专利名称：：一种海洋微藻δ5脂肪酸去饱和酶及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种海洋微藻-三角褐指藻的A5脂肪酸去饱和酶、其编码基因及应用。
背景技术：
：脂肪酸是具有碳氢链的单羧酸，在许多生物学过程中起着重要作用。脂肪酸较少以游离的形式存在，而是被脂化进各种主要的脂质成分中，如磷脂和三酰甘油。脂肪酸主要分为两类饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸，后者又分为单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸，其碳氢链中分别含有一个或多个顺式双键(C二C)。不饱和键的生成需要脂肪酸去饱和酶(fattyaciddesaturase)催化。脂肪酸去饱和酶存在于几乎所有植物、动物和微生物中，可将脂肪酸链中的C-C单键转化为C=C双健。根据其引入双键的位置不同，可以将去饱和酶分为A5、A6、A9、A12等，它们分别在脂肪酸链由羧基碳开始的第5、6、9、12位碳原子处引入双键。在脂肪酸链的羧基碳和第9位碳原子间加双键的酶又被称为前端去饱和酶(front-enddesaturase)，主要包括A4、A5、A6、去饱和酶。人及其它哺乳动物缺乏A12((o6)和A15(co3)去饱和酶，不能生成亚油酸(linoleicacid，LA;18:2A9，12)和a-亚麻酸(a-linolenicacid，ALA;18:3A9,12，15)，必须从食物中补充。高等植物由于缺乏前端去饱和酶，一般只能合成到亚油酸和亚麻酸，不能继续合成更长链的多不饱和脂肪酸。而某些微生物，特别是真菌、海洋微藻等则具有合成长链多不饱和脂肪酸(longchainpolyunsaturatedfattyacids,LCPUFAs)所需的所有去饱和酶，能够从头合成LCPUFAs且含量丰富(SayanovaandNapier,2004)。LCPUFAs是指含有20或22个碳原子及4-6个甲烯基间隔的顺式双键的脂肪酸(Abbadietal,,2004)，包括AA(arachidonicacid，20:4A5,8，11，14)、EPA(eicosapentaenoicacid,20:5A5，8，11,14,17)和DHA(docosapentaenoicacid,22:6A4，7,10,13,16,19)(俗称"脑黄金，，)等。根据脂肪酸链中最后一个双键距离甲基端碳原子的距离可将LCPUFAs分为n6系列和n3系列。AA属于n6LCPUFAs，EPA和DHA属于n3LCPUFAs。研究表明，LCPUFAs对人类健康有着非常重要的影响。AA和EPA是哺乳动物细胞膜的组分，也是生成前列腺素、白三烯和血栓素等激素的前体(Funk，2001);EPA在凝血、免疫和抗炎症等各种生理反应中起重要作用(Simopoulos,2002);DHA对胎儿神经系统的形成至关重要(Uauyeta1.，2001)，还影响着视网膜视紫红质的活性(Giustoetal.，2000)，并与某些疾病如关节炎、动脉硬化、抑郁症的预防和治疗有关(HorrocksandYeo,1999;MarszalekandLodish,2005)。AA、EPA和DHA在生物体内由LA和ALA经一系列去饱和及延伸反应生成。首先LA和ALA在A6去饱和酶作用下分别生成GLA(18:3A6,9，12)和SDA(18:4A6,9，12,15);然后经A6延伸反应生成DGLA(20:3A8，11,14)和ETA(20:4A8,11,14,17);再由A5去饱和酶作用生成AA(20:4A5,8,11，14)和EPA(20:5A5，8，11,14,17);EPA又可经过两条途径进一步生成DHA。虽然人体可以将外源LA和ALA转化为AA、EPA和DHA，但是合成效率极低，远远不能满足需要，在日常饮食中摄入充足的LCPUFAs(特别是EPA和DHA)就显得尤为重要。当前EPA和DHA的来源主要是深海鱼油，然而随着巿场需求的迅速增长和海洋可捕捞鱼类资源的日益减少，该途径已经远远不能满足需要。此外，环境污染等原因致使鱼油中的重金属含量越来越高。因此，寻找更为持续、稳定的EPA和DHA来源已成为当务之急(Tononetal.,2002;Domergueetal.,2005a)。