专利名称：脂肪酸去饱和酶基因，含该基因的载体，用该基因转化的植物，以及产生该植物的方法
技术领域：
本发明涉及编码对在Δ9位置上与脂相连的脂肪酸具有去饱和活性(以后称为“Δ9去饱和”)的蛋白质的基因，含有该基因的载体，用该基因转化的植物及产生该植物的操作过程。
背景技术：
构成有机体生物膜的膜脂的状态随着外界温度下降而由液晶态变为固态。这个改变称为“相分离”。相分离涉及生物膜特性的变化。据信膜脂在固态时丧失物质透性选择力，这样使生物膜不能发挥其基本功能，从而使细胞受到损伤(低温损伤)。
膜脂相转变的温度——在该温度下膜脂由液晶态变为固态，主要取决于与脂相连的脂肪酸酰基的不饱和程序(碳链中双键的数目)。与之相连的二个脂肪酸酰基团都是饱和脂肪酸残基的脂类分子其相转换温度高于室温，而与之相连的脂肪酸酰基团至少带有一个双键的脂类分子的相转换温度则低于0℃(Santarec，J.F.等，Biochim.Biophys.Acta，687231，1982)。
通常一个脂肪酸中的双键位置从羧基末端碳原子数至出现该双键处碳原子并以数标示在符号Δ之后。总的双键数目置于总碳原子数之后并用冒号分开。例如亚麻酸记为182Δ9，12，可用下列结构式代表CH3(CH2)4CH＝CHCH2CH＝CH(CH2)7COOH在某些情况下，双键位置从脂肪酸甲基端碳原子数至有双键碳原子处并以数标示在符号ω之后。
在高等植物的膜脂中只有磷脂酰甘油(PG)含有相对大量的饱和分子，这就强烈暗示PG的相转换导致植物低温损伤(Murata，N.等，PlantCell Physiol.231071，1982；Roughan P.G.，Plant Physiol.，77740，1985)，而PG的分子组成则取决于存在于叶绿体中的甘油-3-磷酸酰基转移酶(以下称为ATase)的特异性底物。(Frentzen，M.等，Eur.J.Biochem，129629，1983；Murata，N.，Plant Cell Physiol.，2481，1983；Frentzen，M.等，Plant Cell Physial.，281195，1988)。
Nishizawa等实验显示，把从一种抗冻植物拟南芥菜Arabidopsisthaliana)中获得的ATase基因引入烟草并表达，PG中饱和类分子含量下降，因而赋予植株较其野生型具有更高的抗寒冻性(PCT/JP92/00024，1992)。然而植物本身也有ATase，即使在外源ATase大量表达时仍不可避免地与内源ATase产生竞争，从而使得这些外源ATase的效应被减弱。例如，烟草转化体表达拟南芥菜ATase最多的一个克隆的叶中PG的饱和分子含量为28％，这比烟草野生型低8％，但却比拟南芥菜野生型高8％(PCT/JP92/00024，1992)。
在质体中产生的多数酰基-ACP通常包括16∶0-ACP及18∶1-ACP，据信它们的比例相等。在某些组织中，16∶0-ACP及18∶0-ACP的比例高于18∶1-ACP的比例(Tariyama，S.等，Plant Cell Physial.，29615，1988)。在这些组织中，很难通过运用外源ATase酶使饱和类分子品种含量下降至满意的水平。
光合蓝细菌(蓝绿藻)的膜脂组成与构成高等植物叶绿体膜系统的脂类相似(Murata，N.等，in the“The Biochemistry of Plants”，Academic Press，1987)。在蓝绿藻中，与膜脂相连的脂肪酸的不饱和程度是由具有使这些脂相连脂肪酸去饱和能力的酶类所控制。目前已知仅能向脂相连的脂肪酸中引入一个双键的构巢组囊藻(Anacystis nidulans)聚球藻(Synechococcus)PCC 7942)对寒冻敏感(Ono，T.等，PlantPhysiol.，67179，1981)，而至少能引入两个双键的集胞藻(Synechocystis)PCC 6803则对寒冻有抗性(Wada，H.等，Plant CellPhysiol.，30971，1989)。
蓝绿藻中所有脂肪酸的去饱和酶均以脂类为其底物通过与底物反应将双键引入到脂相连的脂肪酸中。因此，由16∶0/16∶0-及18∶0/16∶0等饱和分子品种组成的蓝绿藻膜脂中的PG、SQDG、MGDG、DGDG之类脂肪酸分子中可以被引入顺式双键(Murata，N.等，在“TheBiochemistry of Plants”，Academic Press，1987)。在这方面，高等植物与蓝绿藻有着很大的差别，它们所具有的脂肪酸去饱和酶能在硬脂酰-ACP(18∶0-ACP)的Δ9位置引入双键却不能在合成的由16∶0/16∶0(及少量的18∶0/16∶0-)等饱和分子品种组成的PG或SQDG中引入双键。
目前已知在构巢组囊藻(Anacystis nidulans)中引入并表达集胞藻属(Synechocystis)PCC 6803的Δ12去饱和酶基因能产生非构巢组囊藻内源存在的16∶2Δ9，12，从而赋予对寒冻敏感的构巢组囊藻(Anacystisnidulans)以对寒冻的抗性(Wada，H.等，Nature，347200，1990)。
迄今由蓝绿藻中所获得的去饱和酶基因有Δ6去饱和酶(Reddy，A.S.等，Plant Mol.Biol.，27293，1993)及Δ12去饱和酶(Wada，H.等，Mature，347200，1990)基因。然而，Δ6和Δ12去饱和酶不能分别地在脂肪酸Δ6和Δ12位置上去饱和，除非在其Δ9位置上引入一个双键。而且，只有Δ9及Δ12位置上脂肪酸去饱和之后，Δ15去饱和酶才能使该脂肪酸在Δ15位上发生去饱和。因此，一旦将能在Δ9位置使脂肪酸去饱和的酶类基因引入到高等植物并使之表达，它们应该能够降低高等植物中饱和分子品种的含量从而授予高等植物抗寒冻性。然而能在Δ9位使饱和脂肪酸去饱和的酶类基因至今还没有得到。
所以，本发明的目的之一是提供在Δ9位置具有饱和脂肪酸去饱和化能力的酶类基因及含有上述基因部分的多核苷酸。
另一目的即是提供含有在饱和脂肪酸Δ9位置上具有去饱和能力的酶类基因的载体或含有该基因部分的多核苷酸的载体。
本发明进一步的目的是提供由Δ9位去饱和酶基因或含有该基因部分的多核苷酸转化的植物细胞及植株。
发明内容
发明者们由于通过不同的研究实现了上述目标，他们成功地从组囊藻(Anacystis)属的蓝绿藻基因组DNA中克隆了编码Δ9去饱和酶基因，获得了整合该基因的载体DNA，并以这种载体DNA转化了植物细胞，而且还使细胞分化以再生植株，这样赋予植物以抗寒冻性。本发明是基于以下发现而实现的。本发明主要内容如下(1)基因编码的蛋白质具有在Δ9位置使脂相连脂肪酸去饱和化的活性。
(2)在(1)中所述基因或含有该基因部分的多核苷酸，其中蛋白质具有在Δ9位置使脂相连的脂肪酸去饱和活性含有大体上已在SEQ ID No.4中展示的氨基酸序列。
