应器进行分批式培养时，本发明提供一种培养光合成微生物的方法，包括将光合成微生物接种到进行营养细胞生长的第一培养区及产生有用代谢物的第二培养区(步骤1)；对第二培养区进行照射以使光合成微生物扩增并最大程度积累有用代谢物(步骤2)及从第一和第二培养区收获培养的光合成微生物(步骤3)。
在分批式培养的步骤1中，将光合成微生物接种到本发明的光照生物反应器的每个培养区中。此处，根据需要向第一和第二培养区接种相同或不同浓度的微生物。而且，也可以在调整至每个培养区的光密度后使用微生物。接种到两个培养区的微生物主要进行营养生长。应在不产生造成光密度严重下降的相互光栅效应的密度下接种。因此，接种浓度可根据细胞体积而改变。例如，小球藻物种接种密度为103到108细胞/ml，而红球藻物种接种密度为103到107细胞/ml。培养基根据光合成微生物而确定。
在分批式培养的步骤2中，为了诱导营养细胞生长及产生有用代谢物，用光线照射用于产生有用代谢物的第二培养区。在此，以最适于光合成微生物的营养生长的强度提供初始光，从而使接种的光合成微生物进行营养生长。例如，对红球藻而言，以40到200μmol/m2/s的强度将光提供在第二培养区的发射光表面以产生有用代谢物。当光通过第二培养区到达第一培养区时衰减到10到50μmol/m2/s以进行营养细胞生长。另外，pH、温度和气体的注入量均可根据光合成微生物而确定。例如，红球藻物种在25℃，pH7.0及5％CO2的条件下生长，CO2注入速率为10ml/min，伴随95％的空气。
当上述强度的光以预定时段照射到光照生物反应器时，第二培养区的光合成微生物进入营养细胞生长停止的静止期。在静止期，微生物积累次级代谢物。静止期根据初始光强度，接种光合成微生物的种类及接种浓度而改变。在以下描述的一个实施例中的条件下，发现静止期维持10天，虾青素积累增加到20-360mg/L(见图13c和13d)。
相比较营养细胞生长的照射光而言，在静止期后，为了形成最适于产生有用代谢物的环境(胁迫环境)，用相对高强度的光照射光照生物反应器。最适于产生有用代谢物的光强度可根据光合成微生物而改变。例如，对红球藻而言，最适于产生虾青素的光强度为200到2,000μmol/m2/s。在使用高强度光后，第一和第二培养区的光合成微生物表现出不同的生长特性。具体来说，用高强度光照射的第二培养区的光合成微生物积累高浓度的有用代谢物，而第一培养区的微生物用衰减到适于营养细胞生长的强度的光进行照射。例如，对红球藻细胞而言，表面光强度衰减到10-100μmol/m2/s，这样细胞可进行营养生长。这些结果如图14a和14b所示。如上所述，以适合于初步诱导光合成微生物产生和积累有用代谢物的高强度将光照射到光照生物反应器。当光穿过区域以产生有用代谢物后，其被用于进行营养细胞生长。该方法将最大效率地利用提供给光照生物反应器的光源。
在分批式培养的步骤3中，当有用代谢物积累到最大水平时，从产生有用代谢物的第一培养区收获生物量。然后，将有用代谢物与生物量分离，并进行纯化和浓缩。进行营养细胞生长的第一培养区的生物量可用作下一次分批式培养的接种物。
在用多层光照生物反应器对光合成微生物进行分批式培养时，可临时或连续提供营养物质。
在用本发明的多层光照生物反应器进行连续式培养时，本发明提供一种培养光合成微生物的方法，包括将分批式培养中进行营养细胞生长的第一培养区中的光合成微生物转移到用于产生有用代谢物的第二培养区，并向第一培养区重新接种传代培养的光合成微生物的细胞(步骤1)；对第二培养区进行照射以使光合成微生物增殖并积累有用代谢物(步骤2)；及从第二培养区收获光合成微生物并重复步骤2和3(步骤3)。
在连续式培养的步骤1中，与分批式培养的步骤1一样，将光合成微生物接种到光照生物反应器的每个培养区中。具体来说，在分批式培养后，其中已积累有用代谢物的光合成微生物从第二培养区收获，将第一培养区的光合成微生物转移到第二培养区。对于营养生长而言，光合成微生物新进行传代培养、收获并与培养基一起接种到第一培养区中。选择性地，将生长在第一培养区的部分光合成微生物转移到第二培养区，而留在第一培养区的微生物用新鲜培养基重新进行培养以进行新的培养。