虽然现已开发出商业化的海藻油和真菌油，但是其较低的产量和较高的提取成本限制了这类资源的大规模应用。考虑到植物油的提取工艺非常成熟，许多研究者已经将目光转向植物的代谢工程，探索如何利用已有的前端去饱和酶及延伸酶基因在高等植物特别是油料作物中构建LCPUFAs合成通路，使之成为稳定、廉价的LCPUFAs来源。目前该领域已取得突破性研究进展，使转基因植物作为"绿色细胞工厂"生产EPA、DHA成为现实(Truksaetal.，2006)。△5去饱和酶属于前端去饱和酶，催化ETA(20:4A8,11，14，17)生成EPA(20:5A5,8,11,14,17),是EPA及其后DHA生成的关键酶。现在已从动物、真菌及海洋微藻中克隆出A5去饱和酶基因并进行了功能鉴定。其中非动物来源的基因被应用于植物代谢工程(Qietal，2004;Abbadietal.，2004;Wuetal.,2005)，包括高山被孢霉(7WoWz'ere〃aa/p/we)、三角褐氺旨7葉(/Vzaecxi(3C/^/w附^7'cor"ww附)和一禾中真菌(77raz^toc/^Wzw2sp.)的A5去饱和酶。但是这几个酶的底物专一性较差，除了目标产物外，还会生成某些副产物，如三角褐指藻的A5去饱和酶对18:1A11、20:1A11、20:2A11，14、20:3A8，11，14、20:3A11,14,17等几种脂肪酸都起作用(Domergueetal.，2002)(GenBankAccessionNo.AY082392)。由于这些副产物对转基因植物和人体的影响所知甚少，它们的出现不利于转基因植物的商业化应用，因此继续克隆并筛选具有较高底物专一性和催化活性的A5去饱和酶是当前的研究热点之一。已知三角褐指藻富含EPA，最高含量可达到总脂肪酸的30%以上，A5去饱和酶作为EPA合成的关键酶应具有较高酶活。但是先前从该藻中得到的A5去饱和酶基因的底物专一性跟酶活性都不算高(Domergueetal.，2002)。此外，在国内外专利资料库中也未检索到关于海洋微藻A5去饱和酶基因的相关专利
发明内容本发明的目的在于提供一种三角褐指藻A5去饱和酶基因、其编码蛋白及应用。本发明所述三角褐指藻A5去饱和酶基因具有序列表SEQIDNO.l所示的核苷酸序列，其编码蛋白具有SEQIDNO,2所示的氨基酸序列；本发明还包括序列表SEQIDNO:2所示的氨基酸序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的衍生蛋白质，以及编码这些蛋白质的基因。本发明的A5去饱和酶基因长1431bp,与第一条A5去饱和酶基因(GenBankAccessionNo.AY082392)的核苷酸序列一致性(identity)为52%,编码476个氨基酸。在GenBank中进行同源搜索，未发现与该基因相同的序列报道，为一新基因。本发明的基因可以通过如下方式获得以三角褐指藻总RNA反转录得到的cDNA为模板，利用序列表SEQIDNO.3和4所示的引物进行扩增，扩增的条件是94。C预变性3min，以94°C30s、63°C30s、72°C1.5min反应30个循环，72。C延伸15min,4。C保存。本发明还包括含有上述基因的表达载体、含有所述表达载体的宿主细胞。本发明A5去饱和酶具有前端去饱和酶所特有的N端细胞色素Z>5结构域和3个组氨酸娱(176-180、215-219、413-417)，并且第3个组氨酸簇的第1个组氨酸(H)被谷氨酰胺(Q)替代。本发明的A5去饱和酶可以有效地催化ETA(20:4A8,11,14，17)生成EPA(20:5A5,8,11,14,17)，并且底物专一性高，酶活性高。本发明的DNA序列能够应用于包括动物、植物、微生物在内的任一表达体系，使转基因细胞生成LCPUFAs。例如，在油料作物亚麻(Zi"謂sp.)、油菜06ras57'casp.)、大豆(G7戶'"eandSb/asp.)、向曰莫(7/e/z'^决wi"sp.)、才帛花(Gcw57//w附sp.)、玉米(Zea附qy"、撒f览((9/eflsp.)、红花(CaW/2應z^sp.)、可可(77zeo6ram(3cacca)禾口花生(Jrac/z/ssp.)的植株和种子中表达该基因及A6去饱和酶、A6延伸酶等基因，能够使上述植物生成EPA、DHA，具有极高的商业开发价值。