专利名称：一种兔抗人mk单克隆抗体及其杂交瘤细胞株和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种兔抗人MK单克隆抗体，以及产生该单克隆抗体的杂交瘤 细胞株，和兔抗人MK单克隆抗体在组织MK表达和血清MK浓度检测中的应 用。
背景技术：
癌症是威胁人类生命的重大疾病，对癌症的诊断一直是科学界关注的问题。 利用肿瘤标志物来对癌症进行检测因其操作简便，已成为一种很普遍的方法， 但是现在应用于临床诊断的许多肿瘤标志物都不甚理想，原因是它们的敏感性 和特异性都不高。因此，寻找一种特异性高，灵敏度好的新型肿瘤标志物对癌 症的诊疗具有重要的意义。中期因子(midkine,MK)是一个新发现的细胞因子，其基因最初是在视黄 酸(retiiioic,RA)诱导分化早期的胚胎肿瘤细胞中发现的，故又称视黄酸反应性 肝素结合性生长/分化因子，定位于llql1.2，由5个外显子和4个内含子组成， MK蛋白前体N端含有23氨基酸残基的信号肽，成熟的人MK蛋白由121个氨 基酸残基组成，相对分子量为13KD。它是一种具有促细胞转化、促有丝分裂作 用、促血管生成、抗细胞调亡和增强纤维蛋白溶解等肿瘤形成相关活性的碱性 肝素结合性蛋白质。许多研究表明在多种人类肿瘤组织中MKmRNA及蛋白呈 高度表达，而各种正常组织仅有低水平表达或无表达，并与肿瘤的发生，浸润 转移，血管生成及预后密切相关。又有研究表明中期因子在人血清及尿液中的浓度能很有规律地反映体内多种肿瘤发生、演进状况，其敏感性和特异性都很 高，可能成为一个优秀的广谱肿瘤新标志物。兔单抗是美国EIPITOMCS的公司专利技术。兔源单抗能识别许多在小鼠中 不产生免疫的抗原。兔脾脏较大，获得B细胞相对较多，可以进行更多的融合 实验，使得高通量筛选融合细胞成为可能。所以它比鼠源单抗更具优越性。发明内容本发明目的是针对该MK蛋白质，应用兔杂交瘤技术制备兔抗人MK的单克 隆抗体，应用其进行血清MK浓度检测，采用抗人MK的单克隆抗体研究MK 与人肿瘤的关系，用于临床肿瘤的筛査。本发明采用的技术方案是一种兔抗人MK单克隆抗体，由以下方法获得以GST-MK融合蛋白为抗 原获得的免疫后兔脾细胞，与兔骨髓瘤样240E细胞进行细胞融合，选择与 GST-MK融合蛋白呈阳性反应、而与GST蛋白呈阴性反应的杂交瘤细胞，进行 亚克隆并扩大培养，得到所述兔抗人MK单克隆抗体。所述GST-MK融合蛋白由如下方法制备得到将MK的cDNA目的基因插 入含有GST基因的质粒中、接在GST基因下游，得到重组质粒，重组质粒转化 大肠杆菌BL21，以含氨苄青霉素的培养基进行扩大培养，至OD6。。值达到0.3 0.6 时加入异丙基硫代半乳糖苷诱导表达，得到表达GST-MK融合蛋白的菌体，再 经PBS重悬、细胞破碎、离心，得到所述GST-MK融合蛋白。加入氨苄青霉素 是为了抑制污染菌生长，通常加入浓度为50 150mg/L。所述免疫后兔脾细胞可通过以GST-MK融合蛋白为抗原，对兔子进行免疫后获得，也可通过体外细胞培养、免疫获得。本发明构建含编码人MK的成熟肽cDNA全长基因的原核表达质粒，在大肠杆菌中表达谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase， GST) -MK融合 蛋白，并以此为基础制备MK单克隆抗体，为研究MK和肿瘤发生、发展的关 系及生物学功能创造条件。