(3)在(1)所述基因或含有该基因部分的多核苷酸，其中编码具有能在Δ9位置使脂相连的脂肪酸去饱和化的蛋白质的基因是含有SEQ IDNo.3所示碱基序列的DNA链。
(4)含有按照(1)-(3)项中任何一项所述的基因或包括该基因部分的多核苷酸的载体。
(5)用(1)-(3)中任何一项所述的基因或包括该基因部分的多核苷酸转化的植物细胞。
(6)一个通过(5)中所述植物细胞分化而再生植株的产生植株方法。
(7)用(1)-(3)中任何一项所说的基因或包括其基因部分的多核苷酸转化的植株。
附图简述
图1显示des 9 var片段编码氨基酸序列与小鼠硬脂酰-辅酶A去饱和酶(MSCD2)的氨基酸序列的比较。在图1中，表明两个序列中有相同的氨基酸；说明两个序列中有着性质相似的氨基酸；X则表示有高度同源性。
图2是一个以des 9 var片段作探针的构巢组囊藻(Anacystisnidulans)基因组DNA在Southern分析中的放射自显影的电泳图。
图3表示插入的DNA片段λ5，λ15及p15X之间的关系。粗箭头表示蛋白质的编码位置及方向。细箭头表示测序位置及方向。
图4显示des 9 nid片段编码氨基酸序列与小鼠硬脂酰-辅酶A去饱和酶(MSCD2)氨基酸序列的比较。比较方式与图1相同。
图5中两幅照片显示了在转化烟草植株低温处理后对其生物学形态的影响。左图表示为用去饱和酶基因转化烟草低温处理后结果，右图表示的是用pBI 121转化烟草低温处理后结果。
实现本发明的优选实施方案在背景说明中已提及本发明的Δ9去饱和酶是在蓝绿藻中内源存在的一种酶。Δ9去饱和酶的化学结构与小鼠(Kaestner，K.H.等，J.Biol.Chem.，26414755，1989)、大鼠(Mihora，K.，J.Biochem.，1081022，1990)及酵母(Stukey，J.E.等，J.Biol.Chem.，26520144，1990)等的硬脂酰-辅酶A去饱和酶有局部相似之处，但作整体看则差别很大。而且它的化学结构与已知的能在Δ6、Δ12对脂相连脂肪酸有去饱和能力的蓝绿藻酶类及有同样功能的在ω3位去饱和的高等植物酶类(Yadav，N.S.等，plant physiol.，103467，1993)相比则全然不同。在这里本发明的基因是从天然原料中得到，而蓝绿藻可作为原材料。所用蓝绿藻包括组囊藻(Anacystis)属，集胞藻(Synechocystis)属及鱼腥藻(Anabaena)属等但并不仅限于这几属。为使高等植物中饱和分子去饱和化，基于以下原因倾向使用组囊藻(Anacystis)型Δ9去饱和酶(Murata，N.等，PlantCell Physiol.，33933，1992，属于组囊藻(Anacystis)属的I型蓝绿藻)，而不使用鱼腥藻(Anabaena)及集胞藻(Synechocystis)型去饱和酶。
集胞藻(Synechocystic)PCC 6803及多变鱼腥藻(Anabaenavariabilis)中几乎所有的膜脂上sn-1及sn-2位置均分别地被18碳原子(C18)及16碳原子(C16)的脂肪酸所占有(Sato，N.等，Biochim.Biophys.Acta，710279，1982；Wada，H.等，Plant Cell Physiol.，30971，1989)。另一方面，构巢组囊藻(Anacystic nidulans)中几乎所有膜脂的sn-1及sn-2位置都由C16所占有(Bishop，D.G.等，PlantCell Physiol.，271593，1986)。因此，可以相信鱼腥藻(Anabaena)及集胞藻中Δ9去饱和酶具有以18∶0/16∶0分子品种为底物使sn-1位置上18∶0去饱和成为18∶1Δ9的反应活性，而组囊藻中Δ9去饱和酶则具有以16∶0/16∶0分子品种为底物使sn-1位置上16∶0去饱和成为16∶1Δ9的反应活性。考虑到高等植物含有大量的16∶0/16∶0类饱和分子品种，那么以去饱和高等植物中饱和分子品种为目的则选取组囊藻(Anacystis)型Δ9去饱和酶比选取鱼腥藻及集胞藻型Δ9去饱和酶更为合适。
以下实例将显示本发明的基因包括编码含有基本上在SEQ IDNo4中展示的氨基酸序列的Δ9去饱和酶基因以及除简并密码子以外的能编码同一多肽片段的简并异构体。本发明中基因主要是用DNA链形式。大体上在SEQ ID No4展示的氨基酸序列不仅包括在SEQ IDNo4中所展示的氨基酸序列，而且也包括上述序列经过部分删除、替换及增补等修饰之后所产生的而仍保留有Δ9去饱和酶活性的序列。
本发明的基因可从前述的蓝绿藻细胞用已知任何常规技术来制备。
制备本发明基因的过程简述如下培养蓝绿藻细胞，收集细胞，用常规的已知技术如乙醇沉淀或其他方法制备基因组DNA，以基因组DNA为基础构建基因文库，从文库中选择目的基因的克隆并使之扩增。
用于构建基因文库的载体包括任何常规载体特例的包括噬菌体例如λDASH II(Stratagene)，噬菌体柯斯质粒如pWE 15，(Stratagene)，噬菌体质粒如pBluescipt II(Stratagene)等。本发明的基因可用针对某一载体特定类别的常规方法引入到这些载体中。
本发明所引入的基因的克隆即从如此制备的基因文库中筛选获得。
筛选克隆的方法包括任何已知的常规方法，如噬菌斑杂交和菌落杂交，运用抗体的免疫学筛选法以及运用核苷酸探针的噬菌斑杂交法及菌落杂交法。核苷酸探针选择法的优化准则是所选用探针的部分碱基序列经估测应与本发明基因序列相似(例如，图1中所示编码MSCD2中260-295处氨基酸序列的碱基序列)。
本发明在选得的克隆中基因的碱基序列可用常规的Maxam-Gilbert方法(Maxam-Gilbert，Methods Enzymol.，65499，1980)及应用M13噬菌体的双脱氧链终止法(Messing，J.等，Gene，19269，1982)进行确定和证实。
Δ9去饱和酶的实际表达可以用例如Wada等(J.Bacteriol.，1756056，1993)法加以证实。
本发明基因一旦测序，就可以用商业上能得到的DNA合成仪采用任何一种已知的常规方法例如亚磷酸盐方法进行合成。
具有Δ9去饱和酶活性的本发明基因或含有基因部分片段的多核苷酸可从筛选所得的克隆中分离，整合进到欲引入宿主植物的载体，把该载体引入植物细胞并在植株中表达Δ9去饱和酶，从而赋予植株抗寒冻性。
引入基因的植物种类无特别限制。
为引入基因所构建的载体应适合于Δ9去饱和酶基因在植物中稳定地表达。更准确地说，启动子、编码翻译调控区的DNA序列、编码转移至叶绿体处肽的DNA序列、具备Δ9去饱和酶活性的本发明基因或含有基因部分的多核苷酸、编码终止密码子及一个终止子的DNA序列，它们均需整合至适当的位置。在构建导入除本发明的基因以外的基因各种元件时可应用任何常规的已知元件。编码转移至叶绿体处肽的DNA序列的优选实例是豌豆核糖-1，5-二磷酸羧基酶小亚基的基因。启动子实例是花椰菜花叶病毒35S启动子。终止子实例是胭脂碱合成酶终止子。
