编码植物脂肪酸去饱和酶基因的核酸分子及其使用方法

专利名称：：编码植物脂肪酸去饱和酶基因的核酸分子及其使用方法编码植物脂肪酸去饱和酶基因的核酸分子及其使用方法本发明要求于2004年12月20日递交的美国临时申请60/637531的优先权，此处整体引用作为参考。发明领域此处描述了植物遗传工程领域的发明，包括编码脂肪酸去饱和酶2样(E4D2样)多肽的分离的核酸分子，以提高其农艺、园艺和品质性状，本发明一般性涉及与植物中种子贮存化合物的存在相关的蛋白质的编码核酸序列。更具体而言，本发明涉及脂质代谢调节蛋白质的/^2X2样编码核酸序列，及这些序列在转基因植物中的用途。具体而言，本发明涉及脂质代谢相关化合物的操作方法，以及在植物和种子中提高油水平和改变脂肪酸组成的方法。本发明还涉及应用这些新植物多肽刺激植物生长和/或提高产率和/或种子贮存化合物组成的方法。发明背景对植物进行研究和遗传操作的历史已久，甚至始于格里戈.孟德尔(GregorMendel)的著名研究之前.从提高土豆块茎的淀粉含量到提高或改变油料种子植物如芸苔(canola)和向日葵的脂肪酸含量，在该学科的完善中，科学家们已经实现了对植物特定性状的改良，随着植物油的消费和使用不断增加，对于种子油含量和种子油水平的改良也日益广泛(如T6pfer等，1995，Science268:681-686)。对转基因植物中生物合成路径的操作为分子生物学家及植物生化学家们提供了影响植物代谢从而产生特定的更高价值产品的许多机会.已改变了许多传统油料种子植物和非传统油料种子植物的种子油的产量或组成，传统油料种子植物如大豆(美国专利No.5,955,650)、芸苔(美国专利No.5,955,650)、向日葵(美国专利No.6,084,164)和油菜籽(T6pfer等人，1995,Science268:681-686)，非传统油料种子植物如烟草(Cahoon等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:11184-11188).植物种子油同时含有中性及极性脂质(见表1)。中性脂质主要包括甘油三酯，为种子油体中累积的主要贮存脂质。极性脂质则主要见于种子细胞的多种膜内，如内质网、#^立体膜和细胞膜，中性和极性脂质含有几种常见的脂肪酸(见表2)以及一系列较少见的脂肪酸。膜脂质中脂肪酸的组成受到高度调节，其中仅存在有限几种脂肪酸。另一方面，许多植物物种种子的中性贮存脂质中含有大量的少见脂肪酸(VandeLooF.J.等人，1993，UnusualFattyAcidsinLipidMetabolisminPlants,第91-126页，编辑TSMooreJr.CRCPress;Millar等，2000，TrendsPlantSci.5:95-101)。脂质由脂肪酸合成且其合成可分为两部分原核路径和真核路径(Browse等人，1986，BiochemicalJ.235:25-31;Ohlrogge&Browse,1995，PlantCell7:957-970)。原核路径位于质体中，后者为脂肪酸生物合成的初始位点，通过乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)将乙酰辅酶A转化为丙二酰辅酶A，起始脂肪酸的生物合成。丙二酰辅酶A随后由丙二酰辅酶A:ACP酰基转移酶转移到丙二酰酖基栽体蛋白(ACP)上.P-酮酰基ACP合酶III(KASIII)催化缩合反应，其中将来自乙跣辅酶A的g基团转移到丙二酰ACP上形成3-酮丁酰ACP。在随后系列的缩合、还原以及脱水反应中，ACP辅因子上新生的脂肪酸链通过一步步地添加(缩合)由丙二酰ACP所提供的两个碳原子而得以延长，直至形成16或18碳的饱和脂肪酸链.质体A9酰基ACP去饱和酶将第一个非饱和的双键引入脂肪酸。硫酯酶将脂肪酸从ACP辅因子上切下，而游离脂肪酸被输出到胞质中，在那里作为脂肪酰基辅酶A酯参与真核路径。在该路径中，脂肪酸分别通过甘油-3-磷酸乙酰转移酶和溶血磷脂酸酰基转移酶酯化甘油-3-磷酸的sn-1和sn-2位，产生磷脂酸(PA)。PA是其他极性和中性脂质的前体，其中后者生成于Kennedy路径(Voelker，1996，GeneticEngineering，Setlow编18:111-113;Shanklin&Cahoon,1998，Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.49:611-641;Frentzen，1998，Lipids100:161-166;Millar等人，2000，TrendsPlantSci.5:95-101)。种子中的贮存脂质由糖类衍生的前体合成。植物胞质溶胶中具有完整的糖酵解路径(Plaxton，1996，Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.47:185-214)，且业已表明油菜籽质体中也存在完整的路径(Kang&Rawsthorne,1994，PlantJ.6:795-805)。蔗糖是碳和能源的主要来源，其从叶转移至发育的种子中。在种子贮存期间，蔗糖转化进胞质溶胶，提供代谢前体葡萄糖-6-磷酸和丙酮酸。它们被转运进质体并转化为乙酰辅酶A，作为脂肪酸合成的主要前体。质体中的乙酰辅酶A是脂质生物合成的中心前体。乙酰辅酶A可通过不同的反应在质体中形成，且各反应的确切作用仍在讨论中(Ohlrogge&Browse,1995，PlantCell7:957-970)。然而人们认可大部分乙酰辅酶A来自从细胞质输入质体的葡萄糖-6-磷酸和丙酮酸。蔗糖产生于源器官(叶或光合作用发生的任何地方)并被转运至发育的种子，后者也称为库器官。在发育的种子中，蔗糖是所有贮存化合物即淀粉、脂质和部分种子贮存蛋白质的前体。因此，显然蔗糖在其中起重要作用的糖类代谢对于种子贮存化合物的积累非常重要.贮存化合物如三SL基甘油(种子油)是发芽和幼苗生长时使用的碳和能量储备.种子(植物)油也是人类饮食的重要成分和为化学工业提供原料的有价值的商品。虽然传统植物育种方法可以改变种子油的脂质和脂肪酸含量和/或组成，重组DNA技术的来临使得对植物种子油含量的操作更为简单，某些情况下能通过仅靠育种法不能完成的方法改变种子油(见如T6pfer等人，1995，Science268:681-686)。例如，向转基因烟草中引入A"羟化酶核紗列，导致烟草种子油中引入新脂肪酸蓖麻油酸(VandeLoo等人，1995，Proc.Natl.Acad.SciUSA92:6743-6747)。也通过引入和表达来自茺荽的酰基ACP去饱和酶，遗传改造烟草植物，使之产生低水平的岩芽酸(Cahoon等人，1992，Proc.Natl.Acad.SciUSA89:11184-11188)。改变植物的种子油含量具有重大的医学、营养和经济价值。就医学价值而言，可见于许多种子油的长链脂肪酸(C18及更长)与高胆固醇血症和其他冠心病相关临床疾病的减少相关(Brenner，1976，Adv.Exp.Med.Biol.83:85-101),因此，消耗这些类型脂肪酸水平增高的植物可能会降低心脏疾病的风险。种子油含量的水平增高也增加了种子油的大M^莫生产，从而降低这些油的成本。为了提高或改变植物中化合物如种子油的水平，必须鉴定调节脂质和脂肪酸代谢的核酸序列和蛋白质。如早先所述，已经克隆了若干去饱和酶核酸如^去饱和酶核酸、AU去饱和酶核酸和跣基ACP去饱和酶核酸，并证实其编码多种植物物种中脂肪酸合成必需的酶((Miquel&Browse，inSeedDevelopmentandGermination,Galili等人编，MarcelDekker，NewYork,169-193页，1994;Ohlrogge&Browse,1995，PlantCell7:957-970).还克隆了来自不同物种如芸苔、大豆、胡萝卜、松树和拟南芥Ura6iVto/;as/s^d/Za"a)的油体蛋白(oleosin)核酸序列，并确定其编码与这些植物中油体磷脂单层膜相关的蛋白质。尽管已知若干广泛影响植物和种子发育的化合物，仍明确需要特异地鉴定对于贮存化合物积累的发育调节更为特异的因子以及鉴定能够赋予其宿主植物和其他植物物种油产量改变或提高的基因。本发明涉及的另一问题在于提供使脂肪酸去饱和酶沉默的更有效方法.本发明涉及的另一问题在于特异性修饰种子油的脂肪酸含量。本发明涉及的另一问题在于提高种子油的油酸含量。本发明涉及的另一问题在于降低种子油的亚油酸含量。本发明公开了来自拟南芥、大豆(G/yc/"e附似,、稻(0/^fl做ftVfl)、玉米(附fl^s)、亚麻(ZJ"mwwsi/a^s:si附i/挑X大麦(^oiYitewwvw/g<we)或小麦(7W/i'c"加m幼V"w)的核酸序列。这些核酸序列可用于改变或提高植物中种子贮存化合物如蛋白质、糖和油的水平，所述植物包括转基因植物，例如芸苔、亚麻子、大豆、向日葵、玉米、燕麦、棵麦、大麦、小麦、稻、胡椒、万寿菊、棉花、油椰、椰树、亚麻、蓖麻和花生，它们是含有大量脂质化合物的油料种子植物。发明概述本发明提供了与植物种子贮存化合物代谢相关的新的分离的核酸和氨基酸序列，具体而言涉及i^Z)2样序列。本发明的另一主题为包含选自如下的M酸序列的分离的多肽a.XWmUxSx^XWYL,其中Xt不为M，且X3不为T，且X7不为FV，b.gx"x"x"x"x"x"x"x"hx"x2。px"x22x"x24x2Wx28er，其中X"不为G,且X20不为F，且X"X22不为NA，c.HX29X3°PX31X32X33X34X3SX36X37X38ER，其中X^不为F，且X"X32不为NA，d.LX39X4flX41X42X43X44X4SGX46X47X48X49X50X51XS2YXS3XS4P，其中X41不为Y，且X"不为Q，且X"不为S，且X"不为M，且X^不为I，e.TXSSXS6XS7XS8HXS9X60X"X62X"X64X6SX66X67X68X69X7。X"T，其中X"不为N，f.PX72X73X74X7SX76X77X78X79X80X81X82X83X84X8sX86，其中X84X85X86不为WYV,且其中若无上述其他限定，x可代表任何氨基酸.优选利用VectorNTISuite9.0的AlignX(2003年8月22日)生成确定权利要求1中共有肽序列a至f的序列比对。用于多重比对的M优选如下空位开放罚分10;空位衍生罚分0.05;空位分离(s印aration)罚分范围8;比对延迟(delay)的同一性百分比40。在本发明优选实施方案中，要求包含选自如下的JLA^^列的分离的多肽a.AWYPYX87YX88NPX89GRLVHIX90VQLTLGWPLYLAX91NX92SGRPYPRFACHFDPYGPIYNDRER，b.FISDVGV,c.ALX"KLX外SX"FGFWWVVRVYGVP，d.ILGEYYQFDX96TPVAKAT，且其中X代表任意氨基酸。优选利用VectorNTISuite9.0的AlignX(2003年8月22日)生成确定权利要求2中共有肽序列a至d的序列比对。用于多重比对的M优选如下空位开放罚分10;空位延伸罚分0.05;空位分离罚分范围8;比对延迟的同一性百分比40。本发明分离的多肽可包括l个、2个、3个、4个、5个或6个权利要求l的M酸序列.本发明分离的多肽可包括l个、2个、3个或4个权利要求2的^^酸序列.若权利要求1中未另行指定，X可代表任意氨基酸，特别是G、A、V、L、I、F、Y、W、P、D、E、N、Q、S、T、C、M、K、R、H。^不为M。在优选实施方案中W为选自G、A、V、L、I、F、Y、W、P、D、E、N、Q、S、T、C、K、R和H的氩基酸，在更优选的实施方案中选自F、T和H，而在甚至更优选的实施方案中为H。乂3不为T。在优选实施方案中乂3为选自G、A、V、L、I、F、Y、W、P、D、E、N、Q、S、C、M、K、R和H的氨基酸，在更优选的实施方案中选自L、A、V、F，而在甚至更优选的实施方案中为V或F。乂6不为F且X"不为V。在优选实施方案中乂6和乂7为分别独立选自G、A、L、I、Y、W、P、D、E、N、Q、S、T、C、M、K、R和H的氨基酸，在更优选的实施方案中分别独立选自P、L和T，而在甚至更优选的实施方案中XS为P或L,而X"为L或T，而在更优选的实施方案中乂6为L而X7为T。X"不为G。在优选实施方案中X"为空白或选自A、V、L、I、F、Y、W、P、D、E、N、Q、S、T、C、M、K、R和H的M酸，在更优选的实施方案中X"为R或空白，更优选的XS为R。空白是指该位点上没有氨基酸。X"不为F。在优选实施方案中X^为选自G、A、V、L、I、Y、W、P、D、E、N、Q、S、T、C、M、K、R和H的^J^酸，在更优选的实施方案中为N或D，而在甚至更优选的实施方案中为D。X21不为N且X"不为A。在优选实施方案中X"和X"为分别独立选自G、V、L、I、F、Y、W、P、D、E、Q、S、T、C、M、K、R和H的氩基酸。在更优选的实施方案中分别独立选自D、Y、H、S、G、I。在甚至更优选的实施方案中X"为D、Y或H，更优选Y,而X"为S或G,更优选G。X邓不为F。在优选实施方案中X邓为选自G、A、V、L、I、Y、W、P、D、E、N、Q、S、T、C、M、K、R和H的氨基酸，在更优选的实施方案中X"为N或D，而在甚至更优选的实施方案中X"为D。X"不为N且X"不为A。在优选实施方案中X"和X"为分别独立选自G、V、L、I、F、Y、W、P、D、E、Q、S、T、C、M、K、R和H的氨基酸，在更优选的实施方案中分别独立选自D、Y、H、S、G.在甚至更优选的实施方案中X"为D、Y或H,更优选Y，而X"为S或G，更优选G。X"不为Y。在优选实施方案中X"为选自G、A、V、L、I、F、W、P、D、E、N、Q、S、T、C、M、K、R和H的氨基酸，在更优选的实施方案中X"为L。X必不为Q。在优选实施方案中X"为选自G、A、V、L、I、F、Y、W、P、D、E、N、S、T、C、M、K、R和H的絲酸，在更优选的实施方案中选自M、K和F，而在甚至更优选的实施方案中X"为F。X"不为S，且X"不为M且X^不为I。在优选实施方案中X48、X49和X幼为分别独立选自G、A、V、L、F、Y、W、P、D、E、N、Q、T、C、K、R和H的氨基酸，在更优选的实施方案中分别独立选自Q、W、L和V。在甚至更优选的实施方案中X"为Q或W，更优选X"为W，而X49、X^分别独立选自L或V，更优选X49、乂5()分别独立选自V.X"不为N。在优选实施方案中X"为选自G、A、V、L、I、F、Y、W、P、D、E、Q、S、T、C、M、K、R和H的絲酸，在更优选的实施方案中X67为H或R，而在甚至更优选的实施方案中X67为H。乂84不为W，且XM不为Y且X"不为V。在优选实施方案中X84、X85和X86为分别独立选自G、A、L、I、F、P、D、E、N、Q、S、T、C、M、K、R和H的氨基酸，在更优选的实施方案中X"XS5XM分别独立选自S、F、V、P、M、A、L、K和G，而在甚至更优选的实施方案中X84X85X86为VAK。本发明也提供了编码含有上述(权利要求1或权利要求2中)氨基酸序列的蛋白质的分离的核^f列，以及由(权利要求3中)此类核^f列编码的分离的多肽。在本发明的另一实施方案中，上述(权利要求1或权利要求2中)分离的多肽作为种子贮存化合物的调节物在微生物或植物中发挥作用。在本发明的另一实施方案中，上述(权利要求1或权利要求2中)分离的多肽用于提高转基因植物中的油酸水平，相对该植物野生型品种提高1重量％、2.5重量％、5重量％、7.5重量％、10重量％、12.5重量％、15重量％、17.5重量％、20重量％、22.5重量％、25重量％或更多。在优选实施方案中，上述(权利要求1或权利要求2中)分离的多肽具有如SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34或SEQIDNO:36中所公开的多肽序列。在更优选的实施方案中，上述(权利要求1或权利要求2中)分离的多肽选自a.如SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34或SEQIDNO:36中所公开的多肽序列b.由如SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35中公开的多核苷酸序列所编码的多肽序列；c.与上述a)或b)中多肽具有至少70%序列同一性的多肽序列。本发明还提供包含选自如下的多核苷酸序列的分离的核酸a.如SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35中所公开的多核b.编码如SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34或SEQIDNO:36中所公开的多肽的多核苷酸序列；c.与上述a)或b)中核酸具有至少70%序列同一性的多核苷酸序列；d.与上述a)或b)中核酸互补的多核苷酸序列；以及e.在严紧条件下与上述a)或b)中核酸杂交的多核苷酸.本发明还提供选自如下的分离的多肽a.如SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35中公开的多核苷酸序列所编码的多肽序列；b.如SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34或SEQIDNO:36中所公开的多肽序列；c.与上述a)或b)中多肽具有至少70%序列同一性的多肽序列。本发明也提供了来自拟南芥、大豆、稻、玉米、亚麻、大麦或小麦的分离的编码脂质代谢蛋白(LMP)或其部分的核酸。这些序列可用于改变或提高微生物及植物中脂质和脂肪酸、辅因子和酶，例如提高油酸水平1重量％、2.5重量％、5重量％、7.5重量％、10重量％、12.5重量％、15重量％、17.5重量％、20重量％、22.5重量％、25重量％或更高。