此处，光合成微生物通过蠕动泵(peristaltic pump)或大气压力进行传送。蠕动泵推动包括第一培养区中高密度生物量的培养液通过可收缩管道进入第二培养区。对使用大气压力而言，包括细胞的培养液从第一培养区进行收集，然后通过大气压力的推动转移到第二培养区。使用上述方法，将新传达培养的细胞接种到第一培养区。这些方法可对光合成微生物进行连续式培养。
在连续式培养的步骤2中，光照射第二培养区以产生有用代谢物。与分批式培养的步骤2一样，以高强度提供光，从而形成最适于产生有用代谢物的环境(胁迫环境)，优选地，以与分批式培养步骤2的最后阶段相同的强度提供。在这种情况下，可达到相同的效率。
连续式培养的步骤3是连续或大量生产光合成微生物的中间步骤，在该步骤重复连续式培养的步骤1和2。具体来说，在连续式培养的步骤3中，重复连续式培养的步骤1和连续式培养的步骤2，在步骤1中将第一培养区中生长的光合成微生物转移到第二培养区，之后将新传代培养的微生物细胞接种到第一培养区中，在步骤2中，将高强度的光照射到光照生物反应器以与营养细胞生长同步进行有用代谢物积累。因此，连续式培养的步骤3可进行积累有用代谢物的光合成微生物的连续和大规模培养。
在用本发明的多层光照生物反应器进行补料分批式培养中，当随着分批式和连续式培养物的进程而耗尽营养物质时，需要向光照生物反应器中额外补充营养物质以维持适于光合成微生物营养生长及由该微生物产生有用代谢物的浓度。例如，维持最初水平的氮浓度有利于红球藻的营养生长(Enzyme Microbial Technol.，2003，33403-409)。因此，红球藻的补料分批式培养优选地向第一培养区添加氮源以进行营养细胞生长。
适于依照本发明的多层光照生物反应器及用该光照生物反应器的培养方法的光合成微生物包括所有在最适于营养细胞生长及产生有用代谢物的环境中表现出差异的光合成微生物，由红球藻物种、杜氏藻物种、绿球藻物种、小球藻物种、伞藻物种、微囊藻物种、念珠藻物种和颤藻物种例证。
本发明将参考以下实施例及附图进行详细描述。然而，以下实施例仅用于举例说明本发明，本发明不受这些实施例限制。
实施例1光合成微生物的培养在本实验中，使用的是如图12a和12b所示的双层垂直圆柱式气升光照生物反应器，通过其底部注入气体。从装置在垂直圆柱外部的光源8发出的光照向光照生物反应器。用于产生有用代谢物的第二培养区1形成于直接暴露在光下外套区。进行营养细胞生长的第一培养区2位于第二培养区的内部核心区域。气升光照生物反应器由容积700ml的外套及容积700ml的内部核心组成。
通风装置安装在每个培养区的底部。气体供给装置5和6分别对第二和第一培养区向上提供气体，从而使培养基向上流动。线性荧光灯8作为光源提供光。而且，光照生物反应器也安装了稳定器和开关。
雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)UTEX16用作光合成微生物，其产生高价值代谢物——虾青素。株生长在MBBM(Modified Bold’s BasalMedium)中。
分批式培养的步骤1光合成微生物的接种雨生红球藻株UTEX16以密度1.2×104细胞/ml的密度接种到光照生物反应器的外套(产生有用代谢物的第二培养区)及内核(进行营养细胞生长的第一培养区)。
分批式培养的步骤2光合成微生物的培养从线性荧光灯8发出的光以80μmol/m2/s的强度对光照生物反应器照射10天。然后，将光强度增加到770μmol/m2/s并维持该水平到下一个步骤。
为了使培养液向上流动，混合培养基并提供碳源，将含有5％CO2的气体以通风速度100ml/min注入到外套和内核。
连续式培养的步骤1光合成微生物的转移和再接种在培养开始的24天后，用蠕动泵，从第一和第二培养区收集光合成微生物并转移到用于产生有用代谢物的第二培养区中。然后，将新传代培养的微生物细胞接种到进行营养细胞生长的第一培养区中。