基因导入植物细胞的方法包括各种已知的常规方法，这些方法的描述见“Plant genetic tfransformation and gene expression；alaboratory manual”，Draper，J.等，Blackwell Scientific Publications，1988。典型的方法包括应用病毒及杆菌的生物学方法，如电穿孔的物理化学方法，聚乙二醇法及显微注射方法等等。在这些方法中应用农杆菌对诸如烟草类的双子叶植物是最好的，因为使用它能保证稳定的转化。应用农杆菌的方法包括应用一种野生型肿瘤质粒作为中间过渡载体的方法(Nature，287(1980)p.654；Cell，32(1983)p.1033；EMBO J.，3(1984)p.1525)，使用T-DNA上肿瘤形成基因区缺陷的载体作为中介载体的方法(EMBO J.，2(1983)p.2143；Bio/Technology，3(1985)，p.629)以及双元载体等(Bio/Technology，1(1983)p.262；Nature，303(1983)p.179；Nucl.Acids Res.，12(1984)p.8711)。以上任一方法均可使用。以农杆菌感染植物方法的范例包括直接接种至培养细胞，与原生质体共培养以及叶-圆盘等方法。其中叶-圆盘方法依据其直接、简便并产生大量转化植株的能力、是优选的方法。
为获得再生植株，转化的植物细胞可以在已知培养基如Muroshige-Skoog培养基中培养，这种培养基补充以有选择性的抗生素、植物生物激素及其它试剂。长出根的幼苗要移植至土壤中使其长成完整植株。
生长成熟的转化植株可通过如下步骤检测其抗寒冻性被测植株在不会受到寒冻损伤的温度下培养生长(如25℃)，然后转移至低温处(例如4℃)短暂生长(如一周)。植物所受损伤，可以检测如萎黄及繁育力下降。或者比较它与对照植株的生长情况。
本发明现在将用如下的实例进行详细说明，但这些实例决不意味要限制本发明应用范围。
〔实例1〕多变鱼腥藻(Anabaena variabilis)Δ12去饱和酶基因(des A)上游开放阅读框架侧翼DNA片段的克隆多变鱼腥藻IAM M-3由东京大学分子及细胞生物科学研究所提供。在约100ml的BG-11培养基中生长(“Plant Molecular Biology”，Shaw，C.H.ed.，p.279 IRL PRESS，1988)。该培养物在25℃、1000lux荧光灯照射下以120rpm速率振荡使细菌充分生长。培养液在室温下用5000g离心10分钟收集沉淀的细胞。
为制备基因组DNA，细胞在50ml溶液A(500mM Tris-HCl1mM EDTA，pH 8.0)中悬浮，清洗后再离心收集沉淀的细胞。随后细胞在15ml溶液B(50mM Tris-HCl，20mM EDTA，50mM NaCl，0.25M蔗糖，pH 8.0)中悬浮。然后加入40mg溶菌酶(Sigma)至溶液B使之溶解，把混合液置于37℃振荡1小时。再向该振荡培养物中加入蛋白酶K(15mg)及SDS(终浓度为1％)并使混合液在37℃振荡过夜。继续向振荡培养物中加入NaClO4至终浓度为1M，再加20ml氯仿/异丙醇(24∶1)。所得混合物振荡10分钟后离心收集水相。用氯仿/异戊醇重复抽提之后，向所得水相中加入50ml乙醇，基因组DNA制备物可用玻璃棒缠绕之后收集获得。DNA制备物以20ml溶液A溶解并加入NaCl至终浓度为0.1M。加入RNA酶至终浓度为50mg/ml，所得混合物在37℃温育1小时。随后以等体积的由溶液A饱和的苯酚抽提两次，并加乙醇至水相收集沉淀的基因组DNA。以70％乙醇清洗后使之溶解于1ml的溶液A中以获得多变鱼腥藻的基因组DNA溶液。
Sakamoto等报道在Δ12去饱和酶基因上游存在有开放阅读框架(ORF)侧翼序列，他们在关于从多变鱼腥藻中一个膜脂相连饱和脂肪酸Δ12去饱和酶基因的克隆的报告里推测上述序列与去饱和酶有某种关系(Lecture Abstract No.3aF04 in the 1993 annual meeting ofThe Japanese Society of Plant Physiologists)。但ORF的功能未被鉴定。发明者对ORF及其功能有兴趣。他们注意到ORF处DNA链的三个碱基序列并合成了四个引物(SEQ ID Nos5-8)，以此引物用多变鱼腥藻基因组DNA作为模板进行聚合酶链式反应。
这四个引物中，有SEQ ID Nos5-6的碱基序列的引物编码正义链而SEQ ID Nos7-8的碱基序列的引物则编码反义链。SEQ IDNos6-7的碱基序列是来源于同一氨基酸序列。由上述正义链及反义链各选一种构成一对引物并用这总共有四种引物组合完成聚合酶链式反应。向反应液(100μl)中加入引物(每种20μM)及多变鱼腥藻基因组DNA(1μg)，反应用Gene Amp PCR试剂盒进行(TAKARA SHLZOCO.，LTD.)。完成聚合酶链式反应共进行35个循环，每一循环包括95℃(1分钟)，45℃(1分钟)及72℃(2分钟)。在第一个循环中，95℃保持3分钟。反应结束之后，把反应液(10μl)放在2％琼脂糖凝胶上电泳以分析合成的DNA。分析结果表明在以SEQ ID Nos6和8作为引物组合所合成DNA中作为被检测的主带具有预期长度(约190bp)的DNA片段。该DNA片段(以下称为des 9 var)以Klenow片段处理形成平头末端，然后克隆进入质粒pTZ18R(Pharmacia)的SmalI位点，随后以荧光DNA测序仪测定碱基序列(Applied Biosystems)。测得的碱基顺序表示在SEQ ID No1中。由此碱基序列所推测的氨基酸序列(SEQ ID No2)与小鼠硬脂酰-辅酶A去饱和酶有相当高的同源性(见图1示des 9 var片段编码的氨基酸序列与小鼠硬脂酰-辅酶A去饱和酶(MSCO2)相应序列的比较)。
随后以des 9 var片段为探针对构巢组囊藻基因组DNA作Southern杂交分析。分别用三种限制性内切酶Xho I、Pst I及BamHI切割构巢组囊藻基因组DNA(约0.1μg)。所产生DNA片段用在0.8％琼脂糖凝胶上电泳进行分离，然后印迹至尼龙膜上(Hybond-N+；Amersham)。DNA探针用Multiprime DNA标记试剂盒(Amersham)以〔α-32P〕dCTP标记。DNA探针在反应液中与尼龙膜于55℃共同温育反应16小时，反应液中包括6×SSPE(1×SSPE为10mM phosphate bufler(pH 7.0)，1mM EDTA及0.15MNaCl混合液)、0.2％ SDS、100μg/ml鲱鱼精DNA。处理后所得尼龙膜以2×SSC(1×SSE由0.15M NaCl、15mM柠檬酸钠组成)在室温下振荡15分钟进行清洗共清洗二次，再以0.1×SSC于40℃振荡15分钟共清洗二次，然后进行放射自显影进行分析。结果表明以任何限制性内切酶切割基因组DNA都只能检测出一个DNA片段(见图2，在图2中“Non”表示基因组DNA用任何限制性内切酶酶切)。
