一种对奇异变形杆菌的its特异的核苷酸及其应用的制作方法

专利名称：：一种对奇异变形杆菌的its特异的核苷酸及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种对奇异变形杆菌(尸ra^^^raWfo))中16SrRNA-23SrRNA基因的间区(Internaltranscribedspacer,以下简称ITS)特异的的核苷酸，特别是涉及对奇异变形杆菌中的ITS特异的寡核苷酸及其应用。
背景技术：
：奇异变形杆菌是一种条件致病菌，存在于人体肠道(携带率高达25%)和医院环境中，可引起人的原发性和继发性感染，如创伤感染、呼吸道感染、腹泻、尿路感染、腹膜炎、中耳炎、乳突炎、心内膜炎、脑膜炎入败血症，还可引起食物中毒。奇异变形杆菌是泌尿道感染(UrinaiyTractInfection,UTI)的主要致病菌，在复杂泌尿道感染(complicatedUTI)中仅次于大肠杆菌和肺炎克雷伯菌(引起12%的感染)，在长期留置尿管病人的菌尿中仅次于斯氏普罗威登菌(引起15%的感染)(R6zalskiA,SidorczykZ，1997)，亦是婴儿肠炎的病原菌之一。目前，对奇异变形杆菌主要采用常规生物化学检测方法为主，该检测方法容易出现过多的假阳性、假阴性现象，通常需要将待测菌株经较长时间的培养才能进行检测，检测操作过程复杂，检测周期长，通常需要两到三天才能检测完一次待测样品，而且需要较高的技术和设备条件，检测成本高。因而需要发展灵敏度高、快速、简便的检测方法。近年来，越来越多的分子技术用于病原菌的鉴定、检测及病害诊断中，包括转录间隔区(ITS)序列分析、随机扩增长度多态性(RAPD)分析、核糖体DNA限制性片段长度多态性(RFLP)分析等。和传统检测技术相比，这些基于多聚酶链式反应(PCR)的分子检测技术，不需要经过病原5菌的分离、纯培养等过程，而且具有快速、灵敏、特异性强等优点。核糖体内转录间隔区(ITS),是介于16SrRNA和23SrRNA之间的区域，在几乎所有细菌的基因组中都以单拷贝或多拷贝的形式存在，相对较短(200bp—1000bp)。该区域进化速率较快，具有超变位点，它的变异速率相当于16SrRNA或者23SrRNA的十倍左右，在种内不同菌株间高度保守，而在细菌的种间存在着丰富的变化。因此具有很高的分辨率，更易区分开进化关系很近的菌种，大大增强了检测的特异性。可以为研究细菌的系统发育、分类鉴定和分子检测提供丰富的遗传信息。聚合酶链式反应技术(Polymerasechainreaction，简称PCR技术)作为微生物检测的技术目前正在得到认同和推广，该技术相对于传统的方法有高通量、检测速度快、特异性强、灵敏度高等优点，只需对样品进行简单的预增菌或增菌过程，再通过离心及裂解制备细菌DNA模板，就可以在高特异性引物介导下的PCR过程中扩增目标序列，达到检测样品中是否含有待测的致病性微生物的目的。PCR的扩增过程仅需2个小时。这对检验检疫部门和临床检验无疑极大提高了工作速度和降低了工作成本。
发明内容本发明的一个目的是提供了一种对奇异变形杆菌的ITS特异的核苷酸；本发明的另一个目的是提供该特异核苷酸的应用，将其设计引物，通过优化和设计，提供一种用于检测奇异变形杆菌的PCR试剂盒，并利用该PCR试剂盒检测奇异变形杆菌的存在。本发明的目的通过以下技术方案实现一种对奇异变形杆菌的ITS特异的核苷酸，所述核苷酸包含a)SEQIDN0:1或SEQIDN0:2所示的核苷酸序列或者其互补DNA或RNA序列；b)不同于a)但编码的氨基酸序列与a)所编码的RNA序列相同的核苷酸序列；c)上述a)或b)中缺失、替换或插入一个或多个碱基、仍具有所述核苷酸功能的核苷酸序列。所述的SEQIDNO:l和SEQIDNO:2所示的分离的核苷酸，全长分别为398和524个碱基；上述的一种对奇异变形杆菌的ITS高度特异的核苷酸为源于ITS的寡核苷酸，具有SEQIDNO:5的序列，是位于SEQIDNO:l中的186至205的碱基和位于SEQIDNO:2中的186至205的碱基。上述的对奇异变形杆菌的ITS特异的核苷酸的分离方法包括下述步骤(1)基因组的提取；(2)通过PCR扩增奇异变形杆菌中的ITS基因簇；(3)构建ITS克隆；(4)对ITS克隆测序；(5)核苷酸序列的拼接及分析；(6)特异引物的筛选。