MidkinemRNA序列如下(下划线"一"表示信号肽序列，下划线" "表 示CDS序列1 gcgggaggga gcgaagcagc gcgggcagcg agcgagatgc agcaccga战cttcctcctc 61 ctcaccctcc tcgccctgct g畔ctcacc tccgcggtcg cc卿,aa aRat,gtg121 aagMggggg^g￡eeggggag_￡gagtgeg6lgagtggg￡￡Lggggg￡￡etg_￡a￡￡￡￡￡age 241 eggtg￡agggjg￡￡etgeasL￡tggaagaag^gsgffiggag_￡￡ga￡tg￡aa^ta6aagffi421 agga￡caaagjeaaagg￡￡aa_3g￡￡aagaaajggaagggaa_aggaeiagac gccaagcctg 481 gatgccaagg agcccctggt gtcacatggg gcctggccca cgccctccct ctcccaggcc 541 cgagatgtga cccaccagtg ccttctgtct gctcgttagc tttaatcaat catgccctgc 601 cttgtccctc tcactcccca gccccacccc taagtgccca aagtggggag ggacaaggga 661 ttctgggaag cttgagcctc ccccaaagca atgtgagtcc cagagcccgc ttttgttctt 了之1 cccc3c犯tt ccattect肌gaaacacatc aaat肪actg actttttccc ccc犯a犯犯 781犯3犯3犯犯a氨基酸序列如下1 mqhrgflllt llallaltsa vakkkdkvkk ggpgsecaew awgpctpssk dcgvgfregt 61 cgaqtqrirc rvpcnwkkef gadckykfen wgacdggtgt kvrqgtlkka rynaqcqeti 121 rvtkpctpkt kakakakkgk gkd本发明中，所述含有GST基因的质粒为pGEX-RT。 pGEX-lXT的多克隆位 点位于GST基因之后；采用分子克隆方法将MKcDNA目的基因插入后，接在 GST基因下游；重组质粒DNA序列测定结果证实了含有目的基因。将含有 pGEX-lXTMK质粒载体的菌株放入含氨苄靑霉素的培养基中进行培养，诱导表 达后，离心收集菌体进行SDS-PAGE分析。当基因进行表达时,表达产物为GST 和目的基因表达蛋白的融合体，目的基因预期表达蛋白相对分子量为13 400， GST蛋白相对分子质量为26 000，融合蛋白相对分子质量为39 000 (13 000+26 000)。本发明还涉及一种产生所述兔抗人MK单克隆抗体的杂交瘤细胞株，由以 下方法获得以GST-MK融合蛋白为抗原获得的免疫后兔脾细胞，与兔骨髓瘤 样240E细胞进行细胞融合，选择与GST-MK融合蛋白呈阳性反应、而与GST 蛋白呈阴性反应的杂交瘤细胞，即为所述杂交瘤细胞株。本发明还涉及所述的兔抗人MK单克隆抗体在组织MK表达和血清MK浓 度检测中的应用。本发明采用GST-MK融合蛋白作为抗原，既增加了抗原的免疫原性，又方 便筛选。用兔骨髓瘤样240E细胞应用杂交瘤技术进行制备，采用融合蛋白筛选 阳性克隆，选择与GST-MK蛋白反应而与GST不反应的特异性杂交瘤细胞株为 阳性细胞株；在western bloting鉴定，得到特异性抗MK的单克隆抗体，该单克 隆抗体可与人MK特异性结合，可应用于人血清中MK检测。
图1为MKRCR产物凝胶电泳图；图2为重组质粒pGEX-UT/MK酶切鉴定；图3为pGEX-RT/MK表达产物的SDS-PAGE分析；图4为纯化后表达产物SDS-PAGE分析； 图5为为抗体特异性的western blot分析；图6为应用该单克隆抗体对肝癌组织中MK检测。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不 仅限于此实施例1:重组质粒pGEX-RT/MK的构建及大肠杆菌转化MK的cDNA获得，中期因子(MK)基因由质粒pEGFP-MK (市购)(包 含T^C基因完整的cDNA)为模板，根据MK的成熟肽基因序列，设计合成一 对引物，扩增引物分别为Sense: 5' -TTTT GGATCC aaa aag aaa gat aag gtg aag ， Antisense: 5, -TTTT GAATTC gtc ctt tec ctt ccc ttt ctt。