而EPA、DHA又可作为保健品或药物用于疾病的预防和治疗，如糖尿病、癌症、炎症反应和心血管疾病等。图l:pYES2质粒图；图2:A5去饱和酶催化脂肪酸ETA生成EPA的气相色谱分析结果。具体实施方式下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。实施例lA5去饱和酶基因的获得具体步骤包括(1)三角褐指藻的培养1)培养用海水为青岛近海自然海水，海水经脱脂棉过滤，IO(TC煮沸3min。250ml三角烧瓶及移液管等均在用前高压灭菌(12r，15min)。2)配制f/2母液(见说明书附图3)并灭菌。3)按l:1000(v/v)的比例向消毒海水中加入f/2母液，按l:10(v/v)的比例接入藻种，置于光照培养箱中不充气培养，每天摇瓶数次。具体培养条件见表1。表l三角褐指藻的培养条件培养基盐度/%。温度厂c初始pH光照/Wnols"irf2f/23120±18.170(12h:12h)f/2母液配制1.基本元素NaN03NaSi03-9H20NaH2P0478.4g+lLDDW(双蒸水);10g+lLDDW4.4g+lLDDW上述试剂高压灭菌(121°C,15分钟)，每1000ml培养液中各加入lml。2.微量元素上述试剂溶于lOOmlDDW中，取lml混合液加入1LDDW中，另加4.3克Na2EDTA，配好的微量元素母液与剩余的混合液一起高压灭菌后储存。使用时每1000ml培养液中加入lml微量元素母液。3.Fe元素FeC6H507,5H2039g+100mlDDW取10ml加入1LDDW中作为母液，与剩余的溶液一起高压灭菌储存。使用时每1000ml培养液中加入lml母液。Fe也可以与微量元素母液配在一起，也是加10ml。4.维生素VB120.5mgVB1lOOmgVH0.5mg棕色试剂瓶装1LDDW高压灭菌，降至室温后加入上述维生素，4'C储存。使用时每1000ml培养液中加入lml维生素母液。4)每天观察藻的生长情况，小新月菱形藻正常生长时藻液黄褐色，藻体可较长时间悬浮于培养基中，摇晃时藻液呈云雾状水团。定期进行传代培养，传代的同时进行镜检，观察有无藻体粘连或敌害生物污染。(2)简并PCR得到部分序列在GenBank中搜索A5脂肪酸去饱和酶的蛋白序列，选择了其中8种生物的序列进行比较，根据比较结果，选择相对保守的位点设计一对简并引物Sense:5'-CA(C/T)CA(C/T)GCITA(C/T)ACIAA-3，HHAYTNAntisense:5'-GG(A/G)AAIA(A/G)(A/G)TG(A/G)TG(T/C)TC-3'EHHLFP其中，I代表次黄苷(inosine)。先进行简并PCR的条件优化，最后确定的PCR反应体系及反应条件如下灭菌DDW10xPCRbufferdNTP(2.5mM/each)genomeDNA0单l(jL(2ng/|jL)Forwardprimer:0.2|aL(50pmoI7|jL)Reverseprimer:0.2(jL(50pmoL/(jL)TaqDNApoLymerase:0.05pL(5U/nL)总计lO(xL94。C,3min—94。C,30s—48°C，30s—72。C，45s—72°C,15min35个循环同时设置3个对照管，分别为只加正向引物、只加反向引物、空白水对照，总的反应体系仍为lO(iL。简并PCR产物电泳，回收了约600bp的目的条带，按照常规方法克隆到pMD18T-vector(TaKaRa)上，由上海英骏生物技术有限公司进行测序。(3)反向PCR得到基因全长根据简并PCR产物的测序结果设计一对特异引物，位置在简并引物以内，正向引物在已知序列的3'端并向其下游扩增，反向引物在5，端且往上游扩增。Forward:5'-AGTGACAACGCGAACACCACC-3，Reverse:5，-ATGCGATGCGGGATACTCTCG-3'同时，分析简并PCR产物的限制性图谱(RestrictionMap)，选择在这段序列中没有酶切位点的6种限制性内切酶，酶切三角褐指藻的基因组DNA。反应体系如下灭菌DDW:42^LgenomednA:1fiL("1jag/jjL)10xbuffer:5pLHMHKHM内切酶2pL万g/H万mHII￡coRI7//aIAWeIiVAeITotaL:50|iL37°C，酶切过夜为PCR模板。