检测前庭导水管扩大相关基因slc26a4的1336c＞t突变的试剂盒的制作方法

专利名称：检测前庭导水管扩大相关基因slc26a4的1336c＞t突变的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于检测SLC26A4突变基因的试剂盒。
技术背景SLC26A4基因位于7q31，其最初是由Everett等定位，并且发现该基因突 变可以导致一种常染色体隐性遗传性疾病Pendred综合征，临床表现为甲状 腺肿，及合并前庭导水管扩大或Mondini畸形(前庭导水管扩大合并耳蜗发育 不全)的感音神经性耳聋。后来，Usami等对6例单纯前庭导水管扩大家系的 SLC26A4基因的筛查结果表明，该基因的突变还可以导致单纯前庭导水管扩 大，其遗传模式也是隐性遗传.由此可见，SLC26A4基因突变可以导致前庭 导水管扩大——单纯性前庭导水管扩大或者是合并耳蜗畸形的前庭导水管扩 大。前庭导水管扩大是内耳最常见的畸形，其在遗传性耳聋中占到1 8%。临 床上主要表现为高频听力损失为主的感音神经性耳聋，听力损失程度多表现为 重度或者是极重度聋。发病多在儿童时期，其发病前常有感冒、发烧、外伤等 使颅内压增高的诱因。与前庭导水管扩大相关的SLC26A4基因mRNA全长4930bp，含21个外 显子，开放阅读框架2343bp，贯穿外显子2和外显子21。该基因编码的蛋白 ~~Pendrin是一个分子量为86kD，含780个氨基酸的跨膜蛋白，属于离子转 运子家族。Scott和Bidart等的研究发现，Pendrin主要表达于甲状腺滤泡细胞 的顶膜及内淋巴管和内淋巴囊的主细胞，介导碘离子和氯离子的转运，在维持 甲状腺组织和内淋巴的离子平衡上发挥作用。在甲状腺，当Pendrin功能障碍 时，其不能把碘离子及时转运到滤泡胶质，使碘离子在滤泡细胞内积聚，从而 不能有效有机化并与甲状腺球蛋白结合，从而导致Pendred综合征中甲状腺肿 的发生。Qvortrup等认为，大鼠的内淋巴囊类似甲状腺滤泡，有平衡胶状物质填塞囊腔，内淋巴囊主细胞的功能类似于甲状腺滤泡细胞，可以合成、分泌、 吸收、消化蛋白质。氯离子转运障碍使内淋巴液的成分改变，从而损伤感觉上 皮细胞，导致感音神经性耳聋。并且由于渗透压改变和成分改变的毒性机制导 致膜迷路结构改变。由于内淋巴管和内淋巴囊到4岁时才停止发育，因此它们 的扩大可以导致周围骨性结构的改变，例如前庭导水管或耳蜗结构的改变。对于前庭导水管扩大患者SLC26A4基因突变的筛査，国外已经广泛开展， 报道的致病突变位点超过100个，包括错义突变、框移突变、无义突变及剪接 位点突变，分布于各个外显子。SLC26A4基因具有明显的异质性，不同种族 其突变形式不完全相同。该基因突变后其编码的蛋白不能准确定位到细胞膜 上，而是存在于内质网或者是高尔基体内，影响离子转运。前庭导水管扩大患者SLC26A4基因突变的发现，不仅会促进该病的发病 机理等基础研究的发展，还将大大促进前庭导水管扩大的基因诊断和治疗的开 展。通过产前诊断筛査及新生儿SLC26A4基因突变的普遍筛查，可以降低前 庭导水管扩大患儿的出生率，并且实现症前诊断，从而指导携带致病基因的患 儿的行为，预防疾病的发生，这将会大大减少耳聋患者的数量，减轻社会压力。 未来的研究将致力于基因治疗方面，能够预见，基因治疗将会给包括耳聋在内 的各种遗传性疾病的治疗带来质的飞跃。发明内容本发明的目的在于提供用于检测来自待测个体的样本是否存在SLC26A4 基因突变的试剂盒。根据本发明的一方面，本发明提供了一种与前庭导水管扩大疾病相关基因 的检测方法。