〔实例2〕构巢组囊藻基因组DNA中与des 9 var片段有高度同源的DNA链的克隆构巢组囊藻R2-SPc培养物由东京大学分子及细胞生物科学研究所提供，其基因组DNA制备方法与前述多变鱼腥藻中所用方法相同。把基因组DNA(约100μg)以Sau 3AI部分酶解，并按照“MolecularCloning，2rd edition，pp.2.85-2.87(Sambrook，J.等，eds.，ColdSpring Harbor Laboratory，1987)所述进行蔗糖密度梯度离心收集长度约为9-23kbp的DNA片段。把所得DNA片段克隆到用BamHI及HindIII切割后的Lambda噬菌体载体λDASH II(Stratagene)然后包装成为噬菌体颗粒以产生构巢组囊藻基因组文库。取大肠杆菌p2392用噬菌体(文库)感染后在直径约为15cm含有NZYM-琼脂的平板上培养。共形成100,000个噬菌斑，然后将它们印迹至尼龙膜上(Hybond-N+；Amersham)。同上面Sonthem分析方法一样，des 9 var片段仍用〔α-32P〕dCTP标记并与所得尼龙膜反应，用放射自显影检测阳性噬菌斑，最终筛选出30个有不同信号强度的噬菌体克隆，从中选出12个克隆。用常规方法从每个克隆中提取噬菌体DNA。所得DNA用几种限制性内切酶切割后在0.8％琼脂糖凝胶上电泳分离，随后印迹至尼龙膜上。该尼龙膜用上述筛选过程中的Southern印迹技术在相同的条件下进行分析，并比较与探针杂交的DNA片段的长度与信号强度。结果是λ5及λ15这两个克隆显示最强的信号。因为这两个克隆已被插入DNA片段长度为11和15kbp，据估算可认为它们的长度足能包含预期ORF的整个片段。插入这两个克隆的每个DNA用几种限制性内切酶切割后作Southern印迹分析。结果显示以XhoI切割的两个克隆的DNA所产生的片段中均有约5kbp片段杂交带。把这个片段的DNA亚克隆进入pBluescript SK-(Stratagene)XhoI位点，产生含有源于λ5及λ15DNA片段的质粒p5X及p15X。制作了p5X及p15X的详细酶切图谱并加以比较。该图表明p5X及p15X含有同样的基因组DNA片段(见图3显示的λ5及λ15中插入DNA的相关性，矩形阴影部分表示在筛选中与des 9 var探针杂交的DNA片段。粗箭头表示des 9 nid(下面将要提到)区域及正义链的方向。细箭头表示带有des 9 nid区域的测序方向。5kbp、1.25kbp及0.5kbp的线条是左边图的尺寸标记。限制性内切酶的缩写意义如下B，BamHI；H，HindIII；N，NotI；Hp，HpaI；RI，EcoRI；RV，EcoRV；S，SalI；P，PstI；X，XhoI)。
用限制性内切酶或ExoIII从p15X制备缺失质粒，约有2kbp的DNA片段的碱基顺序含有与能与des 9 var杂交区域，它的顺序由荧光DNA测序仪测定(见图3)。从结果估计这个片段包含834bp(des 9 nid)的ORF，它编码278个氨基酸(SEQ ID No4)。这个氨基酸序列与前面从多变鱼腥藻克隆的des 9 var片段编码的相应氨基酸序列(SEQ ID No2)有80％同源性。运用核酸及氨基酸序列分析软件GENETYX(Software Development)及EMBL和DDBJ的核酸及氨基酸序列资料库检索高度同源氨基酸序列。插索结果显示des 9 nid与小鼠硬脂酰-辅酶A去饱和酶有30％的一般同源性，但其部分区域则与小鼠去饱和酶有极高的同源性(见图4显示的des 9 nid与小鼠硬脂酰-辅酶A去饱和酶氨基酸序列比较结果)，这暗示所得的des 9 nid应能编码一个使饱和脂肪酸去饱和的酶。
〔实例3〕测定des 9 nid基因在大肠杆菌中表达的活性构巢组囊藻(Anacystis nidulans)去饱和酶只具有Δ9去饱和酶活性或者说它具有在Δ9位使脂相连的饱和脂肪酸去饱和的能力(Bishop，D.G.等，Plant Cell Physiol.，271593，1986)。因此，尝试在大肠杆菌中表达des 9 nid编码的多肽并测量它的活性。
因为由p15X直接表达较困难，故构建了在大肠杆菌中表达的载体。具体地说，选择pET3a(Novagen)作为载体并将des 9 nid克隆进入它的NdeI及BamHI位点之间，这样通过如下的步骤处理就不用在des 9 nid编码的氨基末端加上额外的氨基酸为了刚好在des 9 nid编码蛋白质的C末端下游加上一个BamHI位点，以包括碳末端在它们之间的两个碱基序列进行聚合酶链式反应。具体地说以p15X作为模板，用下面的两个引物完成PCR，得到约140bp的产物。正义引物5’-ACGTCATGGCCTGCAGT(下划线处为PstI位点)(SEQ ID No9)反义引物5’-CGCGGATCCTTAGTTGTTTGGAGACG(下划单线为BamHI位点，下划双线为终止密码子)(SEQ ID No10)把产物亚克隆到pUC19的SmaI位点并验证碱基序列的正确性。这样在所得质粒的BamHI位点下游又产生一个EcoRI位点。随后该质粒用EcoRI及PstI切割。同时p15X也用同样的限制性内切酶从而在终止密码子下游引入一个BamHI位点。质粒再以SalI切割，然后在四种脱氧核苷酸存在情况下用DNA聚合酶Klenow片段进行填充反应(fill-in reaction)，随后用HindIII切割。把由下面两个人工合成的DNA片段组成的接头插入到所得的质粒上，从而在氨基末端引入一个NdeI位点。接头是下列两种DNA等摩尔量的混合物。5’-CATATGACCCTTGCTATCCGACCCA(下面划线处为NdeI位点)(SEQ ID No11)和5’-AGCTTGGGTCGGATAGCAAGGGTCATATG(下划单线为NdeI位点，下划双线为HindIII位点部分)(SEQ ID No12)。
把所得质粒(p Des 9 Nde)导入到感受态的大肠杆菌菌株BL21(DE3)(Novagen)细胞中，这些感受态细胞可通过常规方法制备(Molecular Cloning，pp.250-251，1982)。转化的BLDESI菌株可通过选择氨苄青霉素抗性获得。