反向PCR反应体系及反应条件如下灭菌DDW:2.35^L2xGCIbuffer:5|aLdNTP(2.0mM/each):lpL酶切自连产物l|aL(2ng/nL)Forwardprimer:0.3pL(10pmoL/jxL)Reverseprimer:0.3|jL(10pmoL/|jL)LaTaqDNApoLymerase:0.05|liL(5U/|liL)总计10(iL94。C，3min—94°C，30s—63。C,30s—72。C,3min—72°C，15min_I30个循环结果发现用//p"I酶切自连产物为模板可得到一条长度约2500bp的条带，且为单一条带。PCR产物回收，按照常规方法克隆到pMD18T-vector(TaKaRa)上，测序。(4)RT-PCR得到mRNA序列由反向PCR得到的全长序列设计一对特异引物X/20I5'end:5，-CCGCTCGAGATGTGCGTGACGACGCCGGTAACG-3，XZwI3，end:5，-TGCTCTAGATTACTCCAATTTGGTAACTGCGTCCG-3，RT反应体系及反应条件如下1)约2吗总RNA+DEPC水(共22|iL),70°C，5min,立即置于冰上；2)5xbuffer10pL+dNTP(10mMeach)10}iL+oligodT(2.5mM)5(iL+HPRIl|iL+AMV2(iL,42°C,60min，95°C,5min,4。C保存。PCR反应体系及反应条件如下:灭菌DDW:10xbuffer:dNTP(2.0mM/each):酶切自连产物X/zoI5'end:XZwI3，end:LaTaqDNApoLymerase:5单lnLl|uL0.3|aL(10pmoL/nL)0.3|nL(10pmoL/fiL)0.05|aL(5l%L)总计lOpL94。C,3min—94。C'30s—63。C,30s—72°C，L5min—72°C，15min30个循环PCR产物按照常规方法克隆入pBS载体，测序。得到A5去饱和酶基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.l所示。(5)根据上述测序结果，来自三角褐指藻的第2个A5脂肪酸去饱和酶基因长度为1431bp，编码477个氨基酸残基，其编码的氨基酸序列如序列表SEQIDN0.2所示，该序列具有前端去饱和酶的特征结构域，包括N端细胞色素b5结构域和3个组氨酸簇(176-180、215-219、413-417)。实施例2表达载体pYD5-2的构建及酿酒酵母的转化1酿酒酵母表达载体pYES2及酵母菌株INVScl简介实验所用酿酒酵母表达载体pYES2(Irwitrogen)长585化p(图1),带有04ZJ启动子，该启动子为诱导型的，在培养基中有葡萄糖(glucose)存在时转录受到抑制，而除去葡萄糖加入半乳糖(galactose)则可以诱导转录。此外，细胞还可以在棉子糖(raffinose)作为碳源的培养基中生长，棉子糖既不诱导也不抑制转录，在其存在的情况下向培养基中加入半乳糖同样可以诱导转录，而且诱导速度比开始以葡萄糖为碳源培养的细胞要快。酵母菌INVScl的基因型为MATa/^3A7/e"2^;7-2卵"ra3-52/M4rot/^3A/^7陽2卵wra3-52,表现型为His-，LeiT，Trp.,Ura\质粒pYES2带有L^43基因，可用缺乏尿嘧啶(Uracil)的最小培养基筛选酵母转化子。其它详细信息参见Invitrogen的pYES2说明书(Catalogno.V825-20)。2表达载体pYD5-2的构建及阳性克隆的筛选1)提取藻细胞的总RNA并做反转录；2)基因克隆分析该基因mRNA序列的限制性酶切图谱，同时参考质粒pYES2的MCS设计一对特异引物D5-2NH:5-GCO^GC7TACCATGGCTTGCGTGACGACGCCGGTAAC-3，D5-2CE:5，-GCGG^77nTACTCCAAnTGGTAAITGCGTCCGTAnTC-3，其中正向引物带有历"dIII酶切位点，且根据质粒说明书推荐，"ACCATGG"有助于外源基因在酵母细胞中的表达，为了不使序列发生移码，ATG后面加了GCT，翻译为丙氨酸。反向引物带有五co7I酶切位点。