该检测方法通过检测来自待测个体的样本中是否存在SLC26A4 基因突变，而诊断该待测个体中前庭导水管扩大疾病的发生和类型，其中所述 的SLC26A4基因突变为位于SLC26A4基因外显子4的349delC杂合突变、位 于SLC26A4基因外显子7的916—917insG杂合突变、位于SLC26A4基因外显 子3的230A>T杂合突变、位于SLC26A4基因外显子15的1673A>T杂合突 变、位于SLC26A4基因外显子11的13360T杂合突变、位于SLC26A4基因 外显子14的1594A>C杂合突变、位于SLC26A4基因外显子12的13430A 杂合突变、位于SLC26A4基因外显子11的1318A〉T杂合突变、位于SLC26A4基因外显子8的946G>T杂合突变、位于SLC26A4基因外显子17的1975G>C 杂合突变或位于SLC26A4基因外显子6的626G>A突变。 所述检测方法可包括下述步骤1) 采集待测个体的血液、体液或组织样本，提取DNA;2) 以该DNA为模板，以针对SLC26A4基因所述各突变位点设计的PCR 引物进行PCR反应，得到PCR反应产物；3) 将得到的PCR产物进行直接测序分析，将所得到的序列与SLC26A4 正常基因的序列进行比较，确定是否存在SLC26A4基因的所述突变位点；4) 根据以上结果判断待测个体是否为SLC26A4基因突变导致的前庭导水 管扩大。所述检测方法可进一步包括下述步骤5)按正常阅读框进行翻译以确定是否存在下述氨基酸突变位点X125、 X329、 K77I、 N558I、 Q446X、 S532R、 S448X、 K440X、 G316X、 V659L或 G209E。以下，具体说明关于SLC26A4基因13360T杂合突变的检测方法 通过对70例前庭导水管扩大的家系成员及70名正常听力的对照组成员的 SLC26A4基因进行筛査，发现一名前庭导水管扩大的患儿及其父亲具有 SLC26A4基因新的突变位点(13360T， Q446X)。这一突变导致Pendrin的 翻译提前终止于第446位氨基酸，比正常氨基酸序列少335个氨基酸。70名 正常对照中均未发现该突变，说明这一突变位点与前庭导水管扩大密切相关。

图1给出SLC26A4编码区氨基酸与核酸碱基的对照图，并用红色荧光示出突 变位点所在位置，从446位开始氨基酸的编码终止。在本发明的一个具体实施方式
中，检测待测个体的样本中是否存在 SLC26A4基因13360T杂合突变的方法，包括下述步骤8.1) 采集待测个体的血液、体液或组织样本，提取DNA;8.2) 以该DNA为模板，以下列PCR引物进行PCR反应，得到PCR反应 产物；PDS11國F: 5'-ACACATCCAGTGAGCTGGAA-3' PDS11國R: 5 ， -AGGTGGTAGGTGACTTACAGCA-3'8.3) 将得到的PCR反应产物进行直接测序，并将测序结果与SLC26A4正常基因的序列进行比较，确定是否存在SLC26A4基因的13360T突变位点；8.4) 根据以上结果判断该待测个体是否存在SLC26A4基因1336C〉T突变。进一步的，该方法可以选择性的包括如下步骤8.5) 按正常阅读框进行翻译以确定是否存在Q446X氨基酸突变位点。 在上述针对SLC26A4基因各突变位点的检测方法中，所得到的PCR反应产物还可以用杂交探针来检测，所用的杂交探针可以是与正常的SLC26A4核苷酸 序列杂交，或与突变的核苷酸序列杂交，或与它们的互补序列杂交的探针。这 些探针可以用放射性同位素、发色物质或荧光物质标记，尤其是可利用等位基 因特异探针，以筛查是否存在已被确定的突变。根据本发明的另一方面，本发明提供了用于检测来自待测个体的样本是否 存在SLC26A4基因突变的试剂盒，试剂盒中可以包含以下几种试剂的一种或几 种的组合从待测样品中提取DNA的试剂；用于扩增样本DNA中SLC26A4基因下述突变位点的PCR引物及相应的 PCR反应试剂位于SLC26A4基因外显子4的349delC杂合突变、位于SLC26A4基因外 显子7的916—917insG杂合突变、位于SLC26A4基因外显子3的230A>T杂 合突变、位于SLC26A4基因外显子15的1673A>T杂合突变、位于SLC26A4 基因外显子11的1336C〉T杂合突变、位于SLC26A4基因外显子14的1594A>C 杂合突变、位于SLC26A4基因外显子12的13430A杂合突变、位于SLC26A4 基因外显子11的1318A>T杂合突变、位于SLC26A4基因外显子8的946G>T 杂合突变、位于SLC26A4基因外显子17的1975GX:杂合突变或位于SLC26A4 基因外显子6的626G>A突变；对PCR扩增产物进行限制性内切酶酶切反应的试剂；和/或对PCR扩增产物进行测序的试剂。