已知拟南芥植物中产生大量的脂肪酸如亚油酸和亚麻酸(参见例如表2)，并且它们与芸苔属(Brassica)油料作物植物在许多方面(基因同源性等)非常近似。因此，来自植物如拟南芥、欧洲油菜(丑/YIM/Cfl/lfl/Wtf)、大豆、稻、玉米、亚麻、大麦或小麦或相关生物的核酸分子特别适合于改变宿主特别是微生物和植物中的脂质和脂肪酸代谢。另外，来自植物拟南芥、欧洲油菜、大豆、稻、玉米、亚麻、大麦或小麦或相关生物的核酸可用于鉴定其他物种中的那些DNA序列和酶，这些DNA序列和酶可用于改变相应生物中脂肪酸前体分子的生物合成.本发明还提供了分离的核酸，其包含来自植物(拟南芥、大豆、稻、玉米、亚麻、大麦或小麦)的编码LMP或其部分的核酸的至少15个核普酸的片段.本发明还提供了所述核酸编码的多肽，包含由所述核酸编码的多肽的异源多肽以及这些多肽的抗体。另外，本发明涉及并提供了LMP核酸产生转基因植物的用途，所述转基因植物种子贮存化合物的水平或组成发生改变。至于改变的组成，本发明可用于如提高油酸相对于其他植物油(如亚麻酸或亚油酸)的百分比，如提高1重量％、2.5重量％、5重量％、7.5重量％、10重量％、12.5重量％、15重量％、17.5重量％、20重量％、22.5重量％、25重量°/。或更高。产生种子贮存化合物水平或组成发生改变的转基因植物的方法包括用含有LMP核酸的表达载体转化植物细胞，并从植物细胞产生种子贮存化合物水平或组成发生改变的植物的步骤。在优选的实施方案中，植物为产油物种，例如选自芸苔、亚麻子、大豆、向日葵、玉米、燕麦、棵麦、大麦、小麦、稻、胡椒、万寿菊、棉花、油椰、椰树、亚麻、蓖麻和花生。根据本发明，本文描述的组合物和方法可用于改变转基因植物的LMP组成，以及提高或降低转基因植物的LMP水平，包括增加或减少该植物中LMP核酸的表达。可以通过转基因过表达、共抑制方法、反义抑制方法或LMP核酸的体内诱变来增加或减少LMP核酸的表达。本发明也可用于提高或降低种子油中的脂质水平(如1重量％、2.5重量％、5重量％、7.5重量％、10重量％、12.5重量％、15重量％、17.5重量％、20重量％、22.5重量％、25重量％或更多)、提高或降低种子油中的脂肪酸水平(如l重量％、2.5重量％、5重量％、7.5重量％、10重量％、12.5重量％、15重量％、17.5重量％、20重量％、22.5重量％、25重量％或更多)，或提高或降低种子或植物中的淀粉水平(如1重量％、2.5重量％、5重量％、7.5重量％、10重量％、12.5重量％、15重量％、17.5重量％、20重量％、22.5重量％、25重量％或更多)。微RNA(miRNA)是进化保守的植物和动物基因表达的基于RNA的调节物。MiRNA(21至25nt)来自较大的具有茎环结构的前体，所述前体由非蛋白质编码基因转录而来。miRNA寻靶特定的mRNA，在转录后水平(即降解mRNA)或翻译水平(即抑制蛋白质合成)上抑制基因表达(BartelD2004，Cell116，281-297)。可以设计微RNA前体(前miRNA)，使由前miRNA编码的内源性miRNA能被某miRNA取代，以寻靶目的基因如dsRed报告基因。本发明还提供了产生转基因植物的方法，所述转基因植物的油酸水平与其野生型相比提高，所述方法包括，a.第一步用RNA前体构建体转化植物细胞，且b.第二步从该植物细胞产生转基因植物，其中所述构建体含有在植物细胞中驱动表达的启动子，该启动子有效连于编码前体微RNA序列的核苷酸序列，其中编码所述微RNA前体序列的核苷酸序列选自a.如SEQIDNO:47所示的核苷酸序列b.与上述a)中核酸具有至少70%序列同一性的多核苷酸序列；c.与上述a)中核酸互补的多核苷酸序列；以及d.在严紧条件下与上述a)中核酸杂交的多核苷酸序列。编码脂肪酸去饱和酶的玉米基因表达于许多组织包括种子中。与玉米去饱和酶mRNA的编码区或5，UTR和3，UTR互补的19至21nt(如SEQIDNO:40所述的ACCAGACCCCGAACGCCGC),可用于取代如SEQIDNO:37描述的ZmmiR166(5，tcggaccaggcttcattcccc3，)，以及SEQIDNO:38的ZmmiR166前体.该转基因随后可转化入玉米。遗传改造的ZmmiR166基因的表达可受玉米种子特异性启动子(例如胚乳特异性IOKD玉米醇溶蛋白启动子或Globl胚特异性启动子)的控制.微RNA(例如SEQIDNO:40所述的ACCAGACCCCGAACGCCGC)一般在加工遗传改造的Zmm股166前体时在种子中产生。该miRNA可特异性结合于玉米脂肪酸去饱和酶mRNA中与该miRNA互补的区域，从而通过基因沉默机器在转录或翻译水平导致种子中所靶向的玉米去饱和酶的表达下降。因此，转基因植物优选玉米能够具有期望的脂肪酸水平和组成，例如种子中低亚油酸和/或中或高油酸重量百分比。本发明还提供了通过产生油酸水平相对于野生型提高的转基因植物，改变、优选降^f氐脂肪酸去饱和酶表达的方法，所述脂肪酸去饱和酶尤其是由FAD2直向同源物编码，更优选由附录A中核酸编码，在优选实施方案中如SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35所述，该方法包括a.第一步用RNA前体构建体转化植物细胞，且b.第二步从该植物细胞产生转基因植物，其中所述构建体含有在植物细胞中驱动表达的启动子，该启动子有效连于编码前体微RNA序列的核苷酸序列，其中编码所述微RNA前体序列的核苷酸序列选自a.如SEQIDNO:47所示的核苷酸序列b.与上述a)中核酸具有至少70%序列同一性的多核苷酸序列；c.与上述a)中核酸互补的多核苷酸序列；以及d.在严紧条件下与上述a)中核酸杂交的多核苷酸序列。在优选实施方案中，设计编码前体微RNA序列的核苷酸序列，使编码SEQIDNO:37所示微RNA的核苷酸序列被编码SEQIDNO:40所示微RNA的核苷酸序列所取代。，设计的微RNA前体和微RNA在调节基因表达中的用途众所周知，叙述于如US2004/0268441中，后者在此处整体引用。设计的微RNA前体可用于调节一个或数个乾基因的表达，例如1个、2个、3个、4个或5个如SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35所示的核苷紗列。设计的微RNA前体和微RNA在调节基因表达中的用途可与其他本领域技术人员公知的基因工程方法联合使用，启动子可为普遍表达的的或组织特异性的，例如种子特异性和胚乳特异性的。启动子优选为种子特异性启动子，该方法可用于有效提高种子中的油酸水平，如提高1重量％、2.5重量％、5重量％、7.5重量％、10重量％、12.5重量％、15重量％、17.5重量％、20重量％、22.5重量％、25重量％或更多。设计的微RNA前体和微RNA在调节基因表达中的用途可用于各种植物，特别是用于此处所述的植物，在优选实施方案中用于单子叶植物，而在更优选实施方案中用于玉米。本发明的另一目的在于分离的核酸，其含有选自如下的多核苷酸序列a.如SEQIDNO:47所示的核苷酸序列b.与上述a)中核酸具有至少70%序列同一性的多核苷酸序列；c.与上述a)中核酸互补的多核苷酸序列；以及e.在严紧条件下与上述a)中核酸杂交的多核苷酸序列。该核苷酸序列可用于调节目的基因的表达，特别是用于下调靼基因的表达，尤其是用于上述核苷酸序列。本发明的另一目的在于微RNA前体，由选自如下的核苷酸序列编码a.如SEQIDNO:47所示的核苷酸序列b.与上述a)中核酸具有至少70%序列同一性的多核苷酸序列；c.与上述a)中核酸互补的多核苷酸序列；以及d.在严紧条件下与上述a)中核酸杂交的多核苷酸序列。本发明的另一目的在于如SEQIDNO:40所示的微RNA。更具体而言，本发明包括并提供了提高种子中总油含量的方法，包括:用核酸构建体转化植物，所述构建体中含有作为有效连接组分的启动子和能调节i^"2样mRNA或FAD2样蛋白质水平的核酸序列，并种植该植物。此外，本发明包括并提供了提高种子中油酸水平的方法，包括用核酸构建体转化植物，所述构建体中含有作为有效连接组分的启动子、能提高油酸水平的结构核酸序列，并种植该植物.本文也包括由LMPDNA序列转化的转基因植物所产生的种子，其中所述种子含有LMPDNA序列且该植物是用于改变种子j^存化合物水平的真实育种.本发明还包括上述种子产生的种子油，本发明还提供了含有所述核酸的栽体、含有所述载体的宿主细胞，以及用所述核酸和/或载体转化植物细胞所产生的子代植物材料。根据本发明，本文所述的化合物、组合物以及方法可用于提高或降低种子油中的脂质相对百分比，提高或降低种子油中的脂质水平，或提高或降低种子油中的脂肪酸水平，或提高或降低种子或植物中的淀粉或其他糖类水平，或提高或降低种子或植物中的蛋白质水平，例如提高或降低l重量％、2.5重量％、5重量％、7.5重量％、10重量％、12.5重量％、15重量％、17.5重量％、20重量％、22.5重量％、25重量％或更多。本文所述的操作方法也可用于促进种子发芽和幼苗及植物的生长，以及提高植物中种子贮存化合物的产率。还提供了在转基因植物中产生高于或低于正常或一般水平的贮存化合物的方法，所述转基因植物表达来自拟南芥、欧洲油菜、大豆、稻、玉米、亚麻、大麦或小麦的LMP核酸，其中转基因植物为拟南芥、欧洲油菜、大豆、稻、玉米、亚麻、大麦、小麦、向日葵(flW/朋^附朋"附)或甜菜(v"/gw/s)，或与拟南芥、欧洲油菜、大豆、稻、玉米、亚麻、大麦或小麦不同的物种。本文也包括改变种子贮存化合物生产效率的组合物和方法。本文所用短语拟南芥、欧洲油菜、大豆、稻、玉米、亚麻、大麦、小麦、向日葵或甜菜时，也是指拟南芥和/或欧洲油菜和/或大豆和/或稻和/或玉米和/或亚麻和/或大麦和/或小麦和/或向日葵和/或甜菜。因此，本发明的一个目的在于提供来自大豆、稻、玉米、亚麻、大麦或小麦的新的分离的LMP核酸及分离的LMPM酸，以及其活性片段、类似物和直系同源物.这些活性片段、类似物和直系同源物可来自不同的植物物种，因为本领域技术人员应当理解其他植物物种也含有这些或相关核酸。本发明的另一目的在于提供种子贮存化合物水平改变的转基因植物，特别是脂质、脂肪酸或糖水平的改变。本发明的多核苷酸及多肽，包括其激动剂和/或其片段，^具有如下用途，包括调节植物生长，及潜在地调节植物产率，优选提高在逆境*(干旱、寒冷、光、紫外线)下的植物生长.此外，本发明的拮抗剂可能具有包括调节植物生长和/或产率的用途，优选通过提高植物生长和产率来实现。而在另一实施方案中，利用组成型启动子it^达的本发明多肽可用于通过调节光利用效率，提高植物在应激条件(千旱、光、寒冷、紫外线)下的产量。此外，本发明的多核苷酸和多肽能促进种子萌发和种子休眠，从而改善植物生长和/或种子贮存化合物的产率。本发明的分离的核酸分子还含有有效连接的启动子或部分启动子区域。该启动子可为组成型启动子、i秀导型启动子或组织特异性启动子。组成型启动子的实例如超级启动子(Ni等人，PlantJ.7:661-676，1995;US5955646)。组织特异性启动子可以在营养组织或繁殖组织中具有活性。在繁殖组织中具有活性的组织特异性启动子可为种子特异性启动子。在营养组织中具有活性的组织特异性启动子可为根特异性、芽特异性、分生组织特异性或叶特异性启动子。本发明分离的核酸分子还可含有5，非翻译序列、3，非翻译序列、内含子或它们的组合。本发明也提供了提高植物中一种或多种植物器官的数量和/或大小的方法，所J^4达来自拟南芥、欧洲油茱、大豆、稻、玉米、亚麻、大麦或小麦的编码LMP或其部分的分离的核酸.更具体而言，可操作种子大小和/或种子数量和/或重量。本发明的另一目的在于提供生产这类前述转基因植物的方法，本发明的另一目的在于提供这类前述转基因植物的种子和种子油。本领域普通技术人员在阅读以下详迷的公开实施方案和附加权利要求书后，可清楚了解本发明的这些及其他目的、特征和优势。附图简述根据以下详述以及构成本申请一部分的所附图表和序列表，可更充分地理解本发明。图1A-D.SEQIDNO:1-4一拟南芥基因y^E4Z)-W的核酸序列、核酸的开放读框和M酸序列，图2A-C.SEQIDNO:5-8一大豆基因C附F/1D-W的核紗列、核酸的开放读框和^J^酸序列。图3A-C.SEQIDNO:9-12-大豆基因G附E4D-0的核酸序列、核酸的开放读框和氨基酸序列。图4A-C.SEQIDNO:13-16-大豆基因G附/^IM^的核i^f列、核酸的开放读框和氨基酸序列，图5A-C.SEQIDNO:17-20-玉米基因Zw/MZ)-W的核酸序列、核酸的开放读框和氨基酸序列。图6A-C.SEQIDNO:21-24-稻基因Osi^D-W的核紗列、核酸的开放读框和氨基酸序列。图7A-C.SEQIDNO:25-28-亚麻基因Iw7^Z)-W的核酸序列、核酸的开放读框和氨基酸序列。图8A-C.SEQIDNO:29-32-大麦基因Fvi^Z)-W的核紗列、核酸的开放读框和M酸序列。图9A-C.SEQIDNO:33-36-小麦基因Tlii^2)-W的核酸序列、核酸的开放读框和氨基酸序列.图io.由usp启动子驱动且转化入yiw/2拟南芥突变林(该转化林的遗传背景为Columbia-2,每一栏代表用5mg个体植物的群体种子得到的脂肪酸数据)的OsFAD-01得到的T2种子脂肪酸数据。图11.由USP启动子驱动且转化入/似/2拟南芥突变抹(该转化林的遗传背景为Columbia-2，每一栏代表用5mg个体植物的群体种子得到的脂肪酸数据)的HvFAD-01得到的T2种子脂肪酸数据.图12.图示了公开的AtFAD-01、GmFAD-01、GmFAD-02、GmFAD-03、LuFAD-Ol、HvFAD-Ol、TaFAD-Ol、OsFAD-01及ZmFAD-01M酸序列间的相对同源性.该图表是利用VectorNTISuite9.0的AlignX(2003年8月22日)所产生.用于该多重比对的参数如下空位开放罚分10;空位延伸罚分0.05;空位分离罚分范围8;比对延迟的同一性百分比40,图13.表格显示了AtFAD-Ol、GmFAD-Ol、GmFAD-02、GmFAD-03、LuFAD-Ol、HvFAD誦Ol、TaFAD國Ol、OsFAD-01及ZmFAD-01^J^^jf列间的相似性，该表格是利用VectorNTISuite9.0的AlignX(2003年8月22曰)所产生.其他参数参见图12的图例。图14.图示了公开的AtFAD-01、GmFAD-01、GmFAD-02、GmFAD-03、LuFAD-Ol、HvFAD國Ol、TaFAD-Ol、OsFAD-01及ZmFAD-01核酸序列间的相对同源性。该图表是利用VectorNTISuite9.0的AlignX(2003年8月22日)所产生。用于该多重比对的参数如下空位开放罚分15;空位延伸罚分6.66;空位分离罚分范围8;比对延迟的同一性百分比40。图15.表格显示了AtFAD-Ol、GmFAD-Ol、GmFAD-02、GmFAD-03、LuFAD-Ol、HvFAD-Ol、TaFAD-Ol、OsFAD-Ol及ZmFAD-Ol核酸序列间的相似性。该表格是利用VectorNTISuite9.0的AlignX(2003年8月22日)所产生。其他参数参见图14的图例。图16.AtFAD-01、GmFAD-Ol、GmFAD-02、GmFAD-03、LuFAD-Ol、HvFAD-Ol、TaFAD-Ol、OsFAD-Ol及ZmFAD-Ol^J^酸序列的序列比对。该比对是利用VectorNTISuite9.0的AlignX(2003年8月22日)所产生。用于该多重比对的参数如下空位开放罚分15;空位延伸罚分6.66;空位分离罚分范围8;比对延迟的同一性百分比40。一般定义应当认识到本发明并不仅限于此处所述的具体方法、方案、细胞系、植物物种或属、构建体及试剂。也应当认识到本文所用的术语仅为描述具体的实施方案所需，并不在于限制本发明的范围，后者只受附加权利要求书的限制。应当注意到此处及附加权利要求书中所用的单数形式包括复数指代，除非上下文中另有清楚说明.因此，例如提及"栽体"是指一种或多种栽体，并包括本领域技术人员已知的其等效物，等等。本文所用的术语"约"，是指大约、粗略、左右或在此范围内.当术语"约"与数字范围联合使用时，在所列数值边界上下延伸而修饰其范围.一般而言，本文使用术语"约"来修饰数值为所列值的上下波动20%、优选10%、更优选上下(高低)5%。本文所用的词"或"，是指具体列单内的任一成员，并且也包括该列单中成员的任意组合。本文所用的术语"M酸序列"是指代表氨基酸残基的缩写、字母、字或词语的序列。此处可用氨基酸的通用3个字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来指代氨基酸。与之类似，用通用的单字母代码指代核苷酸。本文所用的缩写为常规的氨基酸单字母代码A，丙氨酸；B,天冬酰胺或天冬氨酸；C，半胱氨酸；D天冬氨酸；E，谷氨酸；F，苯丙氨酸；G，甘氨酸；H组氨酸；I异亮氨酸；K,赖氨酸;L,亮氨酸；M，甲硫氨酸；N，天冬酰胺；P，脯氨酸；Q，谷胺酰胺；R，精氨酸；S，丝氨酸；T，苏氨酸；V，缬氨酸；W，色氨酸；Y，酪氨酸;Z，谷胺酰胺或谷氨酸(见L.Stryer，Biochemistry,1988，W.H.FreemanandCompany,NewYork)。此处用于^tj^,列中的字母"x"可以代表任一氨基酸残基。术语"核酸"指单链或双链、正义或反义形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物或杂交物。此次所用的短语"核酸序列"是指代表核苷酸的缩写、字母、字或词语的连续序列.在一个实施方案中，核酸可为相对短核酸的"探针"，通常长度少于100个核苷酸。通常核酸探针的长度为约50个核苷酸至约100个核苷酸。