上述的核苷酸的应用，可将所述核苷酸作为引物用于PCR试剂盒、作为探针用于杂交反应与荧光检测，或者用于制造基因芯片或微阵列以检上述的PCR试剂盒，包括PCR引物、dNTP、缓冲液和DNA聚合酶，其中PCR引物包括d)SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的核苷酸序列；e)不同于d)但编码的氨基酸序列与d)所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；f)上述e)或e)中缺失、替换或插入一个或多个碱基、仍具有所述核苷酸功能的核苷酸序列。其中的SEQIDNO:3(5，-TGTACACACCGCCCGTC-3，)是上游引物，SEQIDNO:4(5，-GACTCTCGTCAGATAAGTGG-3，)是下游引物。上述上游引物SEQIDNO:3是根据细菌的16SrRNA基因保守区设计合成的，下游引物SEQIDNO:4是根据奇异变形杆菌的含有tRAN-glu的ITS类型设计合成的寡核苷酸引物，它位于ITS序列上的186-205碱基位置。该引物可在试管中由DNA聚合酶选择性的复制合成介于两引物之间的DNA区段(针对奇异变形杆菌为357bp靶DNA片段)，因而可以将极其微量的(lpgDNA)目的基因在较短的时间内(1.5小时)扩增到电泳检测显而易见的水平。上述PCR检测试剂盒包括如下试剂25mMMgCl250ul;10mMdNTP30ul;10X酶特异性反应缓冲液50ul;5U/y1耐热DNA聚合酶5Pi;引物各10tU;阳性对照品10U1，阴性对照品IOUI;ddH20lml。本发明还涉及上述的PCR试剂盒在检测奇异变形杆菌中的应用。上述针对奇异变形杆菌的PCR检测试剂盒，整个检测步骤包括样品预处理——扩增~~^电泳检测结果。引物和PCR反应体系所需要的试剂己预先加入扩增管中，使用者只需将预处理后的样本加入扩增管启动扩增反应即可，简单快速的完成检测工作。使用上述的PCR试剂盒检测奇异变形杆菌的PCR检测方法包括以下步骤(1)提取待测临床样品模板；(2)在PCR薄壁管中加入dNTP、MgCl2、IOX酶特异性反应缓冲液、Taq聚合酶、弓1物、待测样品模板和ddH20，混匀；(3)将薄壁PCR中混匀的混合物在PCR仪上扩增；(4)在电泳设备中电泳扩增产物，记录结果；(5)分析并进行结果判断。上述步骤(1)中的临床样品模板为是临床样品中的血培养物、痰培养物、尿培养物或脑脊液培养物的粗提液，或是奇异变形杆菌的纯培养物的粗体液，或是纯DNA，或者是阳性对照品和阴性对照品。上述步骤(1)中的临床样品模板的提取方法为(1)取培养物1.5ml，在8000rpm条件下离心5分钟，去掉上清液;(2)取500ul的ddH2O重悬沉淀，在8000rpm条件下离心5分钟，去掉上清液，控干；(3)取100wlddH2O重悬沉淀，在IO(TC沸水中水浴IO分钟；(4)再置于冰上10分钟后，在12000rpm条件下离心2分钟；(5)取3"1中层上清做为PCR反应的模板。上述步骤(3)中的PCR仪上的反应循环参数包括DNA的变性、复性、延伸的温度和时间、循环次数，具体为前期为使变性能够达到所需温度而必需的前期处理过程的一个循环为95。C，5分钟；变性温度和时间为94。C，30秒；复性温度和时间为50。C，30秒；延伸温度和时间为72t:，30秒；变性、复性、延伸的循环次数为30个循环；为稳定扩增产物而进行一个循环的温度和时间为72°C，5分钟。上述步骤(4)在电泳设备中电泳扩增产物，记录结果的具体步骤为-(1)取510tU扩增产物与6X溴酚蓝上样缓冲液以5:1的体积比混合；(2)将混合液上样于1%的琼脂糖凝胶上；(3)将琼脂糖凝胶电泳120v稳压电泳约10分钟，用DL2000Marker进行对照；(4)观察并记录结果。本发明通过配制一种可检测奇异变形杆菌的可产业化生产的PCR试剂盒，将PCR检测方法需要使用的组分组合在一起，使用时，提取待测样品，同时经过较为简单的操作程序就可以进行快速、灵敏、简便的检测、试剂盒中各组分的用量和浓度均为试验所得，用该试剂盒检测奇异变形杆菌所使用的试验设备简单，检测成本低。使用阳性和阴性对照品的目的是用于质控整个操作过程，以便得出准确的判断。若含有奇异变形杆菌，则从电泳结果中可以观察到与阳性对照品相同位置的条带；若不含有奇异变形杆菌，则与阴性对照品一样不具有这一条带。本发明一次检测试验所使用的实际盒中的试剂量为引物各1^1，10mMdNTP0.25u1，10X酶特异性反应缓冲液2.5P1，5U/pl耐热DNA聚合酶0.2u1，25mMMgCl22.5ul,余下的体积在除去3u1待测样品的量后用ddH20补足至25ul。本发明中的耐热DNA聚合酶为Taq聚合酶。