把BLDS1菌株及含有pET3a的BL21菌株(BL1)接种到100ml M9培养基(M9含有200μg/ml氨苄青霉素，4mg/ml葡萄糖10μMFecCl3，0.5μg/ml维生素B1，1mg/ml酪蛋白水解产物)中在37℃培养。该继续培养直至培养液混浊度在波长600mM达到0.5 O.D.为止，在培养液中加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为lmM。把细胞继续培养1小时以诱导Δ9去饱和酶的表达。收集大肠杆菌沉淀并用1.2％ NaCl清洗，随后提取脂类。采用Blight和Dyer(Can J.Biochem.Physiol.，37911，1959)的方法提取脂类，将脂类置完全密闭的容器中在85℃与5％盐酸甲醇溶液(2.5ml)反应2.5小时以产生甲基化的脂肪酸。产物脂肪酸甲基酯用己烷(2.5ml)抽提4次后用氮气除去溶剂使之浓缩。用气相色谱分析脂肪酸甲基酯。与标准脂肪酸甲基酯的保留时间的比较鉴别相应的脂肪酸。采用Chromatopack C-RTA Plus(Shimadzu Corp.)进行定量分析。结果如下面表1。表1.大肠杆菌中脂肪酸组成菌株 16∶0 16∶1 18∶1Δ11 其它BL1(0小时) 47 20 29 4BL1(1小时) 50 17 29 4BLDES1(0小时) 44 22 30 4BLDES1(1小时) 40 28 28 4表中小时表示用IPTG诱导蛋白质的时间结果显示BLDES1菌株中16∶1含量上升，表明本发明的基因有去饱和16∶0的活性。
上述两种菌株在补充有0.1M硬脂酸的M9培养基中生长并按上述相同方式进行比较。与BL菌株不同，BLDES1不仅产生16∶1，也能产生18∶1Δ9。这表明由des 9 nid基因编码多肽既能以16∶0也能以18∶0为底物产生不饱和脂肪酸。
〔实例4〕des 9 nid基因导入烟草植株来自构巢组囊藻的des 9nid基因按如下方法整合进入烟草植株(1)植物中表达的载体质粒的构建把质粒pDes9Nde用SacI及SalI切割以产生一个保存在两个限制性内切酶酶切位点之间的des 9 nid基因片段。用HindIII及SphI从带有豌豆RubisCo基因(Schreicher等，EMBO J.4，25(1985))的pSNIP 9克隆中切下叶绿体转运序列，并把其克隆进入用相同限制性内切酶切割的pUC118质粒中，从而生成在转运序列下游含有多克隆位点的pTRA3质粒。这个质粒的HindIII位点用Klenow酶切开和填平，接着插入一个XbaI连接物(linker)(pTRA3X)。质粒pTRA3X用SalI及SacI双酶切并插入经同样双酶切得到的des 9 nid基因片段(pTRA3Xdes9)。在pTRA3Xdes9质粒中，des 9 nid基因随着RubisCo的转运序列将会在同一阅读框架里被翻译。该质粒用SacI及XbaI双酶切后插入到下列的植物载体中。植物表达型双元载体pBI 121(Clonetech)用SacI及XbaI双酶裂解以产生β-葡萄糖醛酸酶(β-glucuronidase)基因的质粒pBI(-GUS)。把上面制备的转移基因插入质粒pBI(-GUS)中花椰菜花叶病毒35S启动子及胭脂碱合成酶(NOS)终止子之间以构成导入植株的载体(pBI 121(-GUS)Rbsc-des9)。(2)将pBI 121(-GUS)Rbsc-des导入农杆菌把根癌农杆菌LBA4404(Clonetech)接种于50ml YEB培养基(每升中含5g牛肉浸膏，1g酵母提取物，1g蛋白胨和5g蔗糖，2mM MgSO4(pH 7.4))中置28℃培养24小时。把经过培养的溶液在4℃，3000rpm离心20分钟以收集细胞。细胞用10ml 1mM Hepes-KOH(pH 7.4)清洗3次再以3ml 10％甘油清洗。然后把这些细胞用3ml 10％甘油悬浮而制成为导入DNA的农杆菌细胞。
由此制备的细胞溶液(50μl)及质粒pBI 121(-GUS)Rbsc-des9(1μg)放置在小池中并用电穿孔仪器基因脉冲发生仪(GenePulser)(BioRad)，在25μf，2500V，200Ω条件下进行电脉冲处理从而将质粒DNA导入农杆菌中。把细胞溶液转移至Eppendorf离心管中并加入800μl的SOC培养基(每升含20g胰蛋白胨，5g酵母提取物和0.5g NaCl，补充2.5mM KCl，10mM MgSO4，10mM MgCl2和20mM葡萄糖(pH 7.0)。细胞在28℃静置培养1.5小时。培养液(50μl)接种至补充有100ppm卡那霉素的YEB琼脂培养基(琼脂浓度1.2％)中在28℃培养2天。
从所产生的菌落中挑选分隔良好的菌落并从挑选得的菌落通过碱法制备质粒DNA。此质粒DNA以适当的限制性内切酶进行酶解。所产生的DNA片段用在1％琼脂糖凝胶上电泳进行分离并以32P-标记的des 9 nid基因片段作探针作Southarn印迹分析；从而证明农杆菌细胞中含有质粒pBI 121(-GUS)Rbsc-des9。此根癌农杆菌细胞缩写为“ALBBSDES”。(3)烟草的转化把ALBBSDES细胞株在加有50ppm卡那霉素的LB液体培养基中置28℃振荡培养2小时。取培养液(1.5ml)在10,000rpm离心3分钟收集细胞。然后用1ml LB培养液清洗细胞以去除卡那霉素。另外也可把细胞液在10,000rpm离心3分钟收集细胞。然后用1.5ml LB培养液重新悬浮细胞以制备成感染用细胞液。
为感染烟草，取其幼叶在0.5％次氯酸钠水溶液中浸10分钟。随后以灭菌水清洗叶片3次再以灭菌滤纸擦拭以准备待感染的叶片标本。叶片用无菌手术以刀切成每个为1cm2的小片。把这些小片置于农杆菌的溶液中并使其背面朝上，温和振荡2分钟。然后把小叶片放置于灭菌过的滤纸上以除去过剩的农杆菌。将Whatman No.1滤纸(φ7.0cm)置MS-B5培养基(含有1.0ppm苄基腺嘌呤0.1ppm及0.8％琼脂)平板上(Murashige，T.and Skoog，F.Plant Physiol.，15473(1962))，并将叶子标本的每一小片背面朝上放在滤纸上。该平板用封口膜密封后，叶片在25℃下以16小时光照、8小时黑暗的周期培养2天。随后，把叶片转移到补充有250ppm calforan及100ppm卡那霉素的MS-B5培养基上并在相同的条件下培养以去除农杆菌。另外，可把叶片放置在平板底部补充有250ppm Calforan和100ppm卡那霉素的MS-B5培养基中并在相同条件下培养7天。同时，叶片周边形成愈伤组织并且小芽生长开始。再培养另外的10天后，把伸展的芽放置在补充有250 calforan及100rpm卡那霉素的MS-HF培养基(无苄基腺嘌呤和萘乙酸的MS-B5培养基)。培养10天后，选择生根的芽枝作为卡那霉素耐受的转化体并移栽至盛有并补充250ppm calforan的MS-HF培养基的植物盆中。