核酸的"靶区"为核酸中鉴定为目标的部分.核酸的"编码区"为核酸的一部分，所述部分当处于合适调控序列的控制下时可通过序列特异性方式转录并翻译，以产生特定的多肽或蛋白质。此编码区被表述为编码此多肽或蛋白质。除非另有说明，除了明确显示的序列之外，特定的核酸序列也隐含地包括其经保守性修饰的变体(例如，筒并密码子取代)及互补序列。此处术语"核酸"可与"基因"、"cDNA"、"mRNA"、"寡核苷酸"和"多核苷酸"交换使用。本文所用的术语"互补"或"互补性"是指通it^配对原则相关的核苷酸序列。例如，序列5，-AGT-3，与序列5，-ACT-3，互补。互补可为"部分"或"全部"互补."部分"互补是指一个或多个核酸威基并未根据^配对原则配对，核酸之间的"全部"或"完全"互补是指每一个核酸g都根据碱基配对原则与另一戚基配对。核酸链间的互补程度对核酸链杂交的效率和强度都有显著影响，本文所用的核酸序列的"互补物"是指其核酸与本发明核酸序列的核酸完全互补的核苷酸序列。术语"基因组"或"基因组DNA"是指宿主生物的可遗传遗传信息。所述基因组DNA包括核DNA(也称为染色体DNA)，也包括质体(例如叶绿体)及其他细胞器(如线粒体)DNA。优选术语基因组或基因组DNA指核染色体DNA。术语"染色体DNA"或"染色体DNA序列"应理解为独立于细胞周期状态的细胞核基因组DNA.因此，染色体DNA可被组织为染色体或染色单体，它们可为压缩或未解旋的形式。可以通过多种本领域已知的方法证实并分析染色体DNA中的插入，例如聚合酶链式反应(PCR)分析、Southern印迹分析、原位荧光杂交(FISH)及原位PCR。术语"野生型"、"天然"或"天然来源"的是指生物、多肽或核^f列，其中所述生物天然存在，或可获自至少一种天然存在的未经人改变、突变或其他操作的生物。术语"异源核酸序列"或"异源DNA"可交换使用，是指连接或经操作后连接于其天然并不连接的核酸序列的核苷酸序列，或连接于核酸序列上的位置不同于其天然连接位点.异源DNA并非其引入细胞内源产生的，而是来自另一细胞。一般而言，尽管并非必需，此类异源DNA编码表达其的细胞通常不产生的RNA和蛋白质.如果启动子、转录调控序列或其他遗传元件与另一序列(例如编码标记序列或农艺相关性状)在其天然环境中并非组合或有效连接，则所述启动子、转录调控序列或其他遗传元件相对于另一序列为"异源".优选所述序列在其天然环境中并非有效连樹即来自不同基因)。最优选所述调控序列共价连接并邻接其天然环境中并不邻接的核酸.本文所用的术语"转基因"是指任何引入细胞基因组或经人试验^Mt的核酸序列。优选所述序列产生于与天然存在生物不同的基因组中(例如，若所述序列为所述生物的内源序列，则将其引入与其天然位置不同的位置，或提高或减少其拷贝数目)。转基因可为"内源DNA序列"、"外源DNA序列"(如外源基因)或"异源DNA序列"，术语"内源DNA序列"指天然地见于其所引入的细胞的核苷酸序列，只要其相对于天然存在序列并不含有某些改变(如点突变、存在选择标记基因等)。当术语"转基因"或"重组"用于细胞或生物(例如对于大麦植物或植物细胞而言)时，指含有转基因或其基因组已被引入的转基因改变的细胞或生物。转基因生物或组织可以含有一个或多个转基因细胞。优选该生物或组织主要由转基因细胞组成(即所述生物或组织中多于80%,优选90%，更优选95%,最优选99%的细胞为转基因细胞)。"重组多肽，，为非天然存在的多肽，其序列与天然存在的多JIM目差至少一个氨基酸残基.产生此类重组多肽和/或核酸的优选方法包括直接或非直接诱变、DNA改组或其他递归重组(recursiverecombination)的方法，相对于目的杂交条件而言的术语"等同"杂交条件指该杂交条件及目的杂交条件下，具有相同范围的同源性百分比(％)的核酸序列能够杂交，例如，如果目的杂交条件下，第一核酸序列能与与第一核酸序列同源性为80%-卯％的其他核酸序列杂交，则另一杂交条件与目的杂交条件等同是指在该另一杂交务泮下，第一核酸序列也能与与第一核酸序列同源性为80%_90%的其他核酸序列杂交。在本发明优选实施方案中，除非另有说明，两个核酸或多肽序列间的序列同一性百分比是利用VectorNTI7.0(PC)软件包(InforMax，7600WisconsinAve.,Bethesda，MD20814)确定的。优选使用空位开放罚分15及空位延伸罚分6.66来确定两个核酸间的同一性百分比.优选使用空位开放罚分10及空位延伸罚分0.1来确定两个多肽间的同一性百分比。所有其他#优选设为默认设置。为进行多重比对(ClustalW算法)，在优选实施方案中，blosum62矩阵的空位开放罚分为10而空位延伸罚分为0.05。应当理解为了确定DNA序列和RNA序列比较时的序列同一性，胸腺嘧咬核苷等同于尿嘧啶核苷，本领域已充分了解核酸杂交中可使用多种等同条件以包含低或高严紧条件；需考虑的因素如探针长度和性质(DNA、RNA、威基组成)、靶标性质(DNA、RNA、碱基组成、存在于溶液之中或固定化等)，以及盐和其他成分的浓度(例如甲酰胺、葡聚糖硫酸盐、聚乙二醇的存在与否)，且杂交溶液可变动，以产生与上述条件有别但等同的低或高严紧性杂交的条件。本领域技术人员已知优选使用较高严紧性来减少或消除非特异性结合，而优选较低严紧性来检测同源性不同的较大数目的核#列。术语"基因，，指编码区，其有效连接于能以某种方式调控多肽表达的合适调控序列。基因包括处于编码区(开放读框ORF)前(上游)或后(下游)的DNA非翻译调控区(例如启动子、增强子、阻遏物等)，以及适用的情况下位于单个编码区(即外显子)之间的间隔序列(即内含子)。本文所用的术语"结构基因"是指可转录为mRNA随后翻译为特定多肽特征性^J^l亭列的DNA序列。本文所用的术语"编码区"当用于结构基因时，是指编码氨基酸的核苷酸序列，所述氨基酸见于mRNA分子翻译所得到的新生多肽。在真核细胞中，编码区5，端为编码起始甲硫氨酸的三联核苷酸"ATG，，，3，端为定义终止密码子的3种三联核苷酸(即TAA、TAG、TGA)之一。除了含有内含子，基因的基因组形式还包括RNA转录物序列中位于5，-和3，-末端的序列。这些序列纟皮称为"侧翼"序列或"侧翼"区域(这些侧翼序列位于mRNA转录物上非翻译序列的5，-或3，-端)。5，侧翼区可含有调控序列如启动子和增强子，控制或影响基因的转录。3，侧翼区可含有指导转录终止、转录后切割和多聚腺苷化的序列，此处术语"多肽"、"肽"、"寡肽"、"多肽"、"基因产物"、"表达产物"和"蛋白质"可交换使用，指连续氨基酸残基的多聚物或寡聚物。本文所用的术语"分离的"是指材料从其初始环境中分离出来，例如，活体动物中天然存在的多核苷酸或多肽并非分离的，但与某些或所有其天然系统中共存材料分离开的同一多核苷酸或多肽是分离的.此类多核苷酸可为载体的部分，和/或此类多核苷酸或多肽可为组合物的一部分，若该载体或组合物不为其原始环境的一部分，则所述多核苷酸或多肽为分离的，术语"遗传修饰生物"或"GMO"是指含有转基因DNA的任何生物。示例性生物包括植物、动物和微生物。本文所用的单数形式的术语"细胞"或"植物细胞，，指单个细胞。复数形式的术语"细胞"指细胞群，细胞群可为含有一种细胞类型的纯细胞群。同样，细胞群也可含有一种以上的细胞类型。在本发明中，对细胞群中可包括的细胞类型数目并无限制。细胞可为同步化或非同步化。本发明意义上的植物细胞可为分离的(例如处于悬浮培养物中)或含于任意发育阶段的植物组织、植物器官或植物中。对于植物而言的术语"器官"(或"植物器官")是指植物的一部分，可包括(但不限于)例如根、果实、芽、茎、叶、花药、萼片、花瓣、花粉、种子等.对于植物而言的术语"组织"(或"植物组织")是多个植物细胞的排布，包括植物的分化和未分化组织。植物组织可构成植物器官的部分(例如植物叶的上皮)，也可构成肿瘤组织(例如愈伤组织)及多种类型的培养细胞(例如单个细胞、原生质体、胚、愈伤组织、原始球茎样体等)。植物组织可为植物原位、器官培养物、组织培养物或细胞培养物。本文所用的术语"植物"是指高度分化为植物发育中任何阶段存在的结构的一群植物细胞。此类结构包括一个或多个植物器官包括(但不仅限于)果实、芽、茎、叶、花瓣等，术语"染色体DNA"或"染色体DNA序列，，指独立于细胞周期状态的细胞核基因组DNA。因此，染色体DNA可被组织为染色体或染色单体，它们可为压缩或未解旋的。可以通过多种本领域已知的方法证实并分析染色体DNA中的插入，例如PCR分析、Southern印迹分析、原位荧光杂交(FISH)及原位PCR,本文所用的术语"结构基因"是指可转录为mRNA随后翻译为特定多肽特征性氨基酸序列的DNA序列。术语"表达"指基因产物的生物合成.例如，在结构基因的情况下，表达包括将结构基因转录为mRNA，并任选随后将mRNA翻译为一个或多个多肽.本文所用的术语"表达盒"或"表达构建体"是指将任意待表达核酸序列有效连接于启动子序列和(任选)有助于所述核酸序列表达的其他元件(例如像终止子和/或多聚腺苷化序列)的组合。本文所用的术语"启动子"、"启动子元件"或"启动子序列"是指位于核苷酸序列5，端的指导转录起始的核苷酸序列(即能控制该核苷酸序列转录为mRNA)。启动子一般(但不必须)位于核苷酸序列的5，端(即上游，例如邻近结构基因的转录起始位点)，其调控所述核苷酸序列向mRNA的转录，并提供RNA聚合酶和其他转录因子特异结合的位点以起始转录。启动子序列为驱动下游基因表达所必需(但并不充分)。一般而言，真核启动子包括位于转录起始(帽子)位点5，端10-30bp处、与共有序列5，-TATAAT-3，(TATA)盒同源的特征性DNA序列，方便起见将所述转录起始位点编号为+1。位于帽子位点3，端的碱基用正数表示，而位于帽子位点5，端的g用负数表示，分别反映其远离帽子位点的距离.另一启动子成分CAAT盒，常见于TATA盒5，端30至70bp处，与经典形式的5，-CCAAT-3，(Breathnach1981)具有同源性.植物中CAAT盒有时被称为AGGA盒的序列所取代，后者为三联G(或T)NG侧翼具有对称性分布腺苷残基的区域(Messing1983).其他对转录有调控作用的序列可见于启动子区域内，并延伸至帽子位点5，端以外多达1000bp处或更远，当术语"组成型"用于启动子时，表示该启动子能够在缺乏刺激(例如热休克、化学物质、光等)的情况下指导有效连接的核酸序列进行转录.一般而言，组成型启动子能够指导转基因在基本任何细胞和任何组织中表达。调节控制指通过主要(但不全)位于转录起始位点上游(5，端)的DNA序列元件来调节基因表达,调节可能会造成对环境剌激的全有或全无应答，或可能造成基因表达水平的多样化.本发明中，热休克调控元件能在应答突发温度上升时发挥作用，瞬时增强下游基因表达的水平.多聚腺苷化信号是指任何能影响mRNA加工的核酸序列，通常以向mRNA前体的3，端添加多聚腺苷酸为特征。多聚腺苷化信号DNA片段自身可为若干来源(天然存在或合成的)的片段组合物，可来自基因组DNA或RNA衍生的cDNA。多聚腺苷化信号通常因典型形式5'-AATAA-3，同源物的存在而被识别，尽管距离的差异、部分"通读"和多重串联典型序列并不少见(Messing1983)。应当认识到典型的"多聚腺苷化信号"可能实际上导致转录的终止而并非仅仅多聚腺苷化本身(Montell1983)。热休克元件是指调控应答突发温度升高应激的基因表达的DNA序列。在该应答中可见到下游基因表达水平突发但短暂的增强。关于热休克基因的初步工作是在果蝇中完成的，但许多其他物种包括植物(Barnett1980)对应激也表现出类似的应答。已描述果蝇热休克元件的关键主要成分具有共有序列5，-CTGGAATNTTCTAGA-3，(其中N=A、T、C或G)，并定位于转录起始位点上游-66至-47bp的残基之间(Pelham1982)。化学合成的该共有序列的寡核苷酸拷贝可以取代天然序列，赋予热休克诱导性。前导序列指包括位于转录起始位点和翻译起始位点间的约100个核苷酸的DNA序列。前导序列中包括的是指定核糖体结合位点的区域。本文的内含子或间隔序列指与编码序列(外显子)一同翻译、但形成成熟mRNA时被移除的那些DNA序列区域，内含子可位于转录序列中的任何部位一一位于相同或不同基因的编码序列之间，位于基因的编码序列中(中断并分开其A^酸序列)，以及位于启动子区(翻译起始位点5，端)。初级转录物中的内含子被切割出来，而编码序列,皮同步且精确连接以形成成熟mRNA。内含子和外显子的连接处构成剪接位点。内含子的g序列以GU开始，以AG结束。相同的剪接信号见于许多高等真核细胞中。术语"有效连接"或"有效连接的"应理解为，例如调控元件(如启动子)与待表达的核酸序列的有序排列(若合适，还包括调控元件.(如终止子))，从而使每一调控元件都能完成其预期的功能，即允许、修饰、促进或以其他方式影响所述核酸序列的表达.造成的表达可能取决于核,列相对正义或反义RNA的排列。此处，并不必需化学意义上的直接连接。遗传控制序列如增强子序列也可从远处的位点或实际上在其他DNA分子上对靼序列施加影响。优选的排列为将待重组表达的核酸序列置于作为启动子起作用的序列之后，从而这两个序列彼此共价连接。启动子序列和待重组表达的核酸序列之间的距离优选少于200个g对，尤其优选少于100个4^&对，特别优选少于50个碱基对。可以通过(如见于Maniatisl989;Silhavy1984;Ausubel1987;Gelvin1990)所述的常规重组和克隆技术产生有效连接及表达盒。然而，作为具有限制性酶特异切割位点的接头序列或信号肽起作用的其他序列，也可置于两个序列之间。序列的插入也可导致表达融合蛋白质。优选，由启动子和待表达核酸连接组成的表达盒，可以载体整合形式存在，通过如转化插入植物基因组中。本文所用的术语"转化"是指将遗传物质(例如转基因)引入细胞。细胞的转化可为稳定的或瞬时性的。术语"瞬时转化"或"瞬时转化的"是指将一个或多个转基因引入细胞，但转基因并不整合于宿主细胞基因组中。可通过例如酶联免疫吸附试验(ELISA)检测瞬时转化，ELISA试验可检测是否存在由所述一个或多个转基因编码的多肽。或者，通过如此处所示检测由转基因(如uidA基因)编码的蛋白质(如p-葡萄糖苷酸酶)活性〔例如通过用X-gluc染色组化测定GUS酶活性，当存在GUS酶时X-gluc可表现出蓝色沉淀；利用GUS-Light试剂盒(Tropix)对GUS酶活性进行化学发光测定〕来检测瞬时转化.术语"瞬时转化林"指瞬时掺入一个或多个转基因的细胞.与之相对，术语"稳定转化"或"稳定转化的"指一个或多个转基因引入并整合于细胞的基因组中，优选形成染色体整合和减数分裂下的稳定遗传力。可以通过将细胞基因组DNA与能结合所述一个或多个转基因的核^列进行Southern印迹杂交，检测细胞的稳定转化。或者也可通过细胞基因組DNA的聚合酶链式反应扩增转基因序列来检测稳定的细胞转化.术语"稳定转化林"指将一个或多个转基因稳定整合于基因组DNA(包括质体DNA和核DNA)，优选整合入核内染色体DNA的细胞。因此，稳定转化林与瞬时转化林的不同之处在于，稳定转化林的基因组DNA含有一个或多个转基因，而瞬时转化林的基因组DNA中不含转基因.转化也包括以植物病毒栽体的形式将遗传物质引入植物细胞，包括染色体外复制以及减数分裂稳定性性质不同的基因表达。转化也包括以植物病毒载体的形式将遗传物质引入植物细胞，涉及减数分裂稳定性不同的染色体外复制及基因表达。优选术语"转化"包括将遗传物质引入植物细胞，从而导致染色体整合和减数分裂所致的稳定遗传力。术语细菌"感染"和"侵染，，指在一定条件下将靶生物样品(例如细胞、组织等)与细菌共孵育，从而使细菌中所含的核^f列被引入靶生物样品的一个或多个细胞中。术语"农杆菌"指存于土壤中可导致冠瘿病的革兰氏阴性杆状植物致病细菌。术语"农杆菌"包括但不仅限于根瘤农杆菌(Jgra6flcteW"附似we/^^附)菌林(一般可导致感染植物的冠瘿病)，以及发根农杆菌(Jgro6acteWw附r似z化e"M)菌林(导致感染宿主植物的发根病)。农杆菌感染植物细胞一般会导致感染细胞产生冠樱碱(例如胭脂碱、农杆碱、章鱼碱等)，因此，导致产生胭脂碱的农杆菌菌林(例如菌林LBA4301、C58、A208)被称为"胭脂碱型"农杆菌；导致产生章鱼碱的农杆菌菌林(例如菌林LBA4404、Ach5、B6)被称为"章鱼碱型"农杆菌；而导致产生农杆碱的农杆菌菌株(例如菌林EHA105、EHAIOI、A281)被称为"农杆碱型"农杆菌.术语"轰击"和"基因枪轰击"指向耙生物样品(如细胞、组织等)加速引入颗粒的方法，从而导致靶生物样品中细胞的细胞膜损伤，和/或颗粒进入该靶生物样品中。基因枪轰击的方法为本领域已知(例如US5，584，807，其内容在此次引用作为参考)，并可购得(例如氦气驱动显微投射加速器(PDS-1000/He)(BioRad)),本文所用的术语"杂交"包括"使一条核酸链通ii^配对与互补链结合的任意方法"(Coombs1994),杂交及杂交强度(即核酸间结合的强度)受以下因素影响，如核酸间的互补程度、涉及务ff的严紧性、所形成杂合体的Tm，以及核酸内的G:C比率。本文所用的术语"Tm"用于指"解链温度"。解链温度为双链核酸分子群半解离形成单链的温度。计算核酸Tm的方程式为本领域所公知。如标准参考文献所提示，可通过方程式Tm=81.5+0.41(%G+C)简单估算Tm值，其中核酸处于1MNaCl的7JC溶液中见如Anderson和Young,QuantitativeFilterHybridization,NucleicAcidHybridization(1985)。其他参考包括在Tm计算中考虑结构和序列特点的更复杂的计算。除非另有说明，核酸杂交的低严紧性条件包括等同于如下的条件于68。