上述的阳性对照品为已确定是奇异变形杆菌的样品，阴性对照品则为经实验室确定不是奇异变形杆菌的样品，如大肠杆菌。本PCR试剂盒若用奇异变形杆菌的菌悬液进行PCR扩增，与经提取得到的DNA作为模板扩增所得结果一致。敏感度和特异性无差别，这样，可省去模板DNA的提取步骤，使操作方法得以简化。同时，相比常规生化检测方法而言，本方法所采用的待测样品可以直接是临床样品培养液，或者对检测样品进行简单分离培养就可进行检测，因而节省了人力物力。采用本发明所提供的PCR检测方法进行扩增的奇异变形杆菌应在357bp处有一条带。根据引物设计的结果，扩增出的奇异变形杆菌片段长度应为357bp，因此若扩增结果在357bp左右具有和阳性对照相同位置的条带，则可判断此待测样品带有病菌，详见图l,其中，A为待测样品，检测到病菌目的带；+阳性对照；一阴性对照；M为DNAmarker。与现有技术相比，本发明具有如下优点(1)实用性强本发明所配制的PCR试剂盒配制方法简便，检测周期短、速度快，可操作性强，易于产业化生产，而检测成本却相对较低，市场应用前景广。(2)准确性高本发明通过对奇异变形杆菌及变形杆菌属内其他3个种的ITS克隆、10测序，将得到序列与GeneBank中的ITS比较，找到奇异变形杆菌ITS的特异区，设计出引物。继而利用引物组合成复合PCR检测体系，能够直接将奇异变形杆菌和其近源菌种分开。本发明者对31株奇异变形杆菌的标准菌株、53株变形杆菌属其他菌株以及13株近缘标准株进行了扩增，结果发现，本发明的检测方法的准确率高达100%。(3)灵敏度高本发明提供的奇异变形杆菌检测试剂盒及其检测方法具有相当高的敏感性，检测精度高，可以检测到lpg/ul的DNA模板。为让本发明之上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。图1为本发明试剂盒检测结果图，A为待测样品，检测到病原菌；P为阳性对照品；N为阴性对照品；M为DL2000DNAmarker;图2为本发明临床菌株部分电泳结果图，1，奇异变形杆菌C1875;2，奇异变形杆菌C2297;3，奇异变形杆菌C2299;4，奇异变形杆菌C2381;5，奇异变形杆菌C3725;M，DL2000DNAmarker;图3为本发明临床菌株部分电泳结果图，1，普通变形杆菌C4305;2，潘氏变形杆菌C2179;3，奇异变形杆菌C3725;4，奇异变形杆菌C3759;5，奇异变形杆菌C5735;M，DL2000DNAmarker;图4为本发明试剂盒检测标准菌株部分电泳结果图，1，奇异变形杆菌G2292;2，奇异变形杆菌G2293;3，奇异变形杆菌G2294;4，奇异变形杆菌G2295;5，奇异变形杆菌G2296;6，奇异变形杆菌G2298;7，普通变形杆菌G1811;M，DL2000DNAmarker;图5为本发明试剂盒检测标准菌株部分电泳结果1，奇异变形杆菌G2299;2，奇异变形杆菌G2372;3，奇异变形杆菌G2609;4，奇异变形杆菌G2645;M，DL2000DNAmarker;图6为本发明试剂盒检测标准菌株部分电泳结果图，1，潘氏变形杆菌G2620;2，产粘变形杆菌G2676;3,奇异变形杆菌G2621;4，奇异变形杆菌G2627;5，奇异变形杆菌G2631;M，DL2000DNAmarker;图7为本发明试剂盒检测标准菌株部分电泳结果图，1，奇异变形杆菌；2，痢疾志贺氏菌；3，弗氏柠檬酸杆菌；4，沙门氏菌；5，大肠杆菌；6，金黄色葡萄球菌；7，霍乱弧菌；M，DL2000DNAmarker。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件。实施例1:基因组的提取在5mL的LB培养基中37'C过夜培养奇异变形杆菌，离心收集细胞。用500ul50mMTris-HCl(pH8.0)和10ul0.4MEDTA重悬细胞，37。C温育20分钟，然后加入10ul10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul20mg/ml的蛋白酶K、15ul10%SDS,5(TC温育2小时，再加入3ullOmg/ml的RNase，65。C温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清液，再用等体积的酚氯仿异戊醇(25:24:1)溶液抽提两次，取上清液，再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚。上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝巻出DNA并用70%乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ulTE中。基因组DNA通过0.4M的琼脂糖凝胶电泳检测。12实施例2:通过PCR扩增奇异变形杆菌中的ITS以奇异变形杆菌的基因组为模板通过PCR扩增其ITS。首先根据ITS一端的16SrRNA基因的保守区设计上游引物(5，-TGTACACACCGCCCGTC-3，)，再根据23SrRNA基因的保守区设计下游引物(5'-GGTACTTAGATGTTTCAGTTC-3，)。PCR反应程序如下在94。C预变性5分钟；然后94。C变性30秒，5(TC退火30秒，72。C延伸1分钟，这样进行30个循环；最后，在72'C继续延伸5分钟，得到PCR产物，用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并3管longPCR产物，并用上海生工生物工程技术公司的UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收纯化PCR产物中最短的条带；实施例3:构建ITS克隆首先是连接产物的获得.-将PCR纯化产物与Promega公司的3Xl(T3的pGEM-T-Easy载体于16。C连接24小时，总体积为10"1，其中有1U1的10Xbuffer和0.5单位的T4DNA连接酶，得到连接产物。其次是感受态细胞的制备参照Bio-Rad公司提供的方法制备感受态细胞大肠杆菌DH5a。取一环大肠杆菌DH5a单菌落于5ml的LB培养基中，180rpm培养10小时后，取2ml培养物转接到200ml的LB培养基中，37°C250rpm剧烈振荡培养到OD6000.5左右，然后冰浴冷却20分钟，于4X:4000rpm离心15分钟。倾尽上清液，用冷的冰预冷的去离子灭菌水200ml吹散菌体，于4。C4000rpm离心15分钟。再用冷的冰预冷的去离子灭菌水100ml吹散菌体，于4°C4000rpm离心15分钟。用冷的冰预冷的10%的甘油悬浮细胞，4°C6000rpm离心10分钟，弃上清液，最后沉淀用lml冰预冷的10%的甘油悬浮细胞，即为感受态细胞。将制得的感受态细胞分装为60ul—管，-7(TC保存。最后是电转化感受态细胞取2-3ul连接产物与60ul感受态大肠杆菌DH5a混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒。电击后立即在杯中加入lml的SOC培养基使菌复苏。然后立即将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37。C倒置过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用I酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群即为奇异变形杆菌的ITS克隆。实施例4:对ITS克隆测序挑选插入片段最小和次小的各8个克隆由用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段双向进行测序，从而获得含tRNA-Glu基因的ITS的序列。实施例5:特异引物的筛选针对奇异变形杆菌的ITS的特异区设计引物；在特异区设计一条下游引物与16SrRNA基因保守区内的上游引物结合，用这对引物(上游引物是5，-TGTACACACCGCCCGTC-3'，见序列SEQIDNO:3;下游引物是5，-GACTCTCGTCAGATAAGTGG,见序列SEQIDNO:4)以25株的普通变形杆菌、26株潘氏变形杆菌、2株产粘变形杆菌和40株奇异变形杆菌的基因组为模板进行PCR，体系为lOuM引物lul、25mMMgC122.5ul、10Xbuffer2.5ul、10mMdNTP0.25ul、5U/ulTaq聚合酶0.25ul及3ul的待测样品模板到0.2ml的薄壁PCR管中，最后用ddH20补足至25nl。所有引物都在奇异变形杆菌中得到阳性结果，在其他组中都没有扩增出大小正确的带，也就是说，在其他组中没有得到任何PCR产物带，所以该寡核苷酸对奇异变形杆菌及其ITS都是高度特异的。实施例6:PCR检测试剂盒检测实验所需材料及设备的准备l.试剂盒组成.