例如，本发明的一个实施方案中提供一个检测SLC26A4基因所述突变的 试剂盒，容器内装有用以检测SLC26A4基因所述突变的成分，与之同时提供 的可以是经政府药物管理机构审核的、有关药品或生物制品的制造、使用及销 售信息。例如，采用PCR扩增后，直接检测样品中SLC26A4基因所述突变位引物、dNTP、用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓 冲液、酶切反应和/或测序反应所需试剂等的一种或多种。本领域技术人员已 知，以上组分仅是示意性的，例如，所述引物可以采用上述的一对PDS-F和 PDS-R引物，所述的用于PCR反应的DNA聚合酶是能够用于PCR扩增的酶。 所述试剂盒的使用方法主要包括如下步骤(1) 提取待测血样的DNA，利用上述的一对PDS-F和PDS-R引物，进 行PCR扩增反应；(2) 酶切反应进行突变检测；和/或(3) PCR反应产物纯化后直接测序，将所得的序列与Genbank中的标准 序列比较确定突变位点的存在；(4) 按正常阅读框进行翻译以确定是否存在所述氨基酸突变位点。 该试剂盒可简便快捷地检测SLC26A4基因的所述突变位点，从而应用于前庭导水管扩大病例的突变检测及其诊断治疗。根据本发明的再一方面，本发明提供了 SLC26A4突变基因在诊断和/或治 疗前庭导水管扩大中的应用，通过检测来自患者的待测样本中是否存在 SLC26A4基因的所述突变而判断该患者的耳聋发生原因及类型，进而为临床 诊断和治疗提供参考；此外，在进一步的临床治疗方面，在检测结果为发生了 SLC26A4基因的所述突变之后，可以将正常基因导入携带突变基因的细胞并 在其中表达，它可与内源性突变基因发生重组，从而可以进行基因治疗。本发明首次提供了在中国人群中存在SLC26A4基因的所述十一种突变， 并且说明该突变基因与前庭导水管扩大相关。同时，本发明提出了通过检测患 者中是否存在SLC26A4基因突变而判断耳聋发生的原因和类型的检测方法， 这将有利于在临床上开展耳聋患者的SLC26A4突变筛査工作，为耳聋患者提 供诊断和治疗服务。下面结合附图，通过对本发明较佳实施方式的说明，详细描述但不限制本 发明。附图的简要说明图1 5为关于SLC26A4基因13360T杂合突变的附图 图1为SLC26A4编码区氨基酸与核酸碱基的对照突变位于第1336个碱基，对应于第446位的氨基酸变为翻译终止信号(灰色标记部分的是突变的碱基和氨基酸)，其后的氨基酸序列用下划线标记，此段氨基酸序列缺失。图2为Pendrin的结构示意图，星号示出第446位氨基酸所在位置，发生 Q446X突变后，其后氨基酸序列缺失；图3为本发明SLC26A4基因13360T杂合突变检测方法中PCR反应过程示 意图，示出了反应温度和时间；图4为本发明SLC26A4基因13360T杂合突变检测方法中，对PCR产物进 行电泳定量的琼脂糖凝胶电泳图谱，图中示出了定量Marker的片段位置；图5为本发明方法SLC26A4基因外显子11的部分反向测序结果，上方为正 常对照序列，下方为突变序列，箭头所指为突变位点(13360T，Q446X)。发明的具体实施方式