C在含5xSSPE(43.8g/LNaCl、6.9g/LNaH2P04.H20和1.85g/LEDTA,用NaOH调节pH为7.4)、1%SDS、5xDenhardt，s试剂[50xDenhardt's,其中每500mL含有5gFicoll(Type400，Pharmacia)、5gBSA(FractionV;Sigma)，以及100ng/mL变性鲑精DNA的溶液中进行结合或杂交，然后于室温在含0.2xSSPE和0.1%SDS的溶液中洗涤，其中使用长约100至1000个核苷酸的DNA探针。除非另有说明，核酸杂交的高严紧性条件包括等同于如下的务ff:于68X:在含5xSSPE、1%SDS、5xDenhardt's试剂和100照/mL变性鲑精DNA的溶液中进行结合或杂交，然后于68X:在含0.1xSSPE和0.1%SDS的溶液中洗涤，其中使用长约100至1000个核苷酸的DNA探针。相对于目的杂交条件而言的术语"等同"杂交条件指该杂交条件及目的杂交条件下，具有相同范围同源性百分比(％)的核酸序列能够杂交。例如，如果目的杂交条件下，第一核酸序列能与与第一核酸序列同源性为80%-卯％的其他核酸序列杂交，则另一杂交条件与目的杂交务降等同是指在该另一杂交条件下，第一核酸序列也能与与第一核酸序列同源性为80%—卯％的其他核酸序列杂交.本领域已充分了解核酸杂交中可使用多种等同条件以包含低或高严紧条件；需考虑的因素如探针长度和性质(DNA、RNA、碱基组成)、靶标性质(DNA、RNA、碱基组成、存在于溶液之中或固定化等)，以及盐和其他成分的浓度(例如甲酰胺、葡^l疏酸盐、聚乙二醇存在与否)，且杂交溶液可变动，以产生与上述条件有别但等同的低或高严紧性杂交的条件。本领域技术人员已知优选使用较高严紧性来减少或消除非特异性结合，而优选较低严紧性来检测同源性不同的较大数目的核酸序列。发明详述参考以下对本发明优选实施方案的详细描述及所附的实施例，可更容易地理解本发明。在/>开并描述本发明的化合物、组合物及方法之前，应当理解本发明不仅限于特定核酸、特定多肽、特定细胞类型、特定宿主细胞、特定条件或特定方法等，因为这些理所当然可以有所变化，其多种修饰和变化对于本领域冲支术人员而言是显而易见的。还应当理解本文所用的术语仅出于描述具体实施方案的目的而并非旨在限制。如说明书和权利要求书中所用，"一个"或"一种"可以表示一个/一种或多个/多种，视上下文而定。从而，例如，述及"一个/一种细胞"可以表示能够利用至少一个/一种细胞。本发明部分基于对编码FAD2样LMP的核酸分子的分离和表征，所述核酸分子来自植物包括拟南芥、大豆、稻、玉米、亚麻、大麦和小麦及其他相关作物物种如玉米、大麦、亚麻、甜菜或向日葵。根据本文所体现和详细描述的本发明目的，本发明一方面提供了来自植物(拟南芥、大豆、玉米、稻、亚麻、大麦或小麦)的编码脂质代谢蛋白(LMP)或其部分的分离的核酸。本发明的一方面涉及编码LMP多肽或其生物学活性部分的分离的核酸分子，也涉及足以作为鉴定或扩增LMP编码核酸(如LMPDNA)的杂交探针或引物的核酸片断.如本文所用的术语"核酸分子"旨在包括DNA分子(如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(如mRNA)，以及利用核苷酸类似物产生的DNA或RNA类似物。该术语也包括基因编码区3，和5，端的非翻译序列基因编码区5，端上游序列至少约1000个核苷酸以及编码区3，端下游序列至少约200个核苷酸。核酸分子可以为单链或双链，但优选双链DNA."分离"的核酸分子为与所述核酸天然来源中存在的其他核酸分子充分分离开的核酸分子.优选"分离"的核酸中基本不含在其来源生物基因组DNA中天然位于所述核酸两侧的序列(即位于所述核酸5，和3，端的序列).例如，在多个实施方案中，分离的LMP核酸分子可含有少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，所述核苷酸序列在该核酸来源的细胞(如拟南芥、大豆、稻、玉米、亚麻、大麦或小麦细胞)基因组DNA中与之天然侧接.此外，"分离"的核酸分子如cDNA分子中基本不含有使用重组技术生产时的其他细胞材料或培养基，或釆用化学合成时的化学前体或其他化学物。可以使用标准分子生物学技术及本文提供的序列信息分离本发明的核酸分子，例如具有附录A所示核苷酸序列，如优选实施方案中公开的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35或其部分的核酸分子。例如，可以使用附录A所示序列之一，如优选实施方案中公开的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35的全部或部分作为杂交探针，利用标准杂交技术(如Sambrook等所述,1989，Afo/簡/flf爿1fl^r她/yAfa/iwa/笫二版，CV>/</S/iW"g^fiTflrAor丄a6wato/j，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)，从拟南芥、大豆、稻、玉米、亚麻、大麦或小麦文库中分离拟南芥、大豆、玉米、稻、亚麻、大麦或小麦的LMPcDNA。此外，可以使用根据相同核酸序列设计的寡核苷酸引物进行聚合酶链式反应分离包含附录A所示序列之一，如优选实施方案中公开的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35的全部或一部分的核酸分子(例如可以利用根据附录A所示相同序列，如优选实施方案中公开的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35设计的寡核苷酸引物，通过聚合酶链式反应分离包含附录A所示序列之一，如优选实施方案中公开的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35的全部或一部分的核酸分子)。例如，可以从植物细胞中分离mRNA(如通过Chirgwin等，1979，Biochemistry18:5294-5299所述的胍盐-硫氰酸盐萃取法)，并且可以利用逆转录酶制备cDNA(如获自Gibco/BRL，Bethesda，MD的MoloneyMLV逆转录酶；或获自SeikagakuAmerica,Inc.,St.Petersburg,FL的AMV逆转录酶)。可以根据附录A所示核苷酸序列，如优选实施方案中公开的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35之一设计用于聚合Sl^式反应扩增的合成寡核苷酸引物。可根据标准PCR扩增技术选择合适的寡核苷酸引物，以cDNA或基因组DNA为模板扩增本发明的核酸。将如此扩增的核酸克隆至合适的栽体中，并通过DNA序列分析进行表征。此外，可以通过标准合成技术，如使用自动DNA合成仪，制备与LMP核苷^列相应的寡核苷酸。在优选实施方案中，本发明的分离的核酸包含附录A所示核苷酸序列之一，如优选实施方案中公开的SEQIDNO:5、SEQIDNO:9、SEQIDNO:13、SEQIDNO:17、SEQIDNO:21、SEQIDNO:25、SEQIDNO:29或SEQIDNO:33。附录A所示序列，如优选实施方案中公开的SEQIDNO:5、SEQIDNO:9、SEQIDNO:13、SEQIDNO:17、SEQIDNO:21、SEQIDNO:25、SEQIDNO:29或SEQIDNO:33对应于本发明的拟南芥、大豆、稻、玉米、亚麻、大麦或小麦LMPcDNA。这些cDNA中含有编码LMP的序列(即附录A所示的"编码区")以及5，非翻译序列及3，非翻译序列.可选地，核酸分子可只包含附录A所示任何序列，如优选实施方案中公开的SEQIDNO:7、SEQIDNO:11、SEQIDNO:15、SEQIDNO:19、SEQIDNO:23、SEQIDNO:27、SEQIDNO:31或SEQIDNO:35的编码区，或者可包含分离自基因组DNA的完整基因组片段。就本申请的目的而言，应该理解附录A中公开的每个序列具有标识记录号(例如7Jii^Z)-W)。这些序列中每一个通常各包含三个部分5，上游区、编码区和下游区。这些序列的编码区标记为"ORF位置"(表3)。在另一优选实施方案中，本发明的分离的核酸分子含有这样的核酸分子，所述核酸分子为附录A所示核苷酸序列，如优选实施方案中4S开的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35之一或其部分的互补序列。与附录A所示核苷酸序列，如优选实施方案中公开的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35之一互补的核酸分子是这样的核酸分子，它们与附录A所示核苷酸序列充分互补，从而能够与附录A所示核苷酸序列之一杂交，由此形成稳定的双链体.又在另一个优选实施方案中，本发明的分离的核酸分子含有核苷^列，所述核苷酸序列与附录A所示核苷酸序列，如优选实施方案中爿^开的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35或其部分之间具有至少约50-60%,优选至少约60-70%,更优选至少约70-80%、80-90%或90-95%，也优选至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%或94%，甚至更优选至少约95%、96%、97%、98%、99%或更高的同源性。优选利用VectorNTISuite9.0的AlignX(2003年8月22日)确定核苷酸序列的同源性，设定参数如下空位开》文罚分15;空位延伸罚分6.66;空位分离罚分范围8;比对延迟的同一性百分比40。在另一优选的实施方案中，本发明的分离的核酸分子含有核苷酸序列，所述核苷酸序列可与附录A所示核苷酸序列之一或其部分杂交，例如在严紧条件下杂交。这些杂交条件包括用盐浓度为约0.02M的溶液于pH7约60C洗涤。此外，本发明的核酸分子可仅含有附录A所示序列，如优选实施方案中公开的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35之一的编码区的一部分，例如可用作探针或引物的片断，或编码LMP生物学活性部分的片断。通过克隆拟南芥、大豆、稻、玉米、亚麻、大麦或小麦的LMP基探针和引物。因此本发明也提供含有本文公开的核酸或其片断的化合物。这些化合物包含附着于其他部分的核酸。其他部分包括但不仅限于检测部分、杂交部分、纯化部分、递送部分、反应部分、结合部分等.探针/引物一般含有基本上纯的寡核苷酸.所述寡核苷酸一般含有可在严格条件下与附录A所公开序列，如优选实施方案中公开的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35之一的正义链、附录所A公开序列，如优选实施方案中公开的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35之一的反义序列或其天然突变体中至少约12个，优选约25个，更优选约40、50或75个连续核苷酸杂交的核苷酸序列区。基于附录A所示核苷酸序列，如优选实施方案中公开的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35的引物可用于PCR反应以克隆LMP同源物。基于LMP核苷^f列的探针可用于检测转录物或编码相同或同源蛋白质的基因组序列。在优选的实施方案中，探针还含有与W目连的标记基团，例如，标记基团可为放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子.此类探针可作为基因组标记物测试试剂盒的一部分，用于如通过测量细胞样品中LMP编码核酸的水平(如检测LMPmRNA水平)鉴定表达LMP的细胞，或确定基因组LMP基因是否发生了突变或缺失。在一个实施方案中，本发明的核酸分子编码蛋白质或其部分，所述蛋白质或其部分含有与附录A所示序列，如优选实施方案中公开的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35之一所编码的絲酸序列基本同源的M酸序列，从而使蛋白质或其部分能保持与野生型蛋白质相同或相似的功能。本文所用的"基本同源"，是指蛋白质或其部分具有的M酸序列中包括最小数目的与某M,列同一或等同的^Jl酸残基(例如，与附录A所示序列，如优选实施方案中公开的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35中ORF之一的氨基酸残基具有相似侧链的氨基酸残基)，从而使蛋白质或其部分能够参与植物中种子贮存化合物的产生、微生物或植物中细胞膜的构建、或分子的跨膜转运所必需的化合物代谢。调节蛋白如DNA结合蛋白、转录因子、激酶、磷酸酶，或代谢路径如脂质、淀粉和蛋白质生物合成路径的蛋白质成员、或膜转运系统可能在种子贮存化合物的生物合成中起作用。本文描述了此类活性的实例(见表3的推定注释)。LMP编码核酸序列的实例在附录中A公开，如优选实施方案中公开的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35。由于在多种植物如玉米、小麦、棵麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、大豆、花生、棉花、芸苔、油菜籽、木薯、胡椒、向日葵、甜菜和万寿菊、茄属植物如马铃薯、烟草、茄子及番茄、蚕豆属物种、豌豆、紫花苜蓿、灌木植物(咖啡、可可树、茶树)、柳树属物种、树(油棕、椰树)以及多年生草本和饲料作物中，改变或提高糖和/或脂肪酸的产量是希望得以遗传的主要性状，这些作物植物也是本发明另一实施方案中用于基因工程的优选耙植物。本发明的LMP核酸分子编码的蛋白质部分优选为LMP之一的生物学活性部分。本文所用的术语"LMP的生物学活性部分"旨在包括这样的部分，如参与种子贮存脂质的生物合成、微生物或植物中细胞膜的构建或分子的跨膜转运所必需的化合物代谢、或具有表3所列活性的LMP结构域/基序。为确定LMP或其生物学活性部分是否能够参与种子贮存化合物的产生及细胞膜所需的化合物代谢，可进行酶活测定。此类测定法为本领域技术人员所熟知，并描述于实施例14。LMP的生物学活性部分包括含有M酸序列的肽，所述M酸序列来源于LMP^酸序列(如由附录A所示核酸序列，如优选实施方案中公开的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35编码的^J^絲列或与LMP同源的蛋白质的^J^M列，其包括比全长LMP或与LMP同源的全长蛋白质更少的氨基酸)，且表现出至少一种LMP活性。通常，生物学活性部分(如长度为如5、10、15、20、30、35、36、37、38、39、40、50、100或更多个氛基酸的肽)含有具有至少一种LMP活性的结构域或基序。此外，可以通过重组技术制备蛋白质其他区域缺失的其他生物学活性部分，并评估本文所述的一种或多种活性。优选地，LMP生物学活性部分包括一个或多个选择的结构域/基序或其具有生物学活性的部分。可以制备编码LMP生物活性部分的其他核酸片断，分离这些序列之一的部分、表达LMP或肽的编码部分(如通过体外重组表达)并评估LMP或肽编码部分的活性。本发明还包括由于遗传密码简并而有别于附录A所示核苷酸序列，如优选实施方案中公开的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35之一(及其部分)的核酸分子，因而也编码与附录A所示核苷酸序列，如优选实施方案中公开的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35编码的LMP相同的LMP。在另一实施方案中，本发明的核酸分子编码全长蛋白质，其与附录A所示开放读码框编码的多肽的JL&酸序列基本同源。在一个实施方案中，全长核酸或蛋白质或者核酸或蛋白质的片断来自拟南芥、大豆、稻、玉米、亚麻、大麦或小麦。除本文附录A所示的拟南芥、大豆、稻、玉米、亚麻、大麦或小麦LMP核苷酸序列外，本领域技术人员会理解种群(如拟南芥、欧洲油菜、大豆、稻、玉米、亚麻、大麦或小麦种群)中可能存在导致LMP氮基酸序列改变的DNA序列多态性。由于天然变异，种群个体间可能存在此类LMP基因的遗传多态性，本文所用的术语"基因"和"重组基因"是指含有编码LMP的开放读框的核酸分子，其中LMP优选为拟南芥、大豆、稻、玉米、亚麻、大麦或小麦LMP。此类天然变异一般会造成LMP基因的核苷酸序列1-40%的变异。任何及所有此类天然变异导致的且不会改变LMP功能性活性的核苷酸变异及其所产生的LMP氣基酸多态性，均在本发明的范围内。对应于天然变异体和本发明拟南芥、大豆、稻、玉米、亚麻、大麦或小麦LMPcDNA的非拟南芥、大豆、稻、玉米、亚麻、大麦或小麦直向同源物的核酸分子，可以根据其与本文公开的拟南芥、大豆、稻、玉米、亚麻、大麦或小麦LMP核酸的同源性，以拟南芥、大豆、稻、玉米、亚麻、大麦或小麦cDNA或其部分为杂交探针，根据严格杂交条件下的标准杂交技术进行分离，本文所用的术语"直向同源物"是指来自不同物种的两种核酸，但其系自共同祖先基因通过物种形成进化而来，通常直向同源物编码具有相同或相似功能的蛋白质.因此，在另一实施方案中，本发明分离的核酸分子长度至少为15个核苷酸，且可在严紧条件下与含有附录A所示核苷酸序列，如优选实施方案中公开的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35的核酸分子杂交，在其他实施方案中，核酸长度至少为30、50、100、250或更多个核苷酸。本文所用的术语"在严紧条件下杂交"用以描述杂交和洗涤4H，，在所述条件下彼此间至少有60%同源性的核苷酸序列通常可仍然彼此杂交。优选的条件可使彼此具有至少约65%，更优选至少约70%，甚至更优选至少约75%或更高同源性的序列通常仍然彼此杂交.