扩增产物两端分别是^^M和5coRI酶切位点，然后进行PCR扩增。取 PCR产物5ul经1.2%琼脂糖凝胶中电泳，用紫外分析仪检测电泳结果，电泳图 见图l，RCR产物的电泳结果表明，所扩增的目的基因片断和预期的一致为3S6bp (含保护碱基和酶切位点)。PCR产物经BamHI和EcoRI双酶切后，连入pGEX-RT载体(市购)，得到 含GST-MK融合蛋白基因的重组质粒。用重组质粒转化大肠杆菌BL21，然后把 大肠杆菌BL21铺于含氨苄青霉素(约50mg/ml)的LB平板，37"C过夜，分别 取pGEX-lXT/MK和pGEX-RT质粒菌转化菌进行扩增后，抽提质粒DNA进行 酶切鉴定(结果见图2)，经1.2%琼脂糖凝胶电泳，分为两个片断，分别为约4.9kb的pGEX-lXT和约380bp的MK基因片断，与理论值相符。经DNA测序 结果正确。实施例2: GST-MK融合蛋白的诱导表达分别挑取含有pGEX-aT/MK质粒和pGEX-lXT空载体的菌株放入3ml 2xYT 液体培养基(含100mg/ml的氨卞青霉素)37t:振摇过夜后，按1: 100稀释度 进行扩大培养。预培养至OD,达到0.3-0.6时加入异丙基硫代半乳糖苷 (isopropyl卩-D-thiogalactoside， IPTG)至终浓度0.4mmol/L开始诱导，未加IPTG 诱导的菌液作为对照，5小时后收获。收获后的菌体用PBS重悬，超声波破碎 细胞后离心，上清和沉淀分别取样进行SDS-PAGE分析(pGEX-l入T/MK表达 产物的SDS-PAGE分析结果见图3，对阅读框架分析，证明该重组质粒已正向 插入了目的基因，肯定了该重组表达质粒载体能正确表达pGEX-l入T/MK;纯 化后表达产物SDS-PAGE分析见图4)。同时取未加IPTG诱导前的菌总蛋白作 对照。结果显示，诱导后的样品无论上清，沉淀都比诱导前的样品多出一条蛋白带， 相对分子质量为Mr^39 000 (融合蛋白)；与预期的GST-MK融合的重组蛋白 分子量大小一致。空质粒pGEX-RT经IPTG诱导后，在Mr=26000 (GST蛋白) 处有明显的蛋白表达条带。这一结果说明GST-MK重组蛋白在大肠杆菌中获得 了大量表达，分别以可溶和包涵体两种形式存在。实施例3:兔抗人MK单克隆抗体的制备将融合蛋白0.25mg，溶于lmlPBS，与lml福氏佐完全剂完全融合，取二只 3kg左右兔子，乳化后背部皮下多点免疫。每隔两周取0.2mg，背部多点免疫。检测兔血清中抗体含量，以1:6万倍稀释为最佳标准。细胞融合前3天，用GST-MK 蛋白50ul进行加强免疫。取240E细胞和加强冲击免疫后兔脾细胞，以PEG4000 为融合剂进行细胞融合后，融合细胞铺96孔板，在5%(302、 37"C条件下培养。 融合2周后，抗原包被ELSIA板，检测特异性抗体分泌情况。分别包被GST-MK融合蛋白和GST蛋白为抗原，然后加入杂交瘤细胞上清， 用ELISA法筛选阳性克隆。选择与GST-MK融合蛋白呈阳性反应，而与GST蛋白 呈阴性反应的杂交瘤细胞作为阳性细胞克隆。然后以有限稀释法进行2次亚克 隆，筛选好克隆进行扩大培养，筛选最好的克隆进行第三次克隆(亚克隆)直 到达到单克隆化。实施例4:兔抗人MK单克隆抗体的鉴定(1) ELISA:按常规ELISA方法，杂交瘤细胞株的培养上清与GST-MK融合蛋白 反应，与GST蛋白不反应。说明单克隆抗体是针对MK蛋白的单克隆抗体。(2) 免疫印迹(westernblot):按常规免疫印迹方法，分别用GST-MK融合蛋 白和GST蛋白做抗原，经westernblot鉴定(见图5)，结果在相对分子质量为3卯00 处有一条矿员抗体结合的条带，而在26000处无特异性条带。进一步证明杂交瘤 细胞株所分泌的单克隆抗体可以结合GST-MK融合蛋白，但不与GST蛋白反应， 是特异性结合MK的单克隆抗体。