-1)MgCl2(25mM)50ul;142)dNTP(10mM)30ul;3)10Xbuffer(10X酶特异性反应缓冲液)50ul;4)Taq聚合酶(5U/ul)5ul;5)引物混合物(10uM)10ul;6)阳性对照品(KP)10ul;7)阴性对照品(KN)10ul;8)ddH205ml。每个试剂盒可用于检测IO个样品。其中MgC12、10Xbuffer、dNTP、Taq聚合酶由上海生工提供；引物混合物为自行设计的序列提供给上海英骏生物技术公司合成；阳性对照品、阴性对照品和ddH20由我们自行制备。检测所使用的引物的上游引物是5，-TGTACACACCGCCCGTC-3，(SEQIDNO:3)，下游引物是5，-GACTCTCGTCAGATAAGTGG(SEQIDNO:4)，比例为1:1。2.仪器设备PCR仪(又名DNA热循环扩增仪)、电泳设备(包括电泳仪及电泳槽)、凝胶成像仪、-2(TC冰箱、高速离心机、微量移液器和0.2mlPCR薄壁管。3.待测样品的提供我们收集了31株奇异变形杆菌的标准菌株、53株变形杆菌属其他菌株以及12株近缘标准株验证引物的特异性，菌株编号和来源见下表1。表l:供试的标准菌株细菌名称菌株菌株名原始编号来源株数称奇异变形杆菌31G22923-CCUG4637瑞典歌德堡大学培养物保藏中心尸.则'raAiiisG22934-G1波兰罗兹大学微生物和免疫研究所G22945-Prk20/57捷克卫生学研究所模式菌种保藏所G22956-CCUG19016瑞典歌德堡大学培养物保藏中心G22967-Prk42/57捷克卫生学研究所模式菌种保藏中心15<image>imageseeoriginaldocumentpage16</image><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>金黄色葡萄球菌中国科学院微生物研究所5Ys/AkA)c。c，1G1757AS1.14762德国RobertKoch研究所C"r。Ag"erG1318CB18同时申请人搜集了10株2005年以来的天津6家医院从病人身上分离得到的病原菌，所有的临床菌株都经医院的细菌鉴定系统一一VITEK系统进行了生化鉴定，其生化鉴定结果见表2:表2:供试临床菌株的生化检验结果菌株名称生化鉴定类型实验室编号生化鉴定类型C1875尸./ziraZ^7/5"C3731尸./ff/ra力i7isC2297尸.迈/ra力i/ysC3759戶.历/ra力j7i51C2299尸./BJ'ra6ih'sC5735戶.肌'ra6i7isC2381尸./w>aZ7/2isC2179尸.pe朋erj'C3725尸.肌>血7&C4305尸.ra/gar/s二、检测实施的具体操作将上述94株标准菌株和经普通生化鉴定的10株变形杆菌属临床菌株进行了同样条件下采用本发明所提供的PCR检测试剂盒进行PCR方法的检测。l.待测样品模板的提取A.针对标准菌株1)1%接菌量无菌操作，接种于3mlLB培养基中，200rpm，37'C过夜培养；2)收集1.0ml过夜培养物，8000rpm离心5分钟，去上清。3)500ulddH2O重悬沉淀，8000rpm离心5分钟，去上清，尽量控干。4)100ulddH2O重悬沉淀，混匀，IO(TC沸水浴IO分钟，5)置冰上10分钟后，12000rpm离心2分钟。6)取3ul中层上清做为PCR反应的模板。B.针对临床培养物(血培养物、痰培养物、尿培养物等)181)收集阳性培养物l.Oml，8000rpm离心5分钟，去上清。2)500ulddH2O重悬沉淀，8000rpm离心5分钟，去上清，尽量控干。3)100ulddH2O重悬沉淀，混匀，IO(TC沸水浴IO分钟，4)置冰上10分钟后，12000rpm离心2分钟。5)取3ul中层上清做为PCR反应的模板。2.用微量移液器分别吸取PCR试剂盒中10uM引物lul，25mM的MgCl22.5ul，10Xbuffer2.5ul、10mM的dNTP0.25ul，5U/ulTaq聚合酶0.25ul及3ul的待测样品模板到0.2ml的薄壁PCR管中，最后用ddH20补足至25ul，充分混匀；3.将混合物高速离心数秒后在PCR仪上依下列温度和时间进行扩增95°C5分钟1个循环；94°C30秒，50°C30秒，72°C30秒，30个循环；72°C5分钟l个循环。4.在电泳设备中电泳PCR扩增产物，记录结果。1)取3ul扩增产物与6X溴酚蓝上样缓冲液混合；2)将混合液上样于1.5%的琼脂糖凝胶上；3)将琼脂糖凝胶经120v电压稳压电泳约10分钟，用DL2000Marker进行对照；4)观察前沿溴酚蓝指示剂迁移至距加样孔至少3cm停止电泳，在凝胶成像仪上观察并记录试验结果。