此类严紧条件为本领域技术人员所公知，可见于《CurrentProtocolsinMolecularBiology》，JohnWiley&Sons,N.Y.，1989，6.3.1-6.3.6。优选的严紧杂交条件的非限制性实例为在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中于约45X:杂交，随后在0.2xSSC、0.1%SDS中于50-65X:洗涤一次或多次。优选地，可在严紧条件下与附录A所示序列，如优选实施方案中公开的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35杂交的本发明的分离的核酸分子对应于天然存在的核酸分子。本文所用的术语"天然存在的"核酸分子是指具有天然存在(如编码天然蛋白质)的核苷酸序列的RNA或DNA分子。在一个实施方案中，核酸编码天然存在的拟南芥、大豆、稻、玉米、亚麻、大麦或小麦LMP。除了种群中可能存在的LMP序列天然变体之外，技术人员还理解可以通过突变向附录A所示核普酸序列，如优选实施方案中公开的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35之一引入变化，由此改变所编码LMP的M酸序列，而不改变LMP的功能活性，例如，可以对附录A所示序列，如优选实施方案中公开的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35进行核苷酸取代，从而引起"非必需"氨基酸残基的M酸取代。"非必需"氨基酸残基是指LMP(附录A，如优选实施方案中公开的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35)之一的野生型序列中可以改变而不改变所述LMP活性的残基，而"必需"氩基酸残基则是LMP活性所必需的。然而，其他氣基酸残基(如那些LMP活性结构域中非保守或仅为半保守的残基)对于其活性可能是非必需的，因此这些残基可能适于,皮改变而不改变LMP活性。因此，本发明的另一方面涉及编码LMP的核酸分子，所述LMP含有LMP活性非必需的氨基酸残基改变。此类LMP在Jl^酸序列上与还保留本文所述的至少一种LMP活性的序列有所不同。在一个实施方案中，分离的核酸分子包含编码蛋白质的核苷酸序列，其中所述蛋白质含有与附录A，如优选实施方案中公开的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35所示核酸序列编码的M酸序列具有至少约50%同源性的氛基酸序列，且能够参与拟南芥、大豆、稻、玉米、亚麻、大麦或小麦中种子贮存化合物的产生或细胞膜所必需的化合物代谢，或具有表3列出的一种或多种活性。优选地，核酸分子编码的蛋白质与附录A所示的核酸，如优选实施方案中公开的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35之一所编码的序列具有至少约50-60%的同源性，更优选与附录A所示的核酸，如优选实施方案中公开的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35之一所编码的序列具有至少约60-70%的同源性，甚至更优选与附录A所示的核酸，如优选实施方案中公开的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35之一所编码的序列具有至少约70-80Q/。、80-卯％、卯-95%的同源性，还优选与附录A所示的核酸,如优选实施方案中公开的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35之一所编码的序列具有至少约85%、86%、87%、88%、89%、卯％、91%、92%、93%、94%或95%的同源性，并且最优选与附录A所示的核酸，如优选实施方案中公开的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35之一所编码的序列具有至少约96%、97%、98%或99%的同源性。优选利用VectorNTISuite9.0的AlignX(2003年8月22日)确定多肽序列的同源性，设定参数如下空位开放罚分10;空位延伸罚分0.05;空位分离罚分范围8;比对延迟的％—致性40。为确定两个M酸序列(如附录A所示核酸，如优选实施方案中公开的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35之一所编码的序列与其突变形式)之间或两个核酸之间的同源性百分比，将所述序列按最佳比较目进行比对(例如，可在一蛋白质或核酸序列中引入空位以便与另一蛋白质或核酸进行最佳比对)。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置的M酸残基或核苷酸。如果其中一个序列(如由附录A所示核酸，如优选实施方案中公开的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35所编码的序列之一)中某一位置被与另一序列(如选自附录A所示核酸序列，如优选实施方案中公开的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35所编码多肽的序列的突变形式)相应位置上相同的氛基酸残基或核苷酸所占据，则两个分子在该位置上同源(即本文所用的氨基酸或核酸"同源性"与氨基酸或核酸"同一性"的意义等同)。两个序列之间的同源性百分比为这两个序列所共有的相同位置数的函数(即，同源性％-相同位置粉总位置数x100),可以通过向附录A所示核苷酸序列，如优选实施方案中公开的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35中引入一个或多个核苷酸取代、添加或缺失，来产生编码与附录A所示核酸，如优选实施方案中公开的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35所编码蛋白质序列同源的LMP的分离的核酸分子，从而可向编码蛋白质中引入一个或多个M酸取代、添加或缺失。可以通过标准技术如定点诱变和PCR介导的诱变，向附录A所示序列，如优选实施方案中公开的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35之一引入突变。优选在一个或多个预测的非必需M酸残基上进行保守氨基酸取代。"保守JL^酸取代"是指一个氨基酸残基由另一个具有相似侧链的氨基酸残基代替。本领域中已经确定了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(如甘氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、p-支链側链(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香侧链(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸残基。因此，优选用来自相同侧链家族的另一M酸残基代替LMP中预测的非必需M酸残基，或者，在另一个实施方案中，可以通过诸如饱和诱变的方法向所有或部分LMP编码序列中随机引入突变，并筛查所得突变体中本文所述的LMP活性，以鉴定保留LMP活性的突变体。诱变附录A所示序列，如优选实施方案中公开的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35之一后，可以重组表达编码的蛋白质，并通过如本文描述的测定法(见实施例11-13)测定蛋白质的活性.优选通过重组DNA技术产生LMP。例如，将编码蛋白质的核酸分子克隆到表达栽体(如本文所述)中，将表达载体引入宿主细胞(如本文所述)，并在宿主细胞中表达LMP。随后可利用标准蛋白质纯化技术、通过合适的纯化策略将LMP从细胞中分离出来。作为重组表达的备选方案，还可使用标准肽合成技术化学合成LMP或其肽。此外，可以例如卩吏用抗LMP抗体从细胞中分离天然LMP，所述抗体可通过标准技术，利用本发明的LMP或其片断制备。本发明也提供了LMP嵌合或融合蛋白质，本文所用的LMP"嵌合蛋白质"或"融合蛋白质"包括与非LMP多肽有效连接的LMP多肽。"LMP多肽"或"LMP蛋白质"是指具有LMP相应M酸序列的多肽，而"非LMP多肽"是指具有与LMP非基本同源的蛋白质对应的氨基M列的多肽，例如与LMP不同且来源于相同或不同生物的蛋白质。就融合蛋白质而言的术语"有效连接"旨在表明LMP多肽与非LMP多^bf目互融合，从而使二者都能刊Y吏属于所用序列的预期功能。可以将非LMP多肽融合于LMP多肽的N-末端或C-末端。例如，在一个实施方案中，融合蛋白质为GST-LMP(谷胱甘肽S-转移酶)融合蛋白质，其中LMP序列融合于GST序列的C-末端。此类融合蛋白可促进重组LMP的纯化。在另一实施方案中，融合蛋白为在其N-末端含有异源信号序列的LMP。在某些宿主细胞(如哺乳动物宿主细胞)中，使用异源信号序列能够提高LMP的表达和/或分泌。优选通过标准重组DNA技术生产本发明的LMP嵌合或融合蛋白质。例如，根据常规技术将编码不同多肽序列的DNA片断于读框内连接在一起，如使用平末端或粘性末端进行连接、限制性酶消化以提供合适的末端、必要时填平粘性末端、碱性磷酸酶处理以避免不期望的连接，以及酶促连接。在另一个实施方案中，可以通过常规技术包括自动化DNA合成仪合成融合基因。或者可以使用锚定引物进行基因片断的PCR扩增，所述锚定引物能够在两个连续基因片断之间产生互补突出端，使其可随后退火并再扩增产生嵌合基因序列(例如参见CurrentProtocolsinMolecularBiology,Ausubel等编，JohnWiley&Sons:1992),此外，许多已经编码融合部分的表达栽体(如GST多肽)为商业可得，可以将LMP编码核酸克隆到这样的表达载体中，从而使融合部分与LMP同读框相连.除了上述编码LMP的核酸分子之外，本发明另一方面涉及与其反义的分离的核酸分子。"反义"核酸含有与编码蛋白质的"正义"核酸互补的核苷酸序列，例如与双链cDNA分子的编码链互补或与mRNA序列互补。因此，反义核酸可以与正义核酸形成氢键。反义核酸可以与整个LMP编码链互补，也可仅与其中一部分互补。在一个实施方案中，反义核酸分子与LMP编码核苷酸序列的编码链"编码区"反义，术语"编码区"是指含有能够翻译为氨基酸残基的密码子的核苷酸序列区域(例如7iiE4Z)-w的完整编码区包含核苷酸165-1325)。在另一实施方案中，反义核酸分子与LMP编码核苷酸序列的编码链"非编码区"反义。术语"非编码区"是指编码区两侧不被翻译成氨基酸的5，和3，序列(即也称为5，和3，非翻译区)。给定本文公开的编码LMP的编码链序列(例如附录A所示序列，如优选实施方案中7>开的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35)，可以按照Watson和Crick碱基配对原则设计本发明的反义核酸.反义核酸分子可以与LMPmRNA的整个编码区互补，但更优选为仅与LMPmRNA编码区或非编码区的一部分反义的寡核苷酸。例如，反义寡核苷酸可以与LMPmRNA翻译起始位点周围区域互补.反义寡核苷酸长度可为如5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸。可以使用化学合成以及酶促连接反应，通过本领域已知的方法构建本发明的反义或正义核酸.例如，可以使用天然存在的核苷酸或多种修饰核苷酸化学合成反义核酸(如反义寡核苷酸)，所述修饰核苷酸是设计为了提高分子的生物学稳定性或提高反义和正义核酸间所形成的双链体的物理稳定性，如可使用减，代磷酸酯衍生物和吖咬取代的核普酸，可用于产生反义核酸的修饰核苷酸实例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧咬、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧咬核苷、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-氯基甲基JL^-甲基-2-硫代尿普、5-羧基甲基氨基曱基尿嘧啶、双氢尿嗜咬、P-D-半乳糖Q核苷、肌苷、N-6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、l-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-曱基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-曱基-胞嘧啶、N-6-腺噤呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基-甲基-2-硫尿嘧啶、p-D-甘露糖Q核苷、5'-曱氧基絲甲基尿嘧啶、嘧啶、2-甲硫基-N-6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧咬、Q核苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2,6-二氨基噤呤。或者，可以使用表达载体生物产生反义核酸，RNA为目的靶核酸的反义方向，在以下部分将进一步说明)。在反义技术的另一种变化形式中，可以使用双链千扰RNA构建体引起转基因植物中LMPmRNA水平以及LMP活性的下调。这需要用嵌合构建体转化植物，所述构建体中含有正义方向的LMP序列部分，其与相同的LMP序列部分的反义序列融合，可以利用长度不等的DNA接头区来分隔该构建体中LMP序列的正义及反义片断。本发明的反义核酸分子一般施用于细胞或原位产生，以使其能够与编码LMP的细胞mRNA和/或基因组DNA杂交或与之结合，从而抑制所述蛋白质的表达，如通过抑制转录和/或翻译，可以通过常规的核苷酸互补而形成稳定的双链体进行杂交，或者，如在反义核酸分子结合于DNA双链体的情况下，通过在双螺旋大沟内的特定相互作用进行杂交。通过如将反义核酸分子与可结合于细胞表面受体或抗原的肽或抗体相连，可以对反义分子进行修饰而使其能够特异性地与所选择细胞表面的受体或抗原结合，也可使用本文描述的栽体将反义核酸分子递送到细胞中，为达到胞内反义分子的足够浓度，优选将反义核酸分子置于原核、病毒或真核(包括植物)的强启动子调控下的栽体构建体。又在另一个实施方案中，本发明的反义核酸分子为端基异构核酸分子。端基异构核酸分子与互补RNA形成特殊双链杂合体，其链不同于通常的单元而是相互平行的(Gaultier等人，1987，NucleicAcidsRes.15:6625-6641)。反义核酸分子也可含有2，-0-甲基核糖核苷(Inoue等人，1987，NucleicAcidsRes.15:6131-6148)或嵌合型RNA-DNA类似物(Inoue等人，1987，FEBSLett.215:327-330)。又在另一个实施方案中，本发明的反义核酸为核酶。核酶为具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，能够裂解与之具有互补区域的单链核酸如mRNA。因此，可以使用核酶(如锤头状核酶(描述于Haselhoff&Gerlach，1988，Nature334:585-591))催化裂解LMPmRNA转录物，由此抑制LMPmRNA的翻译。可以根据本文公开的LMPcDNA核苷紗列(即附录A的BnOl，如优选实施方案中公开的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35)或根据本发明教导方法分离的异源序列，设计对LMP编码核酸具有特异性的核酶.例如，可以构建四膜虫(7^Yi^附e/m)L-19IVSRNA的衍生物，其中活性位点的核苷酸序列与LMP编码mRNA中待切割的核苷酸序列互#(见如Cech等人的美国专利号4，987，071和Cech等人的美国专利号5,116,742)。或者，可以使用LMPmRNA从RNA分子库中选出具有特异性核糖核酸酶活性的催化性RNA(见如Bartel，D.&SzostakJAV.1993，Science261:1411-1418)。或者，可以通过寻靶与LMP核苷酸序列调节区(例如LMP启动子和/或增强子)互补的核苷酸序列，形成可阻断靶细胞中LMP基因转录的三螺旋结构，从而抑制LMP的基因表达(一般参见HeleneC.1991，AnticancerDrugDes.6:569-84;HeleneC.等人，1992，Ann.N.Y.Acad.Sci.660:27-36;以及Maher，L.J.1992，Bioassays14:807-15)。又在另一实施方案中，可使用微RNA技术(BartelD.，Cell,116:281-297,2004)。可设计微RNA前体使其寻靼并下调目的基因的表达。所述前体可显著表达于种子或其他组织中。miRNA(~21-25nt)衍生自较大前体，具有转录自非蛋白质编码基因的茎环结构。miRNA寻靶特定的mRNA以在转录后水平(即降解mRNA)或翻译水平(即抑制蛋白质合成)上抑制基因表达。本发明的另一方面涉及含有编码LMP(或其部分)的核酸的载体，优选表达载体。本文所用的术语"载体"是指能够转运与之相连的其他核酸的核酸分子。一类载体为"质粒"，是指可以连入额外DNA片断的环形双链DNA环。另一类载体为病毒载体，其中额外DNA片断可以连入病毒基因组。某些载体能够在引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体以及游离型哺乳动物载体)。