(3) 抗体的效价测定包被GST-MK融合蛋白为抗原，用ELISA测定培养上 清的效价用0.01moL/L PBS稀释培养上清，同时做阴性对照(只加PBS)和 阳性对照孔(只加免疫兔的血清)。所检测的培养上清为单克隆化杂^ f细胞的 培养上清。mAb的效价显示可达达1: 64000。(4) 特异性测定将MK和与睫状神经营养因子(CNTF)，重组人细胞生长因子(Rh-GF)，胸腺素a原，千扰素(IFN-HAS)分别以l昭/ml包被酶标板，以杂交瘤 细胞上清50pl/孔孵育，间接ELISA检测各孔方法。交叉反应显示单克隆抗体能 特异地以与MK抗原结合，与CNTF， Rh-GF，胸腺素ct原，IFN-HSA无特异性结实施例5.抗人MK单克隆抗体在组织和MK表达和血清MK浓度检测中的应用免疫组织化学以实施例3中制备的单克隆抗体为一抗，对肝癌组织进行免 疫组化染色检测显示，细胞质和细胞浆中呈明显阳性反应(见图6)。结果显示 该单克隆抗体以组织中的MK蛋白结合。用实施例3中制备的单克隆抗体，通过双抗体夹心法检测癌症病人(108例) 和正常人(72例)血清MK蛋白的含量。结果显示正常人血清MK的浓度为(0.37±0.11) ng/ml，肿瘤病人血清MK浓度为(1.43±0.69) ng/ml，两者之间有 显著性差异(p0.05)。如果以0.6 ng/ml阳性判定值，癌症病人血清MK浓度升高, 而正常人血清中MK蛋白含量很低。灵敏度为86.1%，特异性达到97.2%。这说 明该单克隆抗体具有较好的特异性和灵敏度，该蛋白可能成为一个新的广谱肿 瘤标记物。序列表.ST25. txtSEQUENCE LISTING〈110>湖州市中心医院<120〉 一种兔抗人MK单克降抗休及JL:杂交痫钏胞株和应用〈130><160> 2<170〉 Psitentln version 3. 2<210> 1<211> 791〈212〉 隨<213> Homo sapiens<400> 1gCggg3ggg3gcg卿cagcgcgggcagcgsgcg3gatgcagcaccgaggcttcctcctx60ctcaccctcctcgccctgctggcgctcacctccgcggtcgagataaggtg120卿犯gggcggcccggggagcgagtgcgctgagtgggcctgggggccctgC3CCCCC3gC180agcaaggattgcggcgtgggtttccgcgagggC3CCtgCggggcccagacccagcgcatc240cggtgcagggtgccctgc犯gagtttgg3gccgactgcaagtacaagttt300g柳actggggtgcgtgtgatgggggcacaggcaccaaagtccgccaaggcaccctgaag360卿gcgcgctac犯tgctcagtgccaggag3CC3tCCgCgtX3CC33gCCctgcaccccc420朋gaccaaagagccaagaaaggg朋ggg朋3ggactagacgccaagcctg480gatgccaagg3gCCCCtggtgtcacatggggcctggcccacgccct'ccctctcccaggcc540cccaccagtgccttctgtctgctcgttagcttt33tC33tcatgccctgc600cttgtccctctcactccccagCCCC3CCCCtaagtgcccaggacaaggga660ttctggg犯gcttgagcctc3tgtg3gtCCcagagcccgctmgttctt720ccccacaatt780791〈210> 2〈211〉 143〈212〉 PRT<213〉 H。