5.依据如下条件进行结果判断奇异变形杆菌应在357bp处有一条带。阳性对照和阴性对照试验只要将待测样品模板换成奇异变形杆菌阳性模板和奇异变形杆菌阴性模板(含大肠杆菌)即可，含有奇异变形杆菌的样品模板具有357bp片段，不含奇异变形杆菌的样品模板无此片段。标准菌株部分电泳结果记录见图2所示所有标准菌株除奇异变形杆菌有357bp片段外，其他菌株均无扩增产物。临床菌株电泳结果记录见图3所示总计有10株，除奇异变形杆菌有357bp片段外，其他菌株均无扩增产物。这说明采用PCR检测方法可排除假阳性反应，根据有无以上片段进行病原菌的检测盒鉴定，检测准确度提高了，避免了因检测失误而导致的不必要损失。利用上述实验步骤得到的杂交试剂盒，可用于检测奇异变形杆菌。以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。序列表<110>天津生物芯片技术有限责任公司<120>—种对奇异变形杆菌的ITS特异的核苷酸及其应用<130>7P13015-CN<160>5<170>Patentlnversion3.2<210>1<211>392<212>DNA<213>对奇异变形杆菌的ITS特异的核苷酸序列<400>1cctaagagatacgtgttatgtgcagtgctcacacagattgtctgatgaagaacgagcaaa60agcgcgtctgcgaagctgacaaaagtccccttcgtctagaggcctaggacaccgcccttt120cacggcggtaacaggggttcgaatcccctaggggacgccaatgcgcggtatgagtgaaag180gcgtaccacttatctgacgagagtcagagaataactaagctaattcaaatgagttatctt240acttattatgctctttaacaatctggaacaagctgaaaaattgaaaacaaatcaatatat300caccgaggtatattggtgagtctctcaaaatotcaaaccttaaagtttgtcacgcaaagt360ttatctttgaaaaagacactttcgggttgtga392<210>2<211>524<212>DNA<213>对奇异变形杆菌的ITS特异的核苷酸序列<400>2cctaagagatacgtgttatgtgcagtgctcacacagattgtctgatgaagaacgagcaaa60agcgcgtctgcgaagctgacagaagtccccttcgtctagaggcctaggacaccgcccttt120cacggcggtaacaggggttcgaatcccctaggggacgccaatgcgcggtatgagtgaaag180gcgtaccacttatctgacgagagtcagagaataactaagctaattcaaacgagttatctt240atttattatgctctttaacaatctggaacaagctgaaaaattgaaaacaaatcaatatat300caacaacgaggtatattgatgagtctctcaaaatctcaaactttgaatgtgttttgacat360caaagtgggatgagcgagcaatttacagttcgaggcggacagcgcacagcaagcgcagca420tacttaagtatgtgagcattgcgagcactgcccaacgaagaaatgtaatctgcgcagcca480tcaccacccagatagtctttgaaagagacactttcgggttgtga524<210>3<211>17<212>DNA<213>检测奇异变形杆菌的ITS的上游引物序列<40O3tgtacacaccgcccgtc<210>4<211>20<212>DNA<213>检测奇异变形杆菌的ITS的下游引物序列<400>4gactctcgtcagataagtgg<210>5<211>20<212>DNA<213>对奇异变形杆菌的ITS高度特异的核苷酸序列<400>5ccacttatctgacgagagtc权利要求1、一种对奇异变形杆菌的ITS特异的核苷酸，其特征在于包含如下核苷酸序列a)SEQIDNO1或SEQIDNO2所示的核苷酸序列或者其互补DNA或RNA序列；b)不同于a)但编码的氨基酸序列与a)所编码的序列相同的RNA序列；c)上述a)或b)中缺失、替换或插入一个或多个碱基、仍具有所述核苷酸功能的核苷酸序列。