其他载体(如非游离型哺乳动物载体)则在进入宿主细胞后整合入宿主细胞的基因组，从而可随着宿主基因组一同复制。此外，某些载体能够指导与之有效连接的基因的表达。这类载体在本文被称为"表达栽体"，一般而言，用于重組DNA技术的表达栽体通常以质粒的形式存在。在本说明书中，"质粒"和"栽体"可以互换使用，因为质粒是最常用的栽体形式。然而，本发明旨在包括此类具有等同功能的其他形式的表达载体，例如病毒载体(如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，本发明的重组表达栽体包含以适于在宿主细胞中表达的形式存在的本发明的核酸，这意味着重组表达栽体中包含一个或多个与待表达的核^列有效连接的调节序列，所述调节序列的选择根据用于表达的宿主细胞而定。就重组表达栽体而言的"有效连接"，是指目的核苷酸序列与调节序列以允许所述核苷酸序列表达的形式连接，从而两个序列互相融合而各自行使其预期功能(如在体外转录/翻译系统或在引入载体的宿主细胞中)。术语"调节序列"包括启动子、增强子以及其他表达控制元件(例如多聚腺普化信号)。这些调节序列描述于如Goeddel;GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego,CA(1990)或见于Gruber和Crosby的MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnolgy，CRCPress,BocaRaton,Florida编辑Glick&Thompson,第7章，89-108页，包括其中的参考文献。调节序列包括那些能够在许多类型宿主细胞中指导核苷酸序列组成型表达的序列，以及那些只在某些宿主细胞中或某些条件下指导核苷酸序列表达的序列。本领域技术人员将会意识到，表达栽体的设计取决于所要转化的宿主细胞的选择、期望达到的蛋白质表达水平等因素。可以将本发明的表达栽体引入宿主细胞中，从而产生本文所述核酸所编码的蛋白质或肽，包括融合蛋白质或肽(例如LMP、LMP的突变形式、融合蛋白质等)。可设计本发明的重组表达载体用于在原核或真核细胞中表达LMP。例如，可将LMP基因表达于细菌细胞、昆虫细胞(使用杆状病毒表达栽体)、酵母及其他真菌细胞(见Romanos等人，1992，Foreigngeneexpressionmyeast:areview,Yeast8:423國488;在MoreGeneManipulationsinFungi,Bennet&Lasure编，396-428页AcademicPress:anDiego中的vandenHondel，C.A.M.J.J.等人，1991，"Heterologousgeneexpressioninfilamentousfungi";以及AppliedMolecularGeneticsofFungi，Peberdy等人编，1-28页，CambridgeUniversityPress:Cambridge中的vandenHondel和Punt，1991，"Genetransfersystemsandvectordevelopmentforfilamentousfungi");藻类(Falciatore等人，1999，MarineBiotechnology1:239-251);全毛亚纲(Holotrichia)、缘毛亚纲(Peritrichia)、旋唇亚纲(Spirotrichia)、吸管虫类纲(Suctoria)、四膜虫(Tetrahymena)、草履虫(Paramecium)、豆形虫(Colpidium)、瞬目虫(Glaucoma)、匙口虫(Platyophrya)、Potomacus、假康纤虫(Pseudocohnilembus)、游4卜虫(Euplotes)、Engelmaniella以^S^J^虫(Stylonychia)属的纤毛虫，尤其是遵循WO98/01572所述转化方法的带有栽体的浮萍棘尾虫(5^/<w>^/fe附朋e)属的纤毛虫；以及多细胞植物细胞(见Schmidt&Willmitzer，1988，PlantCellRep.:583-586;PlantMolecularBiologyandBiotechnology,CPress,BocaRaton，Florida,6/7章，S.71-119(1993);发表于TransgenicPlants,巻1,EngineeringandUtilization,Kung和Wu编，AcademicPress1993，128-43的White,Jenes等人，"TechniquesforGeneTransfer";Potrykus，1991，Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.42:205誦225(及其中引用的参考文献))或哺乳动物细胞.在Goeddel，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego，CA1990中有对合适宿主细胞的进一步讨论。或者，可以在体外转录并翻译重组表达载体，例如使用T7启动子调节序列和T7聚合酶。通常使用含有能够调控融合或非融合蛋白质表达的组成型或谦导型启动子的载体在原核细胞中表达蛋白质。融合载体向其所编码蛋白质中添加若干氨基酸，通常是添加在重组蛋白质的氨基端，但也可以添加到c-末端或融合入蛋白质的适宜区域。这样的融合载体一般可以实现以下一种或多种目的l)提高重组蛋白的表达；2)提高重组蛋白的溶解性；以及3)作为亲和纯化中的配体协助重组蛋白的纯化。在融合表达载体中，通常在融合部分与重组蛋白的连接处引入蛋白水解裂解位点，以使重组蛋白能够在融合蛋白纯化后与融合部分分离。此类酶及其同源识别序列包括Xa因子、凝血酶和肠激酶。典型的融合表达载体包括分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或蛋白质A与目的重组蛋白融合的pGEX(PharmaciaBiotechInc;Smith和Johnson,1988，Gene67:31-40)、pMAL(NewEnglandBiolabs，Beverly,MA)以及pRIT5(Pharmacia,Piscataway，NJ)。在一个实施方案中，将LMP编码序列克隆到pGEX表达载体中以产生编码融合蛋白的载体，所述融合蛋白从N-末端到C-末端包括GST-凝血酶裂解位点-X蛋白质。可以使用谷胱甘肽-琼脂糖树脂，通过亲和层析法纯化融合蛋白。可以利用凝血酶裂解融合蛋白来回收与GST去融合的重组LMP,合适的非融合大肠杆菌(Eoi/i)诱导型表达载体的实例包括pTrc(Amann等人，1988，Gene69:301-315)和pETlid(Studier等人，19卯，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego，California60-89),pTrc栽体中的把基因表达有赖于杂合trp-lac融合启动子启动的宿主RNA聚合酶转录。而pETlid栽体中的把基因表达则有赖于共表达病毒RNA聚合酶(T7gnl)介导的T7gnl0-lac融合启动子启动的转录。此病毒聚合酶由宿主林BL21(DE3)或HMS174(DE3)从具有处于lacUV5启动子转录控制下的T7gnl基因的定居噬菌体提供。最大化重组蛋白表达的策sM^—是在对所述重组蛋白质的蛋白水解裂解能力缺陷的宿主细菌中表达所述蛋白质(GottesmanS.，19卯，GeneExpressionTechnology:iVi￡""矽附</<^185:119-128，AcademicPress,SanDiego，California),另一策略则为改变欲插A^达载体的核酸的核酸序列，使每一氨基酸的个体密码子为选用于表达的细菌中偏好使用的密码子(Wada等人，1992，NucleicAcidsRes.20:2111-2118)。可以通过标准DNA合成技术完成对本发明核酸序列的此类改动。在另一实施方案中，LMP表达载体为酵母表达载体。可用于在酿酒酵母OS."rev/w'fle)中表达的载体实例包括pY印Secl(Baldari等人，1987,EmboJ.6:229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz，1982，Cell30:933-943)、pJRY88(Schultz等人，1987，Gene54:113誦123)以及pYES2(InvitrogenCorporation,SanDiego,CA)'载体以及构建适用于其他真菌(如丝状真菌)的载体的方法，包括详述于AppliedMolecularGeneticsofFimgi，Peberdy等人编，1-28页，CambridgeUniversityPress:Cambridge中vandenHondel和Punt，1991，"Genetransfersystemsandvectordevelopmentforfilamentousfungi"中的载体和方法，或者，可使用杆状病毒表达载体于昆虫细胞中表达本发明的LMP。可在培养的昆虫细胞(如Sf9细胞)中表达的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等人，1983，Mol.CellBiol.3:2156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers,1989，Virology170:31-39),而在另一实施方案中，使用哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中表达本发明的核酸。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(Seed,1987，Nature329:840)和pMT2PC(Kaufman等人，1987，EMBOJ.6:187-195).当用于哺乳动物细胞时，通常使用病毒调节元件来提供表达栽体的控制功能。例如，常用启动子来源于多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒以及猿病毒40。其他可同时用于原核及真核细胞的合适表达系统，见Sambrook，Fritsh和Maniatis，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989第16及17章。在另一实施方案中，可在单细胞植物细胞(如藻类，见Falciatore等人，1999，MarineBiotechnology1:239-251及其中的参考文献)和高等植物的植物细胞(例如种子植物，如作物植物)中表达本发明的LMP,植物表达载体的实例包括Becker,Kemper,Schell和Masterson(1992，"Newplantbinaryvenctorswithselectablemarkerslocatedproximaltotheleftborder",PlantMol.Biol.20:1195-1197)以及Bevan(1984，"BinaryAgrobacteriumvectorsforplanttransformation,NucleicAcidsRes.12:8711-8721;TransgenicPlants,巻1，EngineeringandUtilization,Kung和R.Wu编辑，AcademicPress,1993，S.15-38中的VectorsforGeneTransferinHigherPlants)中详述的那些.植物表达盒中优选含有有效连接的能够驱动植物细胞中基因表达的调节序列，从而使各序列可行使其功能(如终止转录)，包括多聚腺苷化信号.优选的多聚腺苷化序列来源于才艮癌农杆菌(^gro6flcter/w附似nie/tfcie/M)的t-DNA，如Ti-质粒pTiACH5章鱼碱合成酶的基因3(Gielen等人，l诉4，EMBOJ.3:835)或其功能等效物，而且在植物中具有功能活性的所有其他终止子也适用.由于植物基因表达常常并不仅限于转录水平，植物表达盒优选含有其他有效连接的序列如翻译增强子，如含有烟草花叶病毒5，非翻译前导序列的超驱动序列，从而提高蛋白质/RNA比率(Gallie等人，1987，NucleicAcidsRes.15:8693-8711)。植物基因表达必须与合适的启动子有效连接，所述启动子使基因以适时的、细胞或组织特异性方式表达.优选可驱动组成型表达的启动子(Benfey等人，1989，EMBOJ.8:2195-2202)，如那些来源于植物病毒的启动子，如35SCAMV(Franck等人，1980，Cell21:285-294)、19SCaMV(也见US5,352,605及WO84/02913)，或如来源于1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)小亚基的植物启动子(US4,962,028所述).更优选的为能在种子发育的所有或选择的阶段驱动LMP蛋白质表达的种子特异性启动子。种子特异性植物启动子为本领域普通技术人员公知，并可用种子特异性mRNA文库及表达分型技术对其进行鉴定和表征.种子特异性启动子包括油菜籽的napin基因启动子(US5，608，152)、蚕豆(USP启动子(Baeumlein等人，1991，Mol.Gen.Genetics225:459-67)、拟南芥油体蛋白启动子(WO98/45461)、菜豆(户力flwo/附vw/gflWs)的菜豆蛋白启动子(US5，504，200)、芸莒属Bce4-启动子(WO9113980)或豆球蛋白B4启动子(LeB4;Baeumlein等，1992,PlantJ.2:233-239),以及可赋予单子叶植物如玉米、大麦、小麦、棵麦、稻等种子特异性表达的启动子。需要指出的合适启动子为大麦的Ipt2或lptl基因启动子(WO95/15389和WO95/23230)，或W099/168卯中所述的启动子(大麦的大麦醇溶蛋白基因启动子、稻谷蛋白基因启动子、稻水稻素基因启动子、小麦醇溶蛋白基因启动子、小麦谷蛋白基因启动子、玉米醇溶蛋白基因启动子、燕麦谷蛋白基因启动子、高粱kasirin基因启动子以及棵麦黑麦碱(secalin)基因启动子).也可以通过诱导型启动子促进植物基因表达(综述可见Gatz1997，Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.48:89-108)。化学资导型启动子特别适用于需要以时间特异性方式进行基因表达的情形.此类启动子的实例为水杨酸i秀导的启动子(WO95/19443)、四环素诱导的启动子(Gatz等人，1992，PlantJ.2:397-404)，以及乙醇诱导的启动子(W093/21334)。应答生物或非生物胁迫条件的启动子也是适用的启动子，例如病原诱导的PRP-1基因启动子(Ward等人，1993，Plant.Mol.Biol.22:361-366)、热诱导的番茄hsp80启动子(US5,187,267)、冷诱导的马铃薯ct-淀粉酶启动子(WO96/12814),以及创伤诱导的pinlI-启动子(EP375091)。其他可用于植物基因表达盒的优选序列为将基因产物定向于其适当的细胞区室所必需的靶向序列(综述见Kermode1996，Crit.Rev.PlantSci.15:285-423及其引用的参考文献)，所述细胞区室如液泡、细胞核、所有类型的质体如造粉体、叶绿体、有色体、胞外空间、线粒体、内质网、油体、过氧化物酶体以及其他植物细胞区室.特别合适的启动子为那些赋予启动质体特异性基因表达的启动子，这是因为质体是脂质生物合成中前体及某些终产物合成的场所.合适的启动子如病毒RNA聚合酶启动子，描述于WO95/16783和WO97/06250,而拟南齐的clpP启动子描述于WO99/46394。本发明还提供了重组表达载体，其中含有以反义方向克隆到表达载体中的本发明DNA分子。即DNA分子以允许与LMPmRNA反义的RNA分子表达(通过DNA分子转录)的方式与调节序列有效连接.可以选择可在多种细胞类型中指导反义RNA分子持续表达的序列，作为与反义方向克隆的核酸有效连接的调节序列，如病毒启动子和/或增强子；也可以选择指导反义RNA的组成型、组织特异性或细胞类型特异性表达的调控序列。反义表达载体的形式可为重组质粒、噬菌粒或减毒病毒，其中反义核酸的产生受到高效调节区域的调控，其活性是由引入载体的细胞类型决定的。利用反义基因调节基因表达的讨论见Wdntraub等人(1986,AntisenseRNAasamoleculartoolforgeneticanalysis,Reviews-TrendsinGenetics,巻l)以及Mol等人(1990，FEBSLett.268:427-430)。本发明的另一方面涉及引入了本发明重组表达载体的宿主细胞.本文术语"宿主细胞"和"重组宿主细胞"可互换使用。应当理解这些术语不仅仅指具体的受试细胞，也指该细胞的后代或潜在的后代。在后续世代中由于突变或环境影响会产生某些l奮饰，这样的后代实际上可能与其亲代细胞不相同，但仍包括在本文所用的术语范围内。宿主细胞可以为任何原核或真核细胞，例如，可以在细菌细胞、昆虫细胞、真菌细胞、哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS细胞)、藻类、纤毛虫或植物细胞中表达LMP。其他合适的宿主细胞为本领域技术人员所公知。可以通过常规转化或转染技术将载体DNA引入原核或真核细胞中.本文所用的术语"转化"、"转染"、"接合"与"转导"是指将外源核酸(如DNA)引入宿主细胞的多种本领域公认的技术，包括磷酸钧或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染法、自然感受态、化学介导的转移或电穿孔法。