〔实例5〕转化的烟草基因组的Southern及Northern分析由卡那霉素耐受的烟草中提取DNA并通过Southern及Northern印迹技术验证预期基因的导入及表达。基因组DNA的提取方法依照手册(Rogers，S.O.& Bendich，A.J.Plant Molecular Biology ManualA6；1(1988))中的CTAB方法进行。简述如下，取烟草叶(2g)在液氮中研磨，并以CTAB提取缓冲液提取基因组DNA。把DNA(10μg)用EcoRI及XbaI酶解后在0.7％琼脂糖凝胶上电泳，用0.4N NaOH使分离的DNA片段印迹至尼龙膜上(Hybond N+；Amersham)来源自质粒pTRA3Xdes9的含有去饱和酶基因的转运序列为探针与该该膜在65℃杂交16小时，以此证明预期基因导入烟草基因组中。
由烟草叶(约2g)中提取RNA并分析确证转基因的表达。这些步骤包括用硫氰酸胍提取poly(A)+RNA(Nagy，F.等，PlantMolecular Biology Manual B4；1(1988))并在含甲醛琼脂糖凝胶中电泳。把RNA印迹至尼龙膜(Hybond N+；Amersham)并与上述Southern印迹方法的同样条件下进行杂交分析。在RNA量表达不同的转化体中选RNA表达含量最高的进行分析脂肪酸。
〔实例6〕转化的烟草植株中脂类的脂肪酸分析在实例5中经验证有高RNA表达的烟草转化植株以及pBI 121转化的对照烟草植株，按如下的方法提取它们叶中的磷脂酰甘油PG及硫代异鼠李糖基二酰基甘油(SQDG)等脂类。分析它们的脂肪酸组成。至于部分转化体及非转化体的根内脂类也加以分析。(1)总脂类的提取脂类的提取采用Bligh-Dyer方法(Can.J.Biochem.Physiol.，37911，1959)。取2g鲜重叶(或当根部分作样品时取1g)以刀切碎并加20ml氯仿/甲醇(1∶2，体积比)。用匀浆器打碎叶片并静置15分钟。把氯仿(12ml)及蒸馏水(12ml)加至打碎的叶片中并剧烈振荡。该混合物在4℃，3,000rpm下离心30分钟以分离水层及有机层。收集有机层(下层)后加入适量的乙醇。溶剂在旋转蒸发器中30℃减压蒸发。残留物用2ml氯仿/甲醇(1∶4，体积比)溶解以制备总脂类提取物。部分该总脂提取物以5％盐酸甲醇溶液按下面方法处理以生成甲基化脂肪酸。(2)脂类的分级分离取2.5ml DEAE-Toyopearl 650C(TOSOH)悬浮液与25ml lM醋酸钠水溶液(pH 7.0)混合以制备其醋酸型。所得悬浮液依次用蒸馏水、甲醇清洗并在甲醇中悬浮。把该悬浮液装柱(内径1.5cm)中使其高度达1.5cm并以50ml氯仿/甲醇(1∶4，体积比)清洗。
随后，将脂类总提取物上柱。用50ml氯仿/甲醇(1∶4，体积比)洗脱甘油(MGDG)、双半乳糖双酰甘油(DGDG)、磷脂酰乙醇胺(PE)及磷脂酰胆碱(PC)以制备中性脂(MGDG，DGDG，PE，PC)部分。然后用5ml乙酸洗脱出磷脂酰丝氨酸(PS)，并再用20ml氯仿/甲醇(1∶4，体积比)洗去醋酸。而含有PG，SPDG及磷脂酰肌醇(PI)的部分则可由50ml氯仿、甲醇、10M乙酸铵(20∶80∶0.2，体积比)溶液抽提获得。该分级部分抽提液中加入乙醇(15ml)后溶剂经在减压下蒸发尽。把残留物在0.2ml氯仿/甲醇(2∶1，体积比)中溶液以制备酸性脂类部分(PG、SQDG及PI)。
MGDG、DGDG、PE及PC通过硅酸柱层析(Iatrobeads，IatoronLaboratories Inc.)作进一步分级分离。更准确地说，把样品溶于氯仿(1ml)并上样至用氯仿平衡的柱，依次用氯仿/丙酮(4∶1)、丙酮及甲醇洗脱，凭此，用丙酮把糖脂(MGDG、DGDG)洗脱而用甲醇把磷脂(PC及PE)洗脱下来。(3)用薄层层析(TLC)分离纯化PG及脂肪酸分析由步骤(2)所得各分部液在硅胶-TLC板#5721(Merck)上分离。分离酸性脂类以氯仿/丙酮/甲醇/醋酸/水(50∶20∶10∶15∶5，体积比)作为展层液，而分离中性脂类则以氯仿/甲醇/水(70∶21∶3，体积比)作为展层液。通过TLC分离后，喷上樱草灵(primulin)(溶于丙酮的80％溶液)使在紫外光下产生荧光。通过与标准脂类比较迁移率来判断脂类分部液中的各类脂分。产生荧光的脂类与硅胶共同刮下后置有螺旋帽的试管中。当判断脂类的脂肪酸组成时，脂中加入3ml 5％盐酸甲醇溶液然后使该混合物在完全密闭状态下于85℃反应2小时以产生甲基化脂肪酸。同时为了检测sn-1及sn-2位置的脂肪酸组成，从刮下硅胶加入5ml氯仿/甲醇(2∶1)混合溶液中收集脂类并使之干燥。在脂中加入1ml 50mM TrisCl(pH 7.2)及0.05％ Triton X-100，混合物剧烈振荡以分散脂类。在该分散液中加入来自特勒麦根霉(Rhizopus delemar)的脂酶(2500U；Boehringer)，并把混合物在37℃保持30分钟使在sn-1位置上选择性释放脂肪酸。在反应产物浓缩后，未反应脂类、溶解脂类及自由脂肪酸通过薄层层析，以氯仿/丙酮/甲醇/醋酸/水(10∶4∶2∶3∶1)作展层剂使之分离开。这些物质从硅胶中回收并如前述方法一样与盐酸甲醇溶液反应以产生甲基化脂肪酸。所得脂肪酸甲基酯用3ml己烷抽提3次后再在减压下蒸发尽溶剂使之浓缩。通过气相色谱分析脂肪酸甲基酯。用与标准脂肪酸甲基酯保留时间相比较鉴定这些脂肪酸。定量分析则通过(Chromatopnck)C-R7A plus(Shimadzu Corp.)进行。关于总脂类、PG及其它代表性脂类的结果分别地展示在表2、表3及表4中。这些表中表示的平均分析数值对照是2个，平均的转化体是2个或3个单独的转化体平均的。表2.叶中总脂类的脂肪酸分析结果植株 16∶0 16∶1 16∶2 16∶3 18∶0 18∶1 18∶2 18∶3 ∑16∶0+18∶0对照植株 17 3 1 4 3 1 9 63 20转化植株 10 12 1 5 1 2 14 56 11表3.PG中脂肪酸分析结果植株 16∶0 16∶1t 16∶1c 18∶0 18∶1 18∶2 18∶3 ∑16∶0+18∶0+16∶1tPG对照植株32 37 0 1 5 10 14 70转化植株 18 37 8 0 10 12 15 55表4.其它脂类中脂肪酸分析结果植株 16∶0 16∶1 16∶2 16∶3 18∶0 18∶1 18∶2 18∶3∑16∶0+18∶0SQDG对照植51 1 0 0 3 2 7 36 54转化植株 36 22 0 0 0 4 9 28 36MGDG对照植株 7 0 1 9 1 2 4 76 8转化植株 3 9 1 10 0 1 5 69 3DGDG对照植物 19 0 0 0 3 1 4 73 22转化植株 9 13 0 1 0 1 5 70 9PC对照植物28 0 0 0 5 1 21 44 33转化植株 19 12 0 0 3 4 40 23 22PE转化植株20 0 0 0 3 1 6 70 23对照植物 18 10 0 0 2 2 31 38 20PI转化植株48 1 0 0 2 1 11 37 50对照植物 44 7 0 0 1 2 18 28 45PG所联接脂肪酸分析结果揭示在表达来自构巢组囊藻脂肪酸去饱和酶转化过的烟草植株中，16∶0(棕榈酸)含量大量下降而顺式16∶1含量则增加，同时18∶0几乎减少为零(在对照中有少量的18∶0)而18∶1则上升。