2、根据权利要求1所述的一种对奇异变形杆菌的ITS有特异性的核苷酸，其特征在于，所述的核苷酸为源于ITS的寡核苷酸，具有SEQIDNO:5的核苷酸序列或者其互补DNA或RNA序列。3、一种权利要求1或2所述的核苷酸的应用，其特征在于所述核苷酸作为引物用于PCR试剂盒、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于基因芯片或微阵列以检测细菌。4、一种PCR试剂盒，包括PCR引物、dNTP、缓冲液和DNA聚合酶，其特征在于所述PCR引物包括d)SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的核苷酸序列或者其互补DNA或RNA序列；e)上述d)中缺失、替换或插入一个或多个碱基、仍具有所述核苷酸功能的核苷酸序列。5、根据要求权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR引物SEQIDNO:3是根据细菌的16SrRNA基因保守区设计合成的，引物SEQIDNO:4是根据奇异变形杆菌的含有tRAN-glu的ITS设计合成的。6、权利要求4所述的试剂盒在检测奇异变形杆菌中的应用。7、一种权利要求4所述的试剂盒检测奇异变形杆菌的方法，其特征在于包括以下步骤(1)提取待测临床样品模板；(2)在PCR薄壁管中加入dNTP、MgCl2、10X酶特异性反应缓冲液、Taq聚合酶、PCR引物、待测样品模板和ddH20，混匀；(3)将薄壁PCR中混匀的混合物在PCR仪上扩增；(4)在电泳设备中电泳扩增产物，记录结果；(5)分析并进行结果判断。8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的临床样品模板包括临床样品中的血培养物、痰培养物、尿培养物或脑脊液培养物的粗提液，或是奇异变形杆菌的纯培养物的粗提液，或是纯DNA，或者是阳性对照品和阴性对照品。9、根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的临床样品模板的提取方法为(1)取培养物1.5ml，在8000rpm条件下离心5分钟，去掉上清液；(2)取500u1的ddH20重悬沉淀，在8000rpm条件下离心5分钟，去掉上清液，控干；(3)取100ulddH2O重悬沉淀，在10(TC沸水中水浴10分钟；(4)再置于冰上10分钟后，在12000rpm条件下离心2分钟；(5)取3iU中层上清做为PCR反应的模板。10、根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的PCR仪上的反应循环参数包括DNA的变性、复性、延伸的温度和时间、循环次数，具体为前期为使变性能够达到所需温度而必需的前期处理过程的一个循环为95"，5分钟；变性温度和时间为94°C，30秒；复性温度和时间为5(TC，30秒；延伸温度和时间为72r，30秒；变性、复性、延伸的循环次数为30个循环；为稳定扩增产物而进行一个循环的温度和时间为72°C，5分钟。11、根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)在电泳设备中电泳扩增产物，记录结果的具体步骤为-(1)取510"1扩增产物与6X溴酚蓝上样缓冲液以5:1的体积比混合；(2)将混合液上样于1%的琼脂糖凝胶上；G)将琼脂糖凝胶电泳120v稳压电泳约IO分钟，用DL2000Marker进行对照；(4)观察并记录结果。全文摘要本发明涉及一种对奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)中16SrRNA-23SrRNA基因的间区(Internaltranscribedspacer，简称ITS)特异的核苷酸，特别是涉及对奇异变形杆菌中的ITS特异的寡核苷酸及其应用，并提供了一种用本发明的寡核苷酸对为引物的PCR检测试剂盒及检测方法，利用该PCR试剂盒对人体及环境中的奇异变形杆菌进行检测，简便快速、特异性好、灵敏度高，可用于食品和临床样品的监督和检测、食物中病原菌检测、细菌学分类及流行病学调查等领域，具有深远的社会效益和较大的经济效益。文档编号C12N15/11GK101469326SQ20071030136公开日2009年7月1日申请日期2007年12月25日优先权日2007年12月25日发明者露冯,蕾刘,曹勃阳,敏王,磊王申请人:天津生物芯片技术有限责任公司