用于转化或转染宿主细胞包括植物细胞的合适方法可见于Sambrook等人(1989，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)以及其他实验手册如MethodsinMolecularBiology，1995,巻44，"Agrobacteriumprotocols",Gartland和Davey编，HumanaPress,Totowa,NewJersey,对于稳定转染哺乳动物及植物细胞而言，已知取决于所用表达栽体和转染技术的不同，仅有一小部分细胞可能将外源DNA整合进自身基因组中。为了鉴定并选出这些整合体，一般将编码可选择标记(如抗生素抗性)的基因与目的基因一起引入宿主细胞。优选的可选择标记包括那些能赋予药物如G418、潮霉素、卡那霉素和氨甲蝶呤抗性的标记，或能在植物中赋予除草剂如草甘膦或草胺磷抗性的标记。可以在编码LMP的同一载体上向宿主细胞中引入编码可选择标记的核酸，或也可使用单独的载体引入，可以通过如药物选择(如整合选择标记基因的细胞能够存活，而其他细胞死亡)的方法鉴定被引入的核酸稳定转染的细胞，为产生同源重组微生物，制备含有至少一部分LMP基因的载体，所述LMP基因中引入了缺失、添加或取代，以改变(如功能性破坏)LMP基因。优选的LMP基因为拟南芥、大豆、稻、玉米、亚麻、大麦或小麦LMP基因，但也可为相关植物或甚至哺乳动物、酵母或昆虫来源的同源物。在优选实施方案中，设计载体使内源性LMP基因在同源重组时被功能性破坏(即不再编码有功能蛋白质；也称为敲除栽体)。或者，可以设计载体，使内源性LMP基因在同源重组时发生突变或其他改变但仍然编码有功能蛋白质(如可以改变上游调节区域而改变内源LMP的表达)。为通过同源重组产生点突变，可在嵌合修复技术中使用DNA-RNA杂合体(Cole-Strauss等人，1999，NucleicAcidsRes,27:1323-1330以及Kmiec1999，AmericanScientist87:240-247)。拟南芥或其他作物中的同源重组方法也为本领域所公知，是本文考虑使用的.在同源重组载体中，LMP基因改变了的部分在其5，和3，末端侧接额外的LMP基因核酸，从而使同源重组可以发生在载体所携带的外源性LMP基因与微生物或植物的内源性LMP基因之间.额外的侧翼LMP核酸的长度足够与内源性基因进行成功的同源重组。一般而言，载体中含有数百g对至数千碱基对的侧翼DNA(同时在5，和3，末端)(见如Thomas和Capecchi，1987,Cell51:503中有关同源重组载体的描述)。将载体引入微生物或植物细胞中(如通过聚乙二醇介导的DNA)。使用本领域公知的技术选出引入的LMP基因与内源性LMP基因发生了同源重组的细胞。在另一实施方案中，可以产生含有能够调节性表达引入基因的选择系统的重组微生物。例如，将载体中的LMP基因置于lac操纵子的调控下，可以使LMP基因仅在IPTG存在时表达。此类调节系统为本领域所熟知。可以使用本发明的宿主细胞(如培养中的原核或真核宿主细胞)生产(即表达)LMP。因此，本发明还提供利用本发明的宿主细胞生产LMP的方法。在一个实施方案中，该方法包括在适当的培养基中培养本发明的宿主细胞(其中已经引入编码LMP的重组表达载体，或该细胞基因组中含有野生型或改变的LMP基因)，直至产生LMP。在另一实施方案中，该方法还包括从培养基或宿主细胞中分离LMP。本发明的另一方面涉及分离的LMP及其生物学活性部分。"分离的"或"纯化的"蛋白质或其生物学活性部分基本不含有使用重组DNA技术生产时的细胞材料，或采用化学合成时的化学前体或其他化学物。用语"基本不含有细胞材料"包括这样的LMP制品，其中该蛋白质与天然或重组产生该蛋白质的细胞的细胞成分分开.在一个实施方案中，用语"基本不含有细胞材料"包括这样的LMP制品，其中非LMP(本文也称为"杂质蛋白质")含量少于约30%(干重)，更优选非LMP含量少于约20。/。，更优选非LMP含量少于约10%,而最优选非LMP含量少于约5。/。.当重组生产LMP或其生物活性部分时，也优选其基本不含有培养基，即培养基少于蛋白质制品总量的约20%,更优选少于约10%,而最优选少于约5%。用语"基本不含有化学前体或其他化学物"包括这样的LMP制品，其中该蛋白质与该蛋白质合成中涉及的化学前体或其他化学物分开。在一个实施方案中，用语"基本不含有化学前体或其他化学物"包括这样的LMP制品，其中含有少于约30V。(干重)化学前体或非LMP化学物，更优选化学前体或非LMP化学物少于约20%,更优选化学前体或非LMP化学物少于约10%,而最优选化学前体或非LMP化学物少于约5%。在优选实施方案中，分离的蛋白质或其生物活性部分中不含有LMP来源相同生物的杂质蛋白质。一般而言，通过如在拟南芥、大豆、稻、玉米、亚麻、大麦或小麦以外的植物或微生物、藻类或真菌中重组表达拟南芥、大豆、稻、玉米、亚麻、大麦或小麦LMP，来制备此类蛋白质.本发明的分离LMP或其生物活性部分能够参与产生拟南芥、大豆、稻、玉米、亚麻、大麦或小麦中种子贮存化合物或细胞膜所必需的化合物代谢，或具有表3列出的一种或多种活性。在优选实施方案中，蛋白质或其部分包含与附录A所示的核酸，如优选实施方案中公开的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35编码的絲醋列基本同源的^ij^^列，从而使该蛋白质或其部分保留了参与拟南芥、大豆、稻、玉米、亚麻、大麦或小麦细胞膜构建或跨膜分子转运所必需的化合物代谢。蛋白质部分优选如本文所述的生物活性部分。在另一优选的实施方案中，本发明的LMP具有由附录A所示核酸，如优选实施方案中公开的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35编码的M紗列。在另一优选实施方案中，LMP具有由核苷酸序列编码的Jl^酸序列，所述核苷酸序列可与附录A所示核苷酸序列，如优选实施方案中公开的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35杂交，例如在严紧条件下杂交。在另一优选实施方案中，LMP具有由核苷酸序列编码的JL&酸序列，所述Jl^酸序列与附录A所示核酸，如优选实施方案中公开的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35编码的M酸序列之间的同源性至少为约50-60%,优选至少约60-70%，更优选至少约70-80%、80-90%或90-95%，也优选至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%，甚至最优选与附录A所示核酸，如优选实施方案中公开的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35编码的M断列之间的同源性至少约96%、97%、98%、99%或更高，优选利用VectorNTISuite9.0的AlignX(2003年8月22日)确定多肽序列的同源性，设定参数如下空位开放罚分10;空位延伸罚分0.05;空位分离罚分范围8;比对延迟的％—致性40。本发明的优选LMP也优选具有本文所述的至少一种LMP活性。例如，本发明的优选LMP包括由可与附录A所示核苷酸序列，如优选实施方案中公开的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35杂交，例如在严格条件下杂交的核苷酸序列编码的M酸序列，且能够参与拟南芥、大豆、稻、玉米、亚麻、大麦或小麦细胞膜构建或跨膜分子转运所必需的化合物代谢，或具有表3列出的一种或多种活性，在其他实施方案中，LMP与附录A所示核酸，如优选实施方案中公开的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35编码的^J^絲列基本上同源，正如前文所详述，虽然在^J^酸序列上由于天然变异或^秀变有所不同，但还是保留了由附录A核紗列，如优选实施方案中公开的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35之一编码蛋白质的功能活性。因此，在另一实施方案中，LMP为含有4^^列的蛋白质，所述氨基酸序列与附录A所示核酸序列，如优选实施方案中公开的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35之一的同源性至少为约50-60%，优选至少约60-70%,更优选至少约70-80%、80-90%或卯-95%,也优选至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91°/o、92%、93%、94%或95%,甚至更为优选与完整ji^酸序列之编码核酸所编码的序列之间的同源性至少约96%、97%、98%、99%或更高，并具有本文所述的至少一种LMP活性。优选利用VectorNTISuite9.0的AlignX(2003年8月22日)确定多肽序列的同源性，设定^如下空位开放罚分10;空位延伸罚分0.05;空位分离罚分范围8;比对延迟的％—致性40。在另一实施方案中，本发明涉及全长拟南芥、大豆、稻、玉米、亚麻、大麦或小麦蛋白质，其与附录A所示的核酸序列，如优选实施方案中公开的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35编码的完整m酸序列基本上同源。可以使用显性失活突变或反式显性抑制来降低LMP在转基因种子中的活性，以改变种子ji&存化合物的水平。为此，产生能够消除LMP活性的突变，并在转基因植物中过表达无活性的非功能性LMP基因。无活性的反式显性LMP蛋白质与活性内源性LMP蛋白质竟争底物或与其他蛋白质发生反应，而稀释活性LMP的活性。通过这一途径可以降低LMP的生物学活性而不必实际改变内源性LMP的基因表达。Pontier等人使用这一策略以调节植物转录因子的活性(PontierD，MiaoZH,LamE，PlantJ.2001Sep.27(6):529-38，Trans-dominantsuppressionofplantTGAfactorsrevealstheirnegativeandpositiverolesinplantdefenseresponses)。LMP同源物可以通过诱变产生，例如不连续点突变或截短LMP。本文所用的术语"同源物"是指用作LMP活性激动剂或拮抗剂的LMP变体形式。LMP激动剂能够保留与LMP基本相同的生物学活性或其活性的子集。LMP拮抗剂能够通过如竟争性结合包括LMP在内的细胞膜成分代谢级M应中的上游或下游成员、或通过与介导化合物跨膜转运的LMP结合来抑制LMP天然形式的一种或多种活性，从而阻止易位的发生。在可选的实施方案中，可以通过在LMP突变体(如截短突变体)组合文库中筛查LMP激动剂或拮抗剂活性，确定LMP的同源物。在一个实施方案中，通过在核酸水平组合诱变构建LMP变体杂合文库，该LMP变异体杂合文库由一个杂合的基因文库编码而成，例如，可以通过将合成寡核苷酸混合物以酶连接于基因序列的方法产生LMP变体杂合文库，从而使一系列简并的潜在LMP序列以单个多肽的形式表达，或者以一系列更大的含所述系列LMP序列的融合蛋白(如对于噬菌体展示文库而言)的形式表达。有很多种方法可以用于从简并的寡核苷酸序列中产生潜在的LMP同源物文库，可以在自动DNA合成仪中完成简并基因序列的化学合成，然后将合成基因连入合适的表达栽体中。使用基因的简并集合可以在一个混合物中提供编码所需潜在LMP序列集合的所有编码序列。合成简并寡核苷酸的方法为本领域所公知(见如Narang，1983，Tetrahedron39:3;Itakura等人，1984，Annu.Rev.Biochem.53:323;Itakura等人，1984，Science198:1056;Ike等人，1983，NucleicAcidsRes.11:477).此外，可以利用LMP编码序列的片断文库建立LMP片断的杂合群，用于筛选及随后选择LMP的同源物。在一个实施方案中，可以用核酸酶在每分子仅发生约一次切口形成的条件下处理LMP编码序列的双链PCR片断，将该双链DNA变性，复性DNA以形成含有来自不同切口产物正义/反义对的双链DNA，用Sl核酸酶处理去除再形成双链体中的单链部分，并将所产生的片断文库连入表达载体，从而建立编码序列的片断文库。通过这种方法，可以产生编码LMPN-末端、C-末端及大小不等的内部片断的表达文库。已知本领域有若干技术可用于筛选通过点突变或截短产生的组合文库的基因产物，以及在cDNA文库中筛选具有所选性质的基因产物。这些技术适用于快速筛选由组合诱变LMP同源物产生的基因文库，最广泛用于高通量分析筛查大型基因库的技术一般包括将基因文库克隆到可复制的表达载体中，用所得的栽体文库转化适当的细胞，并在一定条件下表达组合基因，所述条件下，目的活性的检测有助于分离编码其产物被检测的基因的载体。递归整体诱变(recursiveensemblemutagenesis,REM),—项負巨够增加文库中功能性突变体频率的新技术，也可与筛查测定法组合使用鉴定LMP同源物(Arkin&Yourvan，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:7811-7815;Delgrave等人，1993，ProteinEngineering6:327-331)'在另一实施方案中，可以使用本领域熟知的方法，利用基于细胞的测定法分析杂合LMP文库。本文所述的核酸分子、蛋白质、蛋白质同源物、融合蛋白质、引物、载体以及宿主细胞可以用于以下一种或多种方法鉴定拟南芥、大豆、稻、玉米、亚麻、大麦或小麦及相关生物；绘制拟南芥、大豆、稻、玉米、亚麻、大麦或小麦相关生物的基因组图镨；鉴定并定位拟南芥、大豆、稻、玉米、亚麻、大麦或小麦目的序列；进化研究；确定LMP功能所需的区域；调控LMP活性；调控一种或多种细胞功能的代谢；调控一种或多种化合物的跨膜转运；以及调控种子贮存化合物的积累。植物拟南芥代表了高等(或种子)植物的一员。它与如欧洲油菜、大豆、稻、玉米、亚麻、大麦或小麦等其他植物相关，都需要光来驱动光合作用及生长，植物如拟南芥、欧洲油菜、大豆、稻、玉米、亚麻、大麦或小麦在DNA序列和多肽水平上具有高度同源性，从而能够利用其他植物或生物来源的探针对DNA分子进行异源筛选，进而能够导出共有序列，其适于在第三物种中异源筛选或解释功能并预测基因功能。因此，鉴定这类功能的能力具有重要实用性，如预测酶的底物特异性。此外，这些核酸分子可以用作绘制拟南芥基因组或相关生物基因组图镨的参照点。本发明的LMP核酸分子具有多种用途。首先，本发明的核酸及蛋白质分子可作为基因组特定区域的标志。这不仅可用于绘制基因组图谙，也可用于拟南芥、欧洲油菜、大豆、稻、玉米、亚麻、大麦或小麦蛋白质的功能研究，例如，为了鉴定某一特定的拟南芥、欧洲油菜、大豆、稻、玉米、亚麻、大麦或小麦DNA结合蛋白的基因组结合区域，可以消化拟南芥、欧洲油菜、大豆、稻、玉米、亚麻、大麦或小麦的基因组，并将其片断与DNA结合蛋白孵育.可另外用本发明的核酸分子(优选具有易检测标记的核酸分子)作为探针与那些与蛋白质结合的片断杂交；此类核酸分子与基因组片断的结合能够在拟南芥、欧洲油菜、大豆、稻、玉米、亚麻、大麦或小麦的基因组图谱上定位该片断，而且当用不同的酶进行多次重复时，还有助于快速确定蛋白质结合的核酸序列。此外，本发明的核酸分子可能与相关物种的序列有充分的同源性，使得这些核酸分子可以用作构建相关植物基因组图镨的标记物，本发明的LMP核酸分子也可用于进化和蛋白质结构研究。多种原核及真核细胞使用本发明分子所参与的代谢和转运过程；通过比较本发明的核酸分子序列与其他生物中那些编码相似酶的核酸分子序列，能够评价生物之间的进化相关性，与之类似，这样的比较能够评价序列中哪些为保守区域而哪些不是，可能有助于确定那些对于酶功能至关重要的蛋白质区域。这类确定对于蛋白质遗传工程研究具有一定价值，可能会提示该蛋白质在不丧失功能的前提下能够耐受怎样的诱变。对于本发明LMP核酸分子的操作可能会导致产生与野生型LMP功能有所差异的LMP。这些蛋白质可能在效用或活性上有所改善、可能在细胞中以高于正常的量存在，也可能效用或活性有所降低。本发明LMP的改变可以通过几种机制直接影响种子储存化合物的累积和/或成分。在表达LMP的植物中，转运的增加会导致化合物累积的改变和/或植物组织及器官中的溶质分配(partitioning)，最终在种子发育过程中影响一种或多种种子贮存化合物的累积。Mitsukawa等人(1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:7098-7102)提供了一个实例，其中在烟草培养细胞中过表达拟南芥高亲和力磷酸盐转运蛋白基因，增强了磷酸盐限制条件下的细胞生长。磷酸盐的可利用性也显著影响糖和代谢中间物的产生(Hurry等人，2000，PlantJ.24:383-396)以及叶和根中的脂质组成(Hartel等人，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:10649-10654)。与之类似，已经证实植物乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)的活性受到磷酸化调节(Savage和Ohlrogge，1999，PlantJ.18:521-527)，且作用于ACCase的激酶和磷酸酶(LMP)的活性改变，会导致种子脂质累积水平的提高或降低，此外，叶绿体包膜上存在脂质激酶活性提示信号转导路径和/或膜蛋白质的调节发生在包膜上(见如Mttller等人，2000，J.Biol.Chem.275:19475-19481及其中所引文献),^Bi7和基因编码的两个蛋白质丝氨^/苏氨酸磷酸酶2C为脱落酸代谢途径的调节物，因此见于种子发育的早期和晚期阶段(如Merlot等人，2001，PlantJ.25:295-303),更多实例也可见前文"发明背景"章节。