连续式培养的步骤2光合成微生物的培养光以770μmol/m2/s的表面强度照射光照生物反应器以在外套中诱导由雨生红球藻株UTEX16积累虾青素，而且同时诱导雨生红球藻株在内核(第一培养区)进行连续生长。此处，初始光在穿过外套(第二培养区)时衰减到适于营养细胞生长的强度。其他培养条件与分批式培养步骤2的第二段中所述相同。
实验实施例1当根据本发明分批式培养的步骤1和2培养光合成微生物时，对新鲜细胞重量和虾青素水平进行测定。
在该实验中，使用实施例1的双层垂直圆柱式气升光照生物反应器，其中从光照生物反应器底部注入气体(参见图12a和12b)。
将雨生红球藻UTEX16用作光合成微生物，其产生高价值代谢物——虾青素((3S，3′S)-3，3′-二羟基-胡萝卜素-4，4′-二酮)。雨生红球藻株生长在MBBM(Modified Bold’s Basal Medium)中。
光照生物反应器外套区域的表面强度维持在80μmol/m2/s。雨生红球藻株UTEX16以密度1.2×104细胞/ml接种到外套和内核区域中。
为了使培养液向上流动，混合培养基并提供碳源，将含有5％CO2的气体以通风速度100ml/min注入到外套和内核。
在上述条件下将雨生红球藻株培养24天。两天后，以两天的间隔测定新鲜细胞重量和虾青素水平。结果如图12c和12d所示，其中箭头表示低强度光到高强度光的转折点。
如图12c和12d所示，雨生红球藻株UTEX16在外套与内核间的密度相同时开始生长。但发现从第六天起，雨生红球藻株UTEX16在外套的生长速度比内核快。这是由于外套中高密度生物量的光栅效应的增加所致，其导致对于内核的营养细胞生长不足的光强度。
从第十天起，光强度增加到770μmol/m2/s的表面强度，以诱导雨生红球藻株UTEX16在外套积累虾青素，而且同时在内核诱导雨生红球藻株的连续生长。此处，初始光在穿过外套时衰减到适于营养细胞生长的强度。将高浓度营养物质周期性添加到内核以适于雨生红球藻株的最适生长，而外套维持营养物质饥饿的条件。如图12c和12d所示，在外套和内核，雨生红球藻株UTEX16表现出不同的生长速率和虾青素产生水平。培养完成后，发现外套区的雨生红球藻株UTEX16以332mg/L的高浓度有效产生虾青素，平均体积扩大为36.27μm，最终细胞密度为5.8×105细胞/ml，新鲜重量为9.94g/L。在内核区，雨生红球藻株UTEX16稳定生长，最终细胞密度为3.2×105细胞/ml，最终新鲜细重量为6.1g/L，而虾青素的产生量维持在31mg/L，表明光合成微生物可在抑制有用代谢物产生的条件下进行连续生长。
实验实施例2当用本发明中不同类型的光照生物反应器培养光合成微生物时，对细胞浓度和虾青素水平进行测定。
在本实验中，使用如图13a和13d所示的双层垂直圆柱式气升光照生物反应器。通过光照生物反应器的底部和上部注入气体。如本发明一个实施方案中的光照生物反应器所示，光照生物反应器是一种具有外部照射的双层垂直圆柱式反应器。与图12a和12b的光照生物反应器的方式相同，本实验中所用的光照生物反应器具有由垂直圆柱式外套和内核组成的内部区域，所述垂直圆柱式外套相当于产生有用代谢物的第二培养区1，所述内核相当于进行营养细胞生长的第一培养区2。光能量由安装在垂直圆柱外部的线性荧光灯8提供。气体供给装置5安装在圆柱底部以向第二培养区1注入气体和通过气体供给密度的差异循环培养基中的生物量。不同于图12a和12b中气体注入单元6安装在底部的光照生物反应器，本实验所用的光照生物反应器通过安装在圆柱上部的垂直不锈管在内核底部产生气体。
气升光照生物反应器由容积500ml的外套及容积500ml的内核组成。
通过气升光照生物反应器底部向第二培养区1，外套，注入混合气体(5％CO2)。同样，第一培养区2，内核，通过安装在圆柱上部并与内核底部连接的垂直不锈钢管注入混合气体。
使用如实施例1中相同的雨生红球藻株和MBBM。
在每个外套和内核以通风速率100ml/min进行补料分批式培养。
线性荧光灯用作外部光源提供光。照射在外套的初始光的表面强度为80μmol/m2/s。从第十天起，光强度增加到770μmol/m2/s以在外套诱导虾青素的积累，同时在内核诱导雨生红球藻进行连续营养生长。