PCR反应体系如下灭菌DDW:27.75pL5xPSbuffer:10|aLdNTP(2.5mM/each):4(xLcDNA:5pLD5隱2NH:1.5|iL(10pmol/|aL)D5-2CE:l单(lOpmol/^L)PrimeSTAR高保真酶0.25pL(2.5U/|aL)共计50|aL94。C,3min—94。C，30s—55。C，30s—72°C,1.5min—72°C，10min35个循环3)PCR产物回收，与pYES2同时用历"dIII和五coRI双酶切;4)回收酶切产物，连接，转化。挑单克隆摇菌提质粒，PCR、双酶切鉴定，初步判定为阳性的克隆送公司测序。测序正确的克隆大量摇菌提质粒，-2(TC保存，准备做酵母转化。3酿酒酵母感受态细胞的制备及转化1)INVScl在YPD平板上划线，30。C培养；2)挑取直径约2mm的单菌落于5mL液体YPD培养基，30°C摇过夜；3)取适量菌液接入50mL新鲜YPD,至OD綱约0.2，30°C,250rpm至OD600约1.0;4)室温，1500rpm，3min,lxTE(10mMTris，pH7.5;lmMEDTA)洗，lmLlxTE重悬，转至EP管；5)8000rpm，5s，弃上清，沉淀重悬于lmLlxTE/lxLiAc(100mM,pH7.5);6)离心去上清，沉淀重悬于250pLlxTE/lxLiAc，室温放置10min;7)取50pL感受态细胞，向其中依次加入240|iLPEG3350、36|iL10xLiAc(lM，pH7.5)、25pL变性鲑精DNA(2mg/mL)、50)iLpYD5-2或pYES2空质粒对照(l吗)，涡悬混匀；8)30。C摇床轻摇30-60min;9)加入40pLDMSO，轻轻混匀，42。C热击15min;10)6000rpm，15s，彻底去上清，lmLlxTE洗；11)6000rpm，15s,彻底去上清，05mLlxTE重悬，涂布SC-U(2%glucose)选择性平板，30。C静置3-4天，待平板上长起克隆。12)挑取酵母单菌落培养，提取酵母的DNA，用特异引物D5-2NH和D5-2CE做PCR,设置转空质粒的对照。PCR能够得到目的片段的表明该酵母菌为转入了D5-2基因的阳性克隆，用于做表达实验。实施例3酵母菌株的诱导表达及脂肪酸分析1诱导表达1)将含有重组质粒的阳性克隆及空质粒对照菌再次在sc-u(2%glucose)平板上划线，3(TC培养至长出菌落；2)挑单克隆接入3mLSC-U(2。/。raffmose)液体培养基，30。C摇过夜；3)取适量菌液离心，加入3.6mlSC-U(2%galactose),至初始OD細约0.2，加入400pL10。/。NP-40(终浓度1%),同时加入脂肪酸底物(20:4n3)至终浓度50(iM，20。C诱导72h。2脂肪酸提取及分析2.1脂肪酸提取1)将诱导后的菌液5000rpm,3min离心收集；2)液氮研磨，将研磨后的干粉转入EP管，加350pL氯仿:甲醇(2:l,v/v)，涡旋；3)超声处理，超3s，停3s,22%功率，3min，注意EP管置于冰水中；4)新EP管内每管加入少许酸洗过的玻璃珠，将超声处理的液体转入新管，原管用35(HiL氯仿:甲醇(2:l，v/v)洗，洗液同样转入新管，涡旋lmin，停lmin，重复3-4次；5)液氮冷却5min，转入4°C，裂解2h;6)4°C，12000rpm,5min，上清移入新管；7)力口300jiL0.9%KC1(w/v)，涡旋lmin,停lmin，重复3画4次；8)4°C，12000rpm,5min,下层氯仿层移入新EP管，原管用500^iL氯仿把KCl层再洗一遍，同样涡旋3-4次，离心，吸出下层氯仿与原先的合并；9)真空干燥除去氯仿；2.2脂肪酸甲酯化1)提取的脂肪酸加300pL正己烷重溶，加750pLHC1-CH30H(1N)，涡旋混匀；2)85°C，2h甲酯化；3)转入-2(TC，20min冷却；4)力P350^L0.9%KC1，涡旋，静止分层，小心取上层正己烷，转入新EP管，如需要可在原管中加适量正己烷再抽提一遍，合并正己烷；5)真空干燥，上样分析前用50pL正己烷重溶。2.3脂肪酸的气相色谱(GC)分析1)仪器安捷伦(Agilent)6890;色谱柱型号VarianCP7638;载气N2;线速20cm/s;分流比1:1;流量2.2mL/min;汽化室温度260°C;程序升温100。