本发明所用试验材料，如无特别说明，均为市售购买产品。 本发明研究过程通过聋病门诊收集前庭导水管扩大患者，在患者及其家属自愿的前提下，签署知情同意书后，留取5-10ml血样，建立门诊病历资料库， 详细记录患者病情、家系中发病情况以及联系方式。然后，应用酚氯仿抽提方 法提取基因组DNA，定量后入库，-20。C保存，每份DNA样品均准确对应于登 记的患者临床资料。然后，根据Coyle等的文献所描述设计引物，包含SLC26A4 基因编码区及其侧翼序列，进行PCR扩增。对PCR产物进行直接测序测序引 物与PCR扩增引物相同，应用ABI公司3730DNA测序仪进行正反向测序。将得 到的序列与Genbank中的标准序列比较，确定SLC26A4突变位点。针对 SLC26A4基因的某些突变位点，对PCR产物还可选择性的进行酶切反应应用 特定的限制性内切酶可将正常人PCR产物切成两个片段，而出现突变后，酶切 位点消失，不能切开。按正常阅读框进行翻译以确定SLC26A4基因的突变位点。SLC26A4基因349delC杂合突变的检测以前庭导水管扩大的病人作为研究对象，通过对70例该病家系成员及85 例正常对照的SLC26A4基因的编码区各外显子的筛查，发现一名前庭导水管扩 大患者在外显子4上具有SLC26A4基因新的突变位点G49delC， X125)。该患 者为一复合杂合子，符合常染色体隐性遗传的模式，其SLC26A4的等位基因存在另一个突变。患者的母亲为349ddC (X125)突变的携带者。这一突变位点 在70名对照组中均没被发现，说明这一突变位点与前庭导水管扩大共分离。实施例1SLC26A4基因349delC杂合突变的检测方法 一、待测对象血样DNA的制备1、 研究对象聋病门诊收集的前庭导水管扩大的患者70例，正常对照 85例。对所有参加者详细调查其病史以及家族史，并对其进行体格检查，耳 科检查包括耳镜检査、听力学评估。在签署知情同意书以后每人采集血样 5-10ml。2、 基因组DNA提取采用酚氯仿抽提法。 第一天1) 抗凝血用PBS作1倍稀释。2) 在离心管中加入2倍体积的淋巴分离液(18°C-28°C)，上面铺一层1 倍体积已稀释的血液，室温1000xg,离心20分钟。3) 吸弃上清，小心吸出中间有核细胞层，转入5mlEp管中，5000xg，离 心10分钟，然后用PBS洗一次。5000xg，离心10分钟。4) 将细胞悬于2mlTE缓冲液中，加10%的SDS至终浓度0.5% (100^1)， 蛋白激酶kl00-200吗/ml (10mg/ml)， 50。C水浴3-5小时。5) 用酚氯仿提取。用等体积的饱和酚，加入混匀，5000xg,离心IO分钟。6) 吸上清液至新离心管中，弃下层沉淀，加入等体积酚氯仿混合物， 混匀，5000xg,离心10分钟。7) 吸上清液至新离心管中，弃下层沉淀，加入等体积氯仿异戊醇混合 物，混匀，5000xg,离心10分钟。8) 吸上清液至新离心管中，弃下层沉淀，加入1/10体积的乙酸钠，混匀。9) 加入2.5倍体积的无水乙醇。10) -20°C沉淀DNA过夜。第二天11) 高速离心，10000xg， IO分钟，4°C。12) 弃上清，加入75。/。乙醇2ml，高速离心10000xg， 5分钟。13) 弃上清，吹干。14) 用TE缓冲液溶解(200^1 TE/5ml全血，400^1 TE/10ml全血)。15) 分装。1%琼脂糖电泳和分光光度计定量。 二、 SLC26A4基因外显子4的PCR扩增1、引物序列 上游引物PDS4-F: 5'-TAATCACTTTGCATGTGCTTT-3， (ntll480-nt11500)下游引物-PDS4-R: 5，-GCCAAAACACTTTAAACATGA-3' (ntl 1648-11 nt668 ) 注SLC26A4基因序列检索号GenelD:5172 2、 PCR反应体系的建立 SLC26A4基因的PCR反应体系的组成见表1。表1 SLC26A4基因的PCR反应体系<table>table see original document page 10</column></row><table>其中缓冲液、dNTP、 Taq酶从宝生物公司购得。引物由上海生工公司合 成。