因此，对照烟草植株中饱和脂肪酸含量(16∶0+16∶1反式+18∶0(硬脂酸))为70％而由未饱和酶基因转化的烟草植株中则显著地下降到55％。对PG中sn-1、sn-2位置的相应分析结果表明多于98％的sn-2位置被饱和脂肪酸(16∶0或16∶1顺式)所占有，由导入基因新产生的16∶1则全部出现在sn-1位置。所以，很明显由去饱和酶基因转化的烟草中PG的sn-1位置上饱和脂肪酸含量变得极小。总而言之，在sn-1、sn-2位置上由饱和脂肪酸构成的饱和分子类数量大大减少，从而根据脂类的分子种类组成可判断该烟草植株变成具有明显抗寒冻性表型的植株。
至于其它脂类，如MGDG、DGDG、SQDG、PC、PE和PC等，很明显可见16∶0下降而16∶1则相应上升约10％，18∶0的去饱和程度也有增加。在MGDG和DGDG中，16∶1主要在sn-1位置产生，但在sn-2位置也能检测出少量16∶1。主要在叶绿体上出现MGDG、DGDG、SQDG及PG等脂类的去饱和程度，发现在高等植物叶绿体中表达蓝绿藻构巢组囊藻的去饱和酶也获得极大的提高。这四类存在于构巢组囊藻质膜上的脂类能作为去饱和酶的底物是有很大的可能性。令人奇怪的是PC、PE及PI中棕榈酸及硬脂酸也能发生去饱和，而构巢组囊藻质膜却缺乏这些脂类，但它们在高等植物却主要存在叶绿体外。
在本例中，转化烟草植株的脂类分析证明源自构巢组囊藻的脂肪酸去饱和酶可在诸如转化烟草类高等植物中以极高的效率使几乎所有脂类中16∶0和18∶0发生去饱和。
根内总脂类的脂肪酸分析结果见表5。表5.根内总脂类的脂肪酸分析结果植株16∶0 16∶1 16∶2 16∶3 18∶0 18∶1 18∶2 18∶3 ∑16∶0+18∶0非转化植株26 0 0 0 5 2 47 2131转化植株 17 13 0 0 2 4 58 6 19结果显示源自构巢组囊藻的脂肪酸去饱和酶不仅是能催化叶中16∶0和18∶0的去饱和作用，而且也能对根中的16∶0和18∶0发挥同样作用，这暗示本发明中脂肪酸去饱和酶基因不仅能改善植物抗寒冻性，而且也可能增加不饱和脂肪酸的含量，使得它能在以植物为原材料生产油料产品的工业中得到应用。
〔实例7〕检测转基因烟草植株抗寒冻性通过RNA表达实验及脂类分析实验判定为有希望的转化体自花传粉后收集其下一代的种子。部分种子栽培于添有800ppm小卡那霉素MS-HF培养基中，以16小时光照和8小时黑暗的光照周期在25℃培养2周。选择卡那霉素耐受的幼苗。把这些幼苗移植于植物盒中并再培养4周。以pBI 121质粒转化的植株也按上述步骤重复(对照)。
这些植株在连续光照条件下用4℃低温处理11天，然后置25℃培养2天。结果，在对照植株(以pBI 121转化的植株)可见明显的叶子呈波状及萎黄，而转化植株则无任何损伤。据此可以认为抗寒冻性能够通过引入去饱和酶基因得到改善。工业应用性导入本发明的编码Δ9去饱和酶基因能够赋予植物抗寒冻性，且植株内不饱和脂肪酸含量也能被增加。
序列表SEQ ID NO1的信息长度196碱基对类型核酸链型双链拓扑结构线性分子类型基因组DNA最初来源生物多变鱼腥藻(Anabaena variabilis)藻株IAM M-3序列描述SEQ ID NO1GCT CTG GGG TTG TTG CTG TTA TAT CTA GGC GGG TGG TCT TTT GTG GTC TGGGGA GTT TTC TTT CGC ATC GTT TGG GTT TAC CAC TGT ACT TGG TTG GTA AACAGC GCT ACC CAT AAG TTT GGC TAC CGC ACC TAT GAT GCT GGT GAC AGA TCCACT AAC TGT TGG TGG GTA GCT GTC CTA GTG TTT GGT GAA GGT TSEQ ID NO2的信息长度65氨基酸类型氨基酸拓扑结构线性分子类型肽最初来源生物多变鱼腥藻(Anabaena variabilis)藻株IAM M-3序列描述SEQ ID NO2Ala Leu Gly Leu Leu Leu Leu Tyr Leu Gly Gly Trp Ser Phe Val Val TrpGly Val Phe Phe Arg Ile Val Trp Val Tyr His Cys Thr Trp Leu Val Asn SerAla Thr His Lys Phe Gly Tyr Arg Thr Tyr Asp Ala Gly Asp Arg Ser Thr AsnCys Trp Trp Val Ala Val Leu Val Phe Gly Glu GlySEQ ID NO3的信息长度837碱基对类型核酸链型双链拓扑结构线性分子类型基因组DNA最初来源生物构巢组囊藻(Anacystis nidulans)藻株R2-SPc序列描述SEQ ID NO3ATG ACC CTT GCT ATC CGA CCC AAG CTT GCC TTC AAC TGG CCG ACC GCC CTGTTC ATG GTC GCC ATT CAC ATT GGA GCA CTG TTA GCG TTC CTG CCG GCC AACTTT AAC TGG CCC GCT GTG GGC GTG ATG GTT GCG CTG TAT TAC ATT ACC GGTTGT TTT GGC ATC ACC CTA GGC TGG CAC CGG CTA ATT TCG CAC CGT AGC TTTGAA GTT CCC AAA TGG CTG GAA TAC GTG CTG GTG TTC TGT GGC ACC TTG GCCATG CAG CAC GGC CCG ATC GAA TGG ATC GGT CTG CAC CGC CAC CAT CAC CTCCAC TCT GAC CAA GAT GTC GAT CAC CAC GAC TCC AAC AAG GGT TTC CTC TGGAGT CAC TTC CTG TGG ATG ATC TAC GAA ATT CCG GCC CGT ACG GAA GTA GACAAG TTC ACG CGC GAT ATC GCT GGC GAC CCT GTC TAT CGC TTC TTT AAC AAATAT TTC TTC GGT GTC CAA GTC CTA CTG GGG GTA CTT