C(2min)—10。C/min升至180。C(0min)—4°C/min升至260。C(15min);检测器氢火焰离子化检测器(FID);2)以Sigma公司生产的各种脂肪酸甲酯为标准品；3)将标准品和上述甲酯化的脂肪酸样品进行GC分析，上样量均为2[xL。4)分析软件HPCHEM色谱工作站。3试验结果气相色谱分析显示，转入了pYD5-2的酵母诱导表达后能够将外源加入的脂肪酸底物20:4n3转化为20:5n3(EPA)，说明所转基因编码的蛋白的确具有A5脂肪酸去饱和酶的功能，确定为三角褐指藻的第2个A5脂肪酸去饱和酶。色谱分析结果如图2所示，A为加入底物后未经诱导的对照，B为加入半乳糖诱导表达的结果。脂肪酸组成<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>加入半乳糖诱导可将70%的外源底物20:4A8,11,14,17转化为EPA，而对照未检测的到EPA。序歹U表<110〉中国海洋大学<120〉一种海洋微藻A5脂肪酸去饱和酶及其应用<130〉<140〉200610169685.8<141〉2006-12-27<160〉6〈170〉Patentlnversion3.3<210〉1<211〉1431〈212〉DNA〈213〉尸Age。^3cW"/to'cormt"/〈220>〈221>CDS〈222〉(1).(1431)〈400〉〗atgtgcMetCys1gcgeggAlaArggtcg￡lCValAspgatttgAspLeu50ggsggcGlyGly65ggacccGlyProgtgValgacAspax:cThr35gacAspAsn犯tAsnacgThrgccAla20ttgLeu3CgThr5gccAlagetAlaccggtaacgProValThratggacgtgMetAspValtegttcSerPhegacgtgAspValaa^tax:eggLysTyrArgaaacgcgaaLysArgGluc犯GintgcCys100gtcValtacTyr85g恥GluttcPheccc犯tProAsngatcatAspHis55scggtcThrVal70gcgcaaAlaGinC3CHis40cccProctgLeu卿LysgtcValtegSer25gttValC3CHis10tta_LeutgtCysax:ctecThrSereggaacArgAsnateg￡LClieAspggttegGlySerggggggGlyGlytacaagTyrLystattegttcTyrSerPhecagattgtcGinlieValMetggtGly105cgtArgLys90tecSercgcArgg3tAspMet75etaLeugatAspggaGlytecSer60attliegtcValtttPhecaaGina肌LysgggGly45attlieteaSer30肌gLyscacHiscatccgHisProggtGlyggcGlygagGlugtgValLys110ttcPheattlie15ctgLeugtcValgtcValcatHis3tgMet95gagGlucccProtegSerttcPhetttPheC3CHis80gacAspatgMetggcacgGlyThr4896144192240288336384115120125gtgggttacttcttccgagccttcetctacattgcctttttcgttgcc432ValGlyTyrPhePheArgAlaPheLeuTyrlieAlaPhePheValAla130135140gtggtgtaccgatggacctttcagacgggtccctectacgggttgget480ValValTyrArgTrpThrPheGinThrGlyProSerTyrGlyLeuAla145150155160gttgtttttggcctggesC3ggetttg3tcgg3etcgtcc朋C3C528ValValPheGlyLeuAlaGinAlaLeulieGlyLeuAsnValGinHis165170175gacgccaatcacggcgetgccgccccaccgggacgtaagaacgtatgg576AspAlaAsnHisGlyAlaAlaAlaProProGlyArgLysAsnValTrp180185190ateaacgacetcetcgggtggggagccga_tetca_ttggtggctgtaaa624lieAsnAspLeuLeuGlyTrpGlyAlaAspLeulieGlyGlyCysLys195200205tacetctggattcaaaaacactgga_cgcaccacgcctacaccaatcac672TyrLeuTrplieGinLysHisTrpThrHisHisAlaTyrThrAsnHis210215220gcggagaaggatcccgacgcctttgccgccgaaccgtttttgatettt720AlaGluLysAspProAspAlaPheAlaAlaGluProPheLeuliePhe225230235240cgagaatatcccgcategcatcccgcceggcagtggtaccacaagtat768ArgGluTyrProAlaSerHisProAlaArgGinTrpTyrHisLysTyr245250255caaacgcttetctttetaccaa/tcattgccggttactggetcteateg816GinThrLeuLeuPheLeuProlielieAlaGlyTyrTrpLeuSerSer260265270gtacttagtctggaagta_gccaaactgcaggacgcgggcgccatgage864ValLeuSerLeuGluValAlaLysLeuGinAspAlaGlyAlaMetSer275280285gcctegatgaaattcgaaaacgatttcgtggcccgacaacgcaagttt912AlaSerMetLysPheGluAsnAspPheValAlaArgGinArgLysPhe290295300acggtcttttggtgcattgtacatttggttattagtttgggaccgccc960ThrValPheTrpCyslieValHisLeuVallieSerLeuGlyProPro305310315320ttgeggc肌cacggtetcaccgccaccgcaetcggacaagcattgacg1008LeuArgGinHisGlyLeuThrAlaThrAlaLeuGlyGinAlaLeuThr325330335gtaggggcggcagggagtcttttcttgggatgtetcttttecttgteg1056ValGlyAlaAlaGlySerLeuPheLeuGlyCysLeuPheSerLeuSer340345350cacaactttgtcaacgccgaaegggaccccaccgccgtcctgg'cgcca1104HisAsnPheValAsnAlaGluArgAspProThrAlaValLeuAlaPro355360365CC3ProgtcVal385MtPheThrcccProactThr465CC3Pro370tgcCysgtcValccgProtggTrptcgSercacttgttcHisLeuPhegtgValtggTrp450ggtGlycgcArg435etcLeuggaGlyCC33CCProThrt3C333TyrLysggtgC3GlyAla405ccgcgaProArg420cgtgccArgAlagiiCAspgccAla3恥etcLeuMettgtCysgggGly375cagGinacgThragtSergcgAlaagtgacaacSerAspAsngtgg333CCValGluThrtggC肌33C3tgTrpGinAsnMet455aatacggacgcaAsnThrAspAla470ggcGlytcgSeraaaLys440gcgAlaggtGlygccAla425HistecSeretcLeu410tggTrp肌cAsnatgMetgcgAlatecSer395Asn肌cAsn380tgcCystttPheaccThrgccAlaGinsecgcacccThrAlaProtgtccctttCysProPhegttaccaaaVa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