反应条件PCR反应在ABI公司9700热循环仪上进行。 三、PCR产物的纯化1、 向装有PCR产物的96孔板中加入50(il无菌水，混匀。2、 将其转移到Mimpore纯化板中，放到真空泵上抽滤约3分钟，看到纯化 板中没有水即可。3、 纯化板中再次加入50W的去离子水，继续抽滤，直到纯化板中没有水为 止。4、 将纯化板从真空泵上取下，向板中加入20W的去离子水，静止15分钟， 再震荡15分钟，然后吸到一新96孔板内。5、 保存在-2(TC冰箱中。四、 电泳定量1、 样品准备PCR产物(2^1) +上样缓冲液(6^1)共8ixlx96取一96孔点样板，每孔先加上样缓冲液6pl，在从装有PCR产物的腔板 中，每孔用排枪移出PCR产物(2^1)，转移到点样板上、混匀、离心(腔板 孔号要与96孔点样板一一对应)。2、 流程1) 配胶(1.0°/。琼脂糖)称取3.0g琼脂糖，悬浮于300ml 0.5xTBE中 (500ml锥形瓶)。2) 溶胶微波炉中高火加热至沸，持续沸腾数分钟，注意不要沸出， 其间取出混匀。3) 凉胶待胶完全溶解，从微波炉中取出，凉至6(TC左右，加入l滴 EB (约10^d,10mg/ml)，摇匀。4) 铺胶平板两端用胶布封严，把250ml胶液全部倒入平板，插入梳尺。5) 上胶将平板放入已盛有电泳液(0.5xTBE，液面距胶面l至2mm) 的电泳槽中，拔下梳尺。6) 加样用排枪按规定格式加样，最后用单枪加入DNA标准品。7) 走胶盖上电泳槽盖，检査正负级，开启电泳仪，调节电泳电压。8) 定量当溴酚蓝走离加样孔1.5至2cm处，关闭电泳仪，小心取胶， 放入摄相仪照相，进行定量。定量marker为DL 2000，经过电泳后，有6条 带可见，片段长度分别是2000bp, 1000bp， 750bp， 500bp， 250bp, 100bp， DL2000 的总浓度是300ng/5pl。电泳时取5ul DL2000，因此每条带的含量为50ng。 PCR 产物电泳时取3pl (PCR产物)+5^1 (上样缓冲液)进行电泳。根据PCR产物 电泳后的灰度值与DL2000的灰度值的比较判断PCR产物的含量。五、 SLC26A4基因PCR扩增产物的直接测序 1、 PCR产物DNA模板的纯度与用量要求DNA纯度OD260 / OD280 = 1.6 2.0。 DNA浓度PCR产物10ng/pL。DNA用量PCR产物100-200 bp 1-3 ng200-500 bp 3-10 ng500-1000 bp 5-20 ng1000-2000 bp 10-40ng> 2000 bp 40-100 ng2、测序反应(1) 测序反应所需试剂应为新鲜配制，需要经高压灭菌的试剂必须灭菌后 方可使用。测序反应所需的器材(如384孔板、tip头等)同样应为洁净无菌 的。(2) 为了保证测序样本及反应试剂的新鲜，加样时应在冰上操作。(3) 目前的反应体系为5pl，各种试剂加入量见表2。表2 SLC26A4基因PCR扩增产物的测序反应体系<table>table see original document page 12</column></row><table>*BigDye 3.1为美国应用生物系统公司(ABI)生产的一种用于测序反应的 荧光染料。(4)样品放于PCR仪上，所做反应的过程见表3。表3 SLC26A4基因PCR扩增产物的测序反应过程<table>table see original document page 12</column></row><table>(5)反应完的样品要及时从PCR仪上取下，短时间内要进行纯化的样 放置于4'C冰箱中，超过一天以上才能纯化的样品放置于-2(TC冰箱冷冻。