TTG TAC GCC TGG GGCGAG GCT TGG GTT GGC AAT GGC TGG TCT TTC GTC GTT TGG GGG ATC TTC GCCCGC TTG GTG GTG GTC TAC CAC GTC ACT TGG CTG GTG AAC AGT GCT ACC CACAAG TTT GGC TAC CGC TCC CAT GAG TCT GGC GAC CAG TCC ACC AAC TGC TGGTGG GTT GCC CTT CTG GCC TTT GGT GAA GGC TGG CAC AAC AAC CAC CAC GCCTAC CAG TAC TCG GCA CGT CAT GGC CTG CAG TGG TGG GAA TTT GAC TTG ACTTGG TTG ATC ATC TGC GGC CTG AAG AAG GTG GGT CTG GCT CGC AAG ATC AAAGTG GCG TCT CCA AAC AAC TAASEQ ID NO4的信息长度278氨基酸类型氨基酸拓扑结构线性分子类型肽最初来源生物构巢组囊藻(Anacystis nidulans)藻株R2-SPc序列描述SEQ ID NO4Met Thr Leu Ala Ile Arg Pro Lys Leu Ala Phe Asn Trp Pro Thr Ala Leu PheMet Val Ala Ile His Ile Gly Ala Leu Leu Ala Phe Leu Pro Ala Asn Phe AsnTrp Pro Ala Val Gly Val Met Val Ala Leu Tyr Tyr Ile Thr Gly Cys Phe GlyIle Thr Leu Gly Trp His Arg Leu Ile Ser His Arg Ser Phe Glu Val Pro LysTrp Leu Glu Tyr Val Leu Val Phe Cys Gly Thr Leu Ala Met Gln His Gly ProIle Glu Trp Ile Gly Leu His Arg His His His Leu His Ser Asp Gln Asp ValAsp His His Asp Ser Asn Lys Gly Phe Leu Trp Ser His Phe Leu Trp Met IleTyr Glu Ile Pro Ala Arg Thr Glu Val Asp Lys Phe Thr Arg Asp Ile Ala GlyAsp Pro Val Tyr Arg Phe Phe Asn Lys Tyr Phe Phe Gly Val Gln Val Leu LeuGly Val Leu Leu Tyr Ala Trp Gly Glu Ala Trp Val Gly Asn Gly Trp Ser PheVal Val Trp Gly Ile Phe Ala Arg Leu Val Val Val Tyr His Val Thr Trp LeuVal Asn Ser Ala Thr His Lys Phe Gly Tyr Arg Ser His Glu Ser Gly Asp GlnSer Thr Asn Cys Trp Trp Val Ala Leu Leu Ala Phe Gly Glu Gly Trp His AsnAsn His His Ala Tyr Gln Tyr Ser Ala Arg His Gly Leu Gln Trp Trp Glu PheAsp Leu Thr Trp Leu Ile Ile Cys Gly Leu Lys Lys Val Gly Leu Ala Arg LysIle Lys Val Ala Ser Pro Asn AsnSEQ ID NO5的信息长度18碱基对类型核酸链型单链拓扑结构线性分子类型其它核酸、合成DNA序列描述SEQ ID NO5ATGACAATTG CTACTTCASEQ ID NO6的信息长度15碱基对类型核酸链型单链拓扑结构线性分子类型其它核酸、合成DNA序列描述SEQ ID NO6GCTCTGGGGT TGTTGSEQ ID NO7的信息长度15碱基对类型核酸链型单链拓扑结构线性分子类型其它核酸、合成DNA序列描述SEQ ID NO7CAACAACCCC AGAGCSEQ ID NO8的信息长度18碱基对类型核酸链型双链拓扑结构线性分子类型其它核酸、合成DNA序列描述SEQ ID NO8RTGRTGRTTR TTRTGCCASEQ ID NO9的信息长度17碱基对类型核酸链型单链拓扑结构线性分子类型其它核酸、合成DNA序列描述SEQ ID NO9ACGTCATGGC CTGCAGTSEQ ID NO10的信息长度26碱基对类型核酸链型单链拓扑结构线性分子类型其它核酸、合成DNA序列描述SEQ ID NO10CGCGGATCCT TAGTTGTTTG GAGACGSEQ ID NO11的信息长度25碱基对类型核酸链型单链拓扑结构线性分子类型其它核酸、合成DNA序列描述SEQ ID NO11CATATGACCC TTGCTATCCG ACCCASEQ ID NO12的信息长度29碱基对类型核酸链型单链拓扑结构线性分子类型其它核酸、合成DNA序列描述SEQ ID NO12AGCTTGGGTC GGATAGCAAG GGTCATATG
权利要求
1.一种编码具有在Δ9位置使脂类相连的脂肪酸去饱和活性的蛋白质的基因。
2.权利要求1的基因或含有该基因部分的多核苷酸，其中具有在Δ9位置使脂类相连接的脂肪酸去饱和活性的蛋白质含有基本上展示在SEQ ID NO 4中的氨基酸序列。
3.权利要求1的基因或含有该基因部分的多核苷酸，其中编码具有在Δ9位置使脂类相连的脂肪酸去饱和活性的蛋白质的基因是一种含有SEQ ID NO3的碱基序列的DNA链。
4.一种含有权利要求1-3中任何一项的基因或包括该基因部分的多核苷酸的载体。
5.一种用权利要求1-3中任何一项的基因或包括该基因部分的多核苷酸转化的植物细胞。
6.一种产生植物的方法，该方法是将权利要求5的植物细胞再生成为成熟的植株。
7.一种用权利要求1-3中任何一项的基因或包括该基因部分的多核苷酸转化的一个植物。
全文摘要
编码的蛋白质具有Δ9位置使脂相连的脂肪酸去饱和的活性的基因；含有该基因或包括其基因部分的多核苷酸的载体，由该基因或含有其基因部分的多核苷酸转化的植物细胞；通过植物细胞再生而长成成熟植株的产生植株的方法；以及由该基因或含有其基因部分的多核苷酸转化的植株。
文档编号C12N9/02GK1142853SQ9419503
公开日1997年2月12日 申请日期1994年12月28日 优先权日1993年12月28日
发明者西泽治, 户栗敏博 申请人:麒麟麦酒株式会社