在上述条件下，将雨生红球藻株培养24天。两天后，以两天间隔测定新鲜细胞重量和虾青素水平。结果如图13c和13d所示，其中箭头表示低强度光到高强度光的转折点。
如图13c和13d所示，培养完成后，在外套区，雨生红球藻株UTEX16以356mg/L的高浓度有效产生虾青素。在外套区的最终虾青素水平比内核区约高10倍。这些结果表明双层光照生物反应器可用于培养光合成微生物，所述光照生物反应器包括产生虾青素的外套区和进行营养细胞生长的内核区。
实验实施例3用本发明的光照生物反应器进行连续式培养，其中将不同密度的光合成微生物接种到光照生物反应器的外套和内核。
在该实验中，使用的是如图13a和13d所示的双层垂直圆柱式气升光照生物反应器。通过光照生物反应器的底部和上部注入气体。光源安装在光照生物反应器的外部。气升光照生物反应器由容积500ml的外套和容积500ml的内核组成。
通过气升光照生物反应器的底部向第二培养区1，外套，注入混合气体(5％CO2)。同样，第一培养区2，内核，通过安装在圆柱上部并与内核底部连接的垂直不锈钢管注入混合气体。
使用与实施例l相同的雨生红球藻株和MBBM。用实验实施例1和2内核收获的生物量以2.5×105细胞/ml接种外套，而内核用新传代培养的雨生红球藻UTEX16以1.0×105细胞/ml进行接种。
在每个外套和内核以通风速率100ml/min进行补料分批式培养。
线性荧光灯用作外部光源提供光。以表面强度200μmol/m2/s的初始光照射外套。由于初始光穿过含生物量的外套，因此内核表面的光强度维持在40μmol/m2/s。
在上述条件下，将雨生红球藻株培养16天。1天后，每天测定新鲜细胞重量和虾青素水平。结果如图14a和14b所示。
图14a所示的是光照生物反应器的第一培养区2和第二培养区1中新鲜细胞重量随时间的变化，而图14b所示的是在每个培养区中虾青素水平随时间的变化。培养完成后，在外套区，雨生红球藻株UTEX16以356mg/L的高浓度有效产生虾青素。外套层区的最终虾青素水平比内核区的约高24.5倍。在内核区，雨生红球藻株UTEX16最终细胞密度稳定在3.5×105细胞/ml，最终新鲜重量为3.01g/I，而虾青素产生维持在15mg/L，这表明光合成微生物可在抑制有用代谢物产生的条件下进行连续生长。
在以上培养过程中，外套中的生物量将进行下游过程，分离所产生的有用代谢物，而进行营养细胞生长的内核的生物量则在下一轮培养中用作外套的接种物。因此，内核用新传代的光合成微生物细胞进行接种，而外套用前次培养物的内核中生长的生物量进行接种。因此，本光照生物反应器和方法可以在单个生物反应器中进行传统的两阶段培养过程。
工业适用性如前所述，本发明的多层光照生物反应器和用其培养光合成微生物的方法可在单个生物反应器中进行传统的两阶段培养过程。也就是说，具有两个在光照生物反应器内部形成的分别进行营养细胞生长和产生有用代谢物的培养区的特征结构的多层光照生物反应器可通过分别进行快速培养光合成微生物至高密度和产生有用代谢物而简化两阶段生物过程。因此，用单个光源发出的光可在光照生物反应器中同时进行营养细胞生长及产生有用代谢物。另外，由于不需要许多工作人员进行营养细胞生长及诱导有用代谢物的操作，因此该光照生物反应器具有经济价值并可减少土地成本，安装成本，操作成本和电力成本。
权利要求
1.一种多层光照生物反应器，其包含至少一个其中含微生物和培养基以进行微生物的营养生长的第一培养区；至少一个层邻第一培养区侧表面且其中含有培养基和微生物以产生有用代谢物的第二培养区；和一个位于第一和第二培养区之间以使第一和第二培养区彼此分离的透明分离区，其中所述第一培养区和第二培养区分别安装在光照生物反应器的内部和外部，从而使照射到用于培养的光照生物反应器的阳光或人工光次序穿过第二培养区和透明分离区而到达第一培养区；和多个作为单元模块的光照生物反应器进行空间排列而得到另一个光照生物反应器。