3、测序反应物的纯化和测序(1) 向每孔中加入20^180%乙醇，4000 rpm离心30min;将样品板放在折好 的纸巾上，在离心机中倒甩，倒甩时速率不能超过1000rpm;(2) 在每孔中加入30^170%乙醇，4,000 rpm离心10min，倒甩；(3) 重复第2步的操作；(4) 重复第2步的操作；(5) 将样品板放于干净的抽屉中，避光干燥30min;(6) 加入5pl甲酰胺，封膜，离心后置于-20'C冰箱中；(7) 上机器前95。C变性5分钟，放置冰上2分钟，离心后上样。 六、突变位点酶切反应检测酶切反应体系的组成见表4，反应条件为37'C水浴4小时。应用2%琼脂 糖凝胶电泳检测，方法参见实施例1中电泳定量。酶切分析是在该突变位点找到了一个限制性内切酶Eco311酶切位点，没 有发生突变时，限制性内切酶Eco31I可以在352和353位碱基切开，而使得 PCR产物片段由原来的189bp被切成72bp和117bp两个片段，而突变以后此 酶切位点消失，不能切开。由于此患者为杂合突变，故电泳胶图上显示为3 条带。表4酶切反应体系试剂样品量Eco3111^110XL Buffer2^1PCR产物6(ilddH20Up to 20(ilEco31I限制性内切酶与10XL Buffer购于宝生物公司，PCR产物为实施 例1中的PCR扩增产物。实施例2突变位点进化研究突变分析应用DNAStar5.0 (Lasergene inc.)软件包中的SeqmanTM软 件进行序列对比分析。将测序得到的序列与NCBI检索到的标准序列进行比 对，找出突变序列，发现了突变位点(349delC， X125)。进化研究349delC突变位于Pendrin的第二跨膜区，其使氨基酸序列从 117位始发生框移，后提前终止于125位氨基酸。该突变必定影响Pendrin的结构和功能。SLC26A4基因1336QT杂合突变的检测以前庭导水管扩大的病人作为研究对象，通过对70例该病家系成员及70 例正常对照的SLC26A4基因的编码区各外显子的筛査，发现一名前庭导水管扩 大患者在外显子11上具有SLC26A4基因新的突变位点(13360T, Q446X)。 该患者为一复合杂合子，符合常染色体隐性遗传的模式，其SLC26A4的等位基 因存在另一个突变。患者的父亲为13360T (Q446X)突变的携带者。该突变 位点在70名对照组中均没被发现，说明该突变位点与前庭导水管扩大共分离。实施例3SLC26A4基因13360T杂合突变的检测基本方法和步骤参见实施例1。针对SLC26A4基因外显子11的PCR扩增 引物序列上游引物PDS11誦F: 5，國ACACATCCAGTGAGCTGGAA-3， (nt33698-nt33717)下游引物PDS11-R: 5'-AGGTGGTAGGTGACTTACAGCA-3， (nt34079-nt34100)PCR反应过程如图3所示；对PCR产物进行电泳定量的琼脂糖凝胶电泳 图谱见图4;测序图见图5。实施例4突变位点进化研究突变分析应用DNAStar5.0 (Lasergene inc.)软件包中的SeqmanTM软 件进行序列对比分析。将测序得到的序列与NCBI检索到的标准序列进行比 对，找出突变序列，发现了突变位点(1336C〉T， Q446X)。进化研究13360T突变引起使SLC26A4基因编码的氨基酸序列提前终 止于446位氨基酸，形成不成熟的Pendrin，这个改变必然引起Pendrin的结构 和功能异常。检测前庭导水管扩大相关的MC72"4基因突变的试剂盒及其应用实施例5检测SiX7d44基因突变的试剂盒可以根据需要制备成检测各单一突变位点 的单独的试剂盒，也可以制备成检测多个或所有5XC2^^基因突变位点的试 剂盒，下面以检测本发明的突变位点的试剂盒为例进行说明-1、试剂盒含有14(1) 扩增用引物前述为检测5ZC2M4基因的1336C〉T突变位点设计的1对引物，或者其 他可使用的针对突变基因设计的引物；注5XC2M4基因序列检索号GenelD:5172其它可选地包含在试剂盒中的试剂包括下述试剂(2) PCR扩增用Taq酶5U/pl(3) 10x缓冲液(含15mlMgCl2)(4) dNTP 