mo<400> 2sapiensMet Gin His Arg Gly Phe Leu Leu Leu Thr l>eu Leu Ala Leu Leu A丄a 15 10 i5l,eu Thr Ser Ala Val Ala t>ys Lvs Lys Asp Lys V3I Lys Lys Glv Gly 20 25 3bPro Gly Ser Glu Cys Ala Glu Trp Ala Trp Gly Pro Cys Tlu' Pro Ser 35 40 45Ser Us Asp Cys G1y ValPhe Ai'g Glu G1y Thr Cys Gly Ala Gin 5b 55 60Thr Gin Arg lie Arg Cvs Arg Val Pro Cvs Asn Trp Lys Lys Glu Phe 65 7b '75 ' ' 80Gly Ala Asp Cys Lys Tyr Lys Phe Glu Asn Trp Gly Ala Cys Asp Gly11序列表.ST25. txt 85 90 95Gly Thr Gly Thr Us Val Arg Gin Gly Thr Leu Lys Lys Ala Arg Tyr ' 100 10^ 110Asn Ala Gin Cys Gin Glu Thr lie Arg Val Thr Lys Pro Cys Thr Pro 115 120 125Lys Thr Lys Ala Lvs Ala Us Ala Lys Lvs Gly Lys Gly Lys Asp 130 ' 135 140
权利要求
1、一种兔抗人MK单克隆抗体，由以下方法获得以GST-MK融合蛋白为抗原获得的免疫后兔脾细胞，与兔骨髓瘤样240E细胞进行细胞融合，选择与GST-MK融合蛋白呈阳性反应、而与GST蛋白呈阴性反应的杂交瘤细胞，进行亚克隆并扩大培养，得到所述兔抗人MK单克隆抗体。
2、 如权利要求1所述的兔抗人MK单克隆抗体，其特征在于所述GST-MK 融合蛋白由如下方法制备得到将MK的cDNA目的基因插入含有GST基因的 质粒中、接在GST基因下游，得到重组质粒，重组质粒转化大肠杆菌BL21，以 含氨苄青霉素的培养基进行扩大培养，至OD600值达到0.3 0.6时加入异丙基 硫代半乳糖苷诱导表达，得到表达GST-MK融合蛋白的菌体，再经PBS重悬、 细胞破碎、离心，得到所述GST-MK融合蛋白。
3、 如权利要求2所述的兔抗人MK单克隆抗体，其特征在于所述含有GST 基因的质粒为pGEX-l入T。
4、 一种产生如权利要求1所述兔抗人MK单克隆抗体的杂交瘤细胞株，由 以下方法获得以GST-MK融合蛋白为抗原获得的免疫后兔脾细胞，与兔骨髓 瘤样240E细胞进行细胞融合，选择与GST-MK融合蛋白呈阳性反应、而与GST 蛋白呈阴性反应的杂交瘤细胞，即为所述杂交瘤细胞株。
5、 如权利要求1所述的兔抗人MK单克隆抗体在组织MK表达中的应用。
6、 如权利要求1所述的兔抗人MK单克隆抗体在血清MK浓度检测中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种兔抗人MK单克隆抗体及其杂交瘤细胞株和应用。所述兔抗人MK单克隆抗体由以下方法获得以GST-MK融合蛋白为抗原获得的免疫后兔脾细胞，与兔骨髓瘤样240E细胞进行细胞融合，选择与GST-MK融合蛋白呈阳性反应、而与GST蛋白呈阴性反应的杂交瘤细胞，进行亚克隆并扩大培养，得到所述兔抗人MK单克隆抗体。本发明以GST-MK融合蛋白作为抗原，既增加抗原的免疫原性，方便筛选。用兔骨髓瘤样240E细胞应用杂交瘤技术进行制备，融合蛋白筛选阳性克隆，选择与GST-MK蛋白反应而与GST不反应的特异性杂交瘤细胞株为阳性细胞株；在western bloting鉴定，得到特异性抗MK的单克隆抗体，该单克隆抗体可与人MK特异性结合，可应用于人血清中MK检测。
文档编号C12N5/16GK101255194SQ20071030130
公开日2008年9月3日 申请日期2007年12月26日 优先权日2007年12月26日
发明者行 姚, 戴利成, 钱福初 申请人:湖州市中心医院