2.一种多层光照生物反应器，其包含至少一个其中含微生物和培养基以使微生物进行营养生长的第一培养区；至少一个层邻第一培养区侧表面且其中含有培养基和微生物以产生有用代谢物的第二培养区；一个位于第一和第二培养区之间以使第一和第二培养区彼此分离的透明分离区；和一个光照射单元以对光照生物反应器中的微生物提供光能量；其中第一培养区不与光照射单元接触，而第二培养区与光照射单元接触，由此使从光照射单元发出的光次序穿过第二培养区和透明分离区而到达第一培养区；及多个作为单元模块的光照生物反应器进行空间排列而得到另一个光照生物反应器。
3.权利要求2中的光照生物反应器，其中所述产生有用代谢物的第二培养区形成于光照生物反应器的最外表面，因此阳光照射到光照生物反应器最外表面的第二培养区。
4.权利要求2或3中的光照生物反应器，其中所述光照射单元是选自由荧光灯，卤素灯，光纤，氖管和发光二极管组成的组的一个或多个。
5.权利要求2或3中的光照生物反应器，其中所述光照射单元包含多个单独操作的独立单元。
6.权利要求1或2中的光照生物反应器，其中所述光照生物反应器具有一种形状，其选自由矩形平板形，圆柱形，管形和其他三维形状组成的组。
7.权利要求1或2中的光照生物反应器，其另外包含气体注入单元以将气体注入第一和第二培养区。
8.权利要求1或2中的光照生物反应器，其中将用于机械搅拌的转子或磁力搅拌器置于第一和第二培养区。
9.权利要求1，2和6中任一项的光照生物反应器，其中所述光照生物反应器以一维，二维或三维连续排列的方式排列。
10.权利要求1或2中的光照生物反应器，其中所述光照生物反应器以分批式培养，连续式培养或补料分批式培养的方式操作。
11.权利要求1或2中的光照生物反应器，其中所述光照生物反应器安装温度控制单元和遮光单元。
12.权利要求11中的光照生物反应器，其中所述温度控制单元是热交换器，温度调节循环器或喷雾器。
13.一种培养光合成微生物的方法，包含向第一培养区接种光合成微生物以进行营养细胞生长，向第二培养区接种光合成微生物以产生有用代谢物，其中所述第一和第二培养区安装在权利要求1或2的光照生物反应器中(步骤1)；对所述第二培养区照射光以增殖光合成微生物(步骤2)；和从所述第一和第二培养区中收获培养的光合成微生物(步骤3)。
14.一种培养光合成微生物的方法，包含将通过分批式培养在进行营养细胞生长的第一培养区中生长的光合成微生物转移到第二培养区以产生有用代谢物，其中所述第一和第二培养区安装在权利要求1或2的光照生物反应器中，和将新传代培养的光合成微生物细胞注入到第一培养区(步骤1)；对所述第二培养区照射光以增殖光合成微生物并积累有用代谢物(步骤2)；和从所述第二培养区收获光合成微生物并通过将所有或部分生长在第一培养区的光合成微生物转移到第二培养区而重复步骤2和3(步骤3)。
15.一种用权利要求1或2的光照生物反应器培养光合成微生物的方法，包含选择性地向光照生物反应器的第一或第二培养区供给已在用光照生物反应器培养时随时间而耗尽的营养物质。
16.权利要求13或14的方法，其中，在步骤2中，最初以能够形成光合成微生物营养生长最佳条件的强度提供光直至光合成微生物达到静止期，然后以能够形成适于产生有用代谢物的胁迫条件的强度提供光。
17.权利要求14的方法，其中，在步骤3中，光合成微生物通过蠕动泵或大气压力传送。
18.权利要求14的方法，其中，在步骤4中，将光控制在能够形成适于产生有用代谢物的胁迫条件的强度。
19.权利要求13的方法，其中光合成微生物选自由红球藻、杜氏藻、绿球藻、小球藻、伞藻、微囊藻、念珠藻和颤藻组成的组。
全文摘要
公开一种能够产生有用代谢物同时伴随光合成微生物营养生长的多层光照生物反应器，其包括含微生物及培养基以使微生物进行营养生长的第一培养区(2)，及层邻第一培养区侧表面并含有培养基和微生物以产生有用代谢物的第二培养区(1)。这两个培养区用一个透明的分离区彼此分离，使对于诱导有用代谢物产生的足够强的光照射第一培养区，当光通过第一培养区到达第二培养区时，光强度衰减到适于微生物生长的水平。而且，本发明公开了一种用该光照生物反应器培养光合成微生物的方法。
文档编号C12M1/14GK1697875SQ200480000700
公开日2005年11月16日 申请日期2004年2月16日 优先权日2003年12月16日
发明者李哲均, 徐印秀, 朱贤娜 申请人:仁菏大学校产学协力团