2.5mM(5) Eco31 I限制性内切酶；BseM I限制性内切酶；Hind III限制性内切 酶；Ndel限制性内切酶；或EcoRl限制性内切酶(6) 10 XL Buffer(7) ■ Big-Dye mix2、使用方法主要包括如下步骤1) PCR扩增采集待测个体的样本(血液、体液、组织等)，提取DNA，用上述针对各 突变基因的引物分别进行PCR扩增；2) PCR产物纯化将含有PCR产物的MuWScreen-PCR板抽真空，加入去离子水，静置，随 后将MultiScreen-PCR板置于混合器上震荡，纯化后的PCR产物重新溶解后转 移至另一洁净的96孔板中；3) 测序反应及验证将上述扩增的针对各突变位点的PCR产物以PCR引物作为测序引物进行 测序反应，在ABI9700热循环仪上进行测序反应。反应结束后，延伸产物上 样于ABI PRISM 3730DNA序列分析仪。将所得到的测序图谱进行分析，与 Genbank中的标准序列比较可以发现突变位点；4) 按正常阅读框进行翻译以确定是否存在相应的氨基酸突变位点。 具体方法参见前面实施例中的详细描述。以上对本发明的详细描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发 明作出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利 要求所定义的范围。
权利要求
1、一种检测与前庭导水管扩大疾病相关的位于SLC26A4基因外显子11的1336C＞T杂合突变的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测位于SLC26A4基因外显子11的1336C＞T杂合突变的试剂和用于扩增SLC26A4基因的试剂。
2、 如权利要求1所述试剂盒，所述试剂盒包括下述试剂的组合 从待测样品中提取DNA的试剂；用于扩增样本DNA中SLC26A4基因外显子11的13360T杂合突变的 PCR引物及相应的PCR反应试剂； 对PCR扩增产物进行测序的试剂。
3、 如权利要求2所述的试剂盒，其中所述的PCR引物为<formula>formula see original document page 2</formula>
4、 如权利要求1所述试剂盒，所述试剂盒用于检测位于SLC26A4基因外 显子11的13360T杂合突变的步骤包括1) 采集待测个体的血液、体液或组织样本，提取DNA;2) 以该DNA为模板，以下列PCR引物进行PCR反应，得到PCR反 应产物；PDS11國F: 5，-ACACATCCAGTGAGCTGGAA-3' PDS11 -R: 5 ，-AGGTGGTAGGTGACTTACAGCA-3'3) 将得到的PCR反应产物进行直接测序，并将测序结果与SLC26A4 正常基因的序列进行比较，确定SLC26A4基因的13360T突变位点。
5、 如权利要求4所述试剂盒，所述步骤还进一步包括4) 按照正常阅读框架进行翻译以确定Q446X氨基酸突变位点。
全文摘要
本发明涉及一种检测方法，通过检测来自待测个体的样本中是否存在SLC26A4基因突变，而诊断该待测个体中前庭导水管扩大疾病的发生和类型，其中所述的SLC26A4基因突变为位于SLC26A4基因外显子11的1336C＞T杂合突变。本发明还涉及一种用于检测来自待测个体的样本是否存在SLC26A4基因突变的检测试剂盒，以及SLC26A4基因突变在诊断和/或治疗与前庭导水管扩大相关疾病中的应用。该基因突变和检测方法将有利于临床上开展耳聋患者的SLC26A4基因突变筛查工作，为耳聋患者的诊断和治疗提供服务。
文档编号C12N15/11GK101255466SQ20071030165
公开日2008年9月3日 申请日期2005年8月8日 优先权日2005年8月8日
发明者岩 沈, 王秋菊, 翟所强, 赵亚丽 申请人:中国人民解放军总医院;北京诺赛基因组研究中心有限公司