本发明也提供了可与本文公开或描述的核酸编码的LMP多肽或其部分特异性结合的抗体.可以通过许多众所周知的方法制备抗体(见如Harlow和Lane,Antibodies;ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork,1988)。简言之，可将纯化抗原以足以亂《免疫反应的量和间隔注射到动物体内.可直接纯化抗体，也可从动物中获取脾细胞。然后将这些细胞与永生化细胞系融合并筛查其抗体分泌.这些抗体可以用于筛选核酸克隆文库以寻找分泌该抗原的细胞.随后可对阳性克隆进行测序(见如Kelly等人，1992，Bio/Technology10:163-167;Bebbington等人，1992，Bio/Technology10:169-175)。短语与多肽"选择性结合"是指能对蛋白质在异源蛋白质和其他生物制品群中是否存在具有确定性的结合反应。因此，在指定的免疫测定条件下，与特定蛋白质结合的具体抗体并不会与该样品中的其他蛋白质发生显著量的结合。在此类条件下与抗体的选择性结合可能需要选择一种对特定蛋白质有特异性的抗体。有很多免疫测定方法可用于选择能够与特定蛋白质选择性结合的抗体。例如，常规〗吏用固相ELISA免疫测定法逸择可与蛋白质发生选择性免疫反应的抗体。见Harlow和Lane，"Antibodies,ALaboratoryManual"ColdSpringHarborPublications,NewYork(1988)中关于可用于测定选择性结合的免疫测定方法和条件的描述。某些情况下需要从多种宿主中制备单克隆抗体。制备此类单克隆抗体的技术描述可见于Stites等人编"BasicandClinicalImmunology,"(LangeMedicalPublications,LosAltos，Calif"第四版)及其所引参考文献，以及Harlow和Lane("Antibodies,ALaboratoryManual"ColdSpringHarborPublications,NewYork,1988),本申请参考了多种出版物。所有这些出版物及其中所引用的参考文献的公开内容在此申请中全文引用作为参考，以便更详细地说明本发明所属领域的状况.对本领域技术人员而言，显然可以对本发明进行多种修饰和改变而不背离本发明的范围或精神。参考本文公开的说明和本发明的实施，本发明的其他实施方案对于本领域技术人员而言是显而易见的，应当理解说明书和实施例均为例示性的，本发明的确切范围和精神参见本文的权利要求书。实施例实施例l:一般步骤a)—般克隆步骤根据Sambrook等人(1989，ColdSpringHarborLaboratoryPress:ISBN0-87969-309-6)或Kaiser、Michaelis和Mitchell(1994，MethodsinYeastGenetics,ColdSpringHarborLaboratoryPress:ISBN0-87969-451-3)中所述进行克隆步骤，例如限制性切割、琼脂糖凝胶电泳、DNA片断纯化、转运核酸至硝化纤维素和尼龙膜上、DNA片断连接、大肠杆菌和酵母细胞的转化、细菌生长以及重组DNA的序列分析。b)化学物质若非文中另有说明，所用化学物为来自Fluka(Neu-Ulm)、Merck(Darmstadt)、Roth(Karlsruhe)、Serva(Heidelberg)以及Sigma(Deisenhofen)公司的p.a.级产品。使用来自Milli-Q水系统水纯化工厂(Millipore，Eschborn)的纯化的无致热原的水(下文称为1120)配制溶液。限制性内切酶、DNA修饰酶以及分子生物学试剂盒获自AGS(Heidelberg)、Amersham(Braunschweig)、Biometra(G8ttingen)、Boehringer(Mannheim)、Genomed(BadOeynnhausen)、NewEnglandBiolabs(Schwalbach/Taunus)、Novagen(Madison,Wisconsin,USA)、Perkin嗎Elmer(Weiterstadt)、Pharmacia(Freiburg)、Qiagen(Hilden)及Stratagene(Amsterdam,Netherlands)公司.除非另有说明，均根据生产商的说明使用它们。c)植物材料和生长拟^不孩游对于该研究，使用拟南芥野生型和/m/2突变体(如Miquel&Browse,1992，JBiolChem267:1502-1509中所述)植物的根材料、叶、长角果和种子。将野生型和/</2突变体拟南芥种子在4t:黑暗中预温育三天后置于60-80nmolnr、J光子通量密度、16小时(22t！)光照期和8小时黑暗期(18匸)的培养箱(AR-75，PercivalScientific,Boone，IA)中，所有的植物在pH6.2、2%蔗糖和1.2。/。琼脂的半浓度MS培养基(Murashige&Skoog，1962，i^"io/:/V朋t15:473-497)上发芽。种子在20%漂白剂0.5%tritonx100中灭菌20分钟并用过量的无菌水冲洗6次。植物如上所述或在如Klaus等人(2002，PlantPhysiol.128:885-895)所述标准条件下在土壤中生长。M究使用大豆变种Resnick创建cDNA文库。从某些情况下经暗、盐、热和旱处理的植物中收集种子、种荚、花、叶、茎及根组织。在某些情况下，植物也经线虫感染。然而，本研究集中研究种子和种荚组织在cDNA文库中的用途。对植物打上标签，在开花期后固定日期收获种子5-15天、15-25天、25-35天及33-50天。潜本研究使用粳稻日本晴变种(Oiyztfsflft'vflssp.Japonicacv.Nippon-barre)创建cDNA文库。从某些情况下经暗、盐、热和旱处理的植物中收集种子、种荚、花、叶、茎及根组织。本研究集中研究种子胚组织在cDNA文库中的用途。分别收集胚和胚乳以防胚乳组织可能干扰RNA提取。植物生长于85。F温室Wisconsin土壤中(高有机物含量)，光周期为14h,从发育的种子中切下稻胚，使用玉米杂交林B73xMo17及B73近交系(杂交抹B73xMo17的雌性近交亲本)创建cDNA文库.收集植物的果实或种子(受粉后1至9天的受精卵/幼粒；受粉后23天的乳熟期谷粒R3，早期淀粉生成；大田生长植物受粉后30天的蜡熟初期谷粒(R4),具有淀粉颗粒及发育良好的胚；发泡期(blister)的极幼粒R2，水胚乳I;受粉后36天的顶凹初期(earlydentstage)谷粒(R5)，胚乳变得坚实；B73近交，受粉后9天及19天的谷粒)、花(穗发育6cm(V10)及以上的穗，包括开花，受粉后44至70天；耳穗发育耳穗抽穗2cm(V13)及以上，包括抽穗丝(未受粉)，受粉后51至70天)、叶/芽/花结(所有种子填充前的混合期；包括大田中抽穗前的a)3叶植物(V3)、b)6叶植物(V6)及c)较老叶源(地面第3)的叶)、茎(2至5叶植物的地下部分；受粉后13至29天的大田生长植物，除去根和大部分叶组织；大田生长植物受粉后56至84天，抽穗期和种子填充期(乳熟期)穗附近的茎组织)和根组织(从幼年至中年植物来自受粉后12至35天的幼苗、6叶植物和9叶植物)。亚4^研究使用亚麻变种00-44427及变种00-44338(来自Sval6fWeibull收藏)创建cDNA文库。植物在19t;生长于冷却温室腔内2升罐的罐装土壤内，其中含有5ml奥绿肥Osmocote/升土壤。在15daa(胚处于急速增长期，约占据种子的2/3;鱼雷晚期胚为绿色)、25daa(胚完全伸长且宽度增加，整个种子变得充实；胚仍为复绿色)及33daa(种子开始成熟；胚的颜色变为淡绿且尖部为黄色)时从发育的种子中收集材料。义老;Mf究使用大麦变种Morex创建cDNA文库。植物在15h光周期下生长于温室的metromix中，日间温度23X:而夜间18X:。谷粒处于水熟期至乳熟晚期.谷穗中至上部基本被收获.在种植75天后收集种子材料。小老^研究使用小麦变种Galeon创建cDNA文库.从某些情况下经暗、盐、热和旱处理的植物中收集种子、花、果实、叶、茎及根组织。植物在12h光周期下生长于温室的metromix中，日间温度72°F而夜间65°F.实施例2:从植物中分离总DNA分离总DNA的细节涉及处理lg鲜重的植物材料.CTAB緩冲液2%(w/v)N-鲸蜡基-N，N，N-三甲基溴化铵(CTAB);100mMTrisHC1pH8.0;1.4MNaCl;20mMEDTA.N-十二烷基肌氨酸緩沖液10%(w/v)N-十二烷基肌氨酸；100mMTrisHC1pH8.0;20mMEDTA。将植物材料于液氮中用研钵研磨为细粉，并将其转移至2mlEppendorf管中。随后用一层1ml的分解緩沖液(lmlCTAB緩沖液，100piN-十二烷基肌氨酸緩沖液，20filp-巯基乙醇以及10mg/ml的蛋白酶K溶液10覆盖冰冻植物材料，并在60X:连续振荡孵育1小时。将所得匀浆分装到两个Eppendorf管(2ml)中，并用相同体积的氯仿/异戊醇(24:l)振荡抽提两次。每次均在8000g、室温离心15分钟，使两相分开。然后使用水冷的异丙醇在-70t:沉淀DNA30分钟。将沉淀的DNA在4X:、10,000g离心30分钟沉淀，并重悬于180plTE緩冲液中(Sambrook等人，1989，ColdSpringHarborLaboratoryPress:ISBN0-87969-309-6)。为进一步纯化，用NaCl(终浓度1.2M)处理DNA，并用两倍体积的无水乙醇在-70X:再次沉淀30分钟。用70%乙醇洗涤后，干燥DNA并随即溶于50piH20+RNAse(终浓度50mg/ml)。DNA在4t:溶解过夜，并于其后在37匸进行RNAse消化1小时，41C保存DNA。实施例3:从植物中分离总RNA及poly-(A)+RNA分离总RNA及poly-(A)+RNA以研究转录物。根据以下方法从拟南芥植物的长角果中分离RNA:从拟南芥种子中制备RNA——"热"提取緩沖液、酶及溶液2MKC1蛋白酶K笨酚(RNA用)氯仿:异戊醇(苯酚:氯仿1:1;调节pH适于RNA)4MLiCl，DEPC处理的DEPC处理水3MNaOAc，pH5，DEPC处理的异丙醇70%乙醇(DEPC处理水配制)重悬浮緩冲液0.5%SDS，10mMTrispH7.5，DEPC处理水配制的1mMEDTA(因为该溶液无法用DEPC处理)提取緩冲液0.2M硼酸钠30mMEDTA30mMEGTA1%SDS(每2.5ml緩冲液250pi10%SDS溶液)1%脱氧胆酸盐(2.5ml緩沖液25mg)2%PVPP(不可溶——每2.5ml緩冲液50mg)2。/。PVP40K(每2.5ml緩冲液50mg)10mMDTT100mMp-巯基乙醇(现配，烟熏罩下处理——每5ml緩冲液使用35jill4,3M的溶液)提取加热提取緩冲液至80C在液氮冷却的研钵中研磨组织，并将组织粉末转移到1.51111管中.冷冻保存组织直至加入緩冲液；转移样品应当使用预冷的匙突；而管应当时刻保留在液氮中。然后向管中加入350pl预热的提取援沖液(对于较大样品，每100mg组织加入緩冲液体积可大至500Hl)，振荡，将管加热至801C约1分钟后置于冰上。振荡样品并用电研钵再次研磨。消化加入蛋白酶K(0.15mg/100mg组织)，振荡并在37匸放置1小时。一次纯化加入27pl2MKC1，在水上冰冻10分钟，随后以12,000rpm于室温离心10分钟。然后将上清液转移到不含RNAase的新管中，并进行一次苯酚抽提，然后用氯仿:异戊醇抽提。向上清液中加入l体积异丙醇，在冰上水冻混合物10分钟。通过离心(室温7000rpm，10分钟)沉淀RNA。振荡混合物10至15分钟，将沉淀溶解于1ml4MLiCl溶液中。离心5分钟沉淀RNA。二次纯化将沉淀重悬于500jd重悬緩沖液中。加入500jil苯酚并振荡之。然后加入250jil氯仿:异戊醇并振荡；离心5分钟，将上清液转移至新管中。重复氯仿:异戊醇抽提直至界面清晰。将上清液转移到新管中并加入1/10体积pH为5的3MNaOAc以及600fil异丙醇。在-20t!保存混合物20分钟或更久。离心10分钟沉淀RNA，并用70%乙醇将沉淀洗涤一次。除去所有剩余乙醇后将沉淀溶解在15至20filDEPC处理水中。在260nm和280nm处测量1:200稀释液的吸光度，对RNA定量定性(40照RNA/ml=1OD雄)。如(Hosein，2001，PlantMol.Biol.Rep.19，65a國65e;Ruuska,S.A.，Girke，T"Benning，C.，&Ohlrogge，J.B.，2002，户/朋-Ce//14，1191-1206)所述，分离来自野生型拟南芥的RNA.利用AmershamPharmaciaBiotechmRNA纯4匕试剂盒(运用oligo(dT)-纤维素柱)从总RNA中制备mRNA。按照生产商说明使用DynaBeads(Dynal，Oslo,Norway)分离poIy-(A)+RNA。确定RNA或poly-(A)+RNA的浓度后，加入1/10体积pH4.6的3M醋酸钠及2倍体积乙醇沉淀RNA,并于-70XM呆存。义_^、裙，；^、亚4、义^-戈V、老从种荚中分离出大豆和亚麻的种子以产生种子和种荚cDNA文库所需的匀浆材料。在液氮下用研钵和研杵将组织研磨为细粉，并转移到50ml管中。将组织样品贮存于-8ox:直至进行提取。对于稻而言，通过切割分离5K-10K胚和胚乳。切割时将组织置于冰上的小管或petri盘中。容器置于干冰上，然后保存于-80'C。对于玉米而言，在液氮下用研钵和研杆将组织研磨为细粉，并转移到50ml管中。将组织样品贮存于-80lC直至进行提取。对于大麦而言，割下麦穗(约2英寸部分)以得到指定阶段的小花。修整去掉所有的芒。所选的阶段为种子填充早/中期。种子组织cDNA文库麦粒或处于水熟期或处于乳熟期，对于小麦而言，将Galeon小麦种子的种子萌发样品种植于20"x12"的metromix上深度2"处。土壤充分吸收水分，然后每天施水两次.当3-4天后胚芽鞘为约lcm时，用水洗涤幼苗并吸干水分(blotted),为建立花cDNA文库，于麦穗从鞘中出现30%、60%及100%时的两天中每一天均收集等数量的麦穗。此时尚未出现花粉嚢。为了建立种子組织cDNA文库，麦粒为水熟期或乳熟期，才艮据麦粒在麦穗上的位置而定；对于晚期种子发育阶段仅收集麦穗。对于根文库仅收集根.植物具有一主干和三根坚实的分蘖，植物生长于罐中，洗去培养基并保留根作为样品。对植物不作处理。根据生产商说明利用RNeasyMaxi试剂盒(Qiagen)从组织中提取总RNA，同时也根据生产商说明利用OligotexmRNA纯化系统试剂盒(Qiagen)从总RNA中加工出mRNA,mRNA送往HyseqPharmaceuticalsIncorporated(Sunnyville，CA)，以进一步将每一组织类型来源的mRNA加工为cDNA文库，并用于其特有的方法，其中基于杂交类型对于类似的质粒插入物进行聚类化，实施例4:构建cDNA文库为构建cDNA文库，使用鼠白血病病毒逆转录酶(Roche，Mannheim,Germany)以及oligo(dT)引物合成第一链，于12匸(2小时)、16"(l小时)和22'C(1小时)与DNA聚合酶I、Klenow酶和RNA酶H消化产物孵育，制备第二链。在651C孵育(10分钟)终止反应后转移至水上。利用T4DNA聚合酶(Roche，Mannheim)在(30分钟)钝化双链DNA分子。通过酚/氯仿抽提以及SephadexG50旋转柱除去核苷酸。用T4DNA连接敏Roche，12匸过夜贿EcoRI接纳体(Pharmacia，Freiburg,Germany)连接到cDNA末端上，并与多核苷酸激酶孵育(Roche，37匸，30分钟)进行磷酸化。用低熔点琼脂糖凝胶分离该混合物。从凝胶中洗脱大于300#对的DNA分子、苯酚抽提、在Elutip-D柱(Schleicher和Schuell，Dassel，Germany)上浓缩、与载体臂连接，并根据生产商的说明，利用GigapackGold试剂盒(Stratagene，Amsterdam,Netherlands)及材料将之装入kZAPII噬菌体或XZAP表达噬菌体。大豆、稻、玉米、亚麻、大麦和小麦cDNA文库产生于HyseqPharmaceuticalsIncorporated(Sunnyville，CA)。文库建立中未使用扩增步骤以保留表达信息。Hyseq的基因组方法包括将这些基因分组聚类，并测序每一聚类的代表成员.从oligodT柱纯化的mRNA中产生cDNA文库.随机挑取cDNA文库转化大肠杆菌的菌落，通过PCR扩增其cDNA插入物，并点样于尼龙膜上，用一套"-P放射性标记的寡核苷酸与克隆杂交，并确定产生杂交的类型中特定的克隆属于哪一聚类.获取cDNA克隆及其DNA序列，用于在转基因植物中过表达及本文所述的其他分子生物学方法。实施例5:鉴定E4Z)2样目的LMP基因拟弟不使用拟南芥野生型和拟南芥/fl^突变体鉴定LMP编码基因，i^D2基因已克隆并描述(JOkuley，JLightner，KFeldmann，NYadav，ELark，&JBrowse,PlantCell6:147-158，1994)。/^4ZX2编码微粒体脂肪酸A6-去饱和酶，所述酶向油酸(C18:1^)结合卵磷脂的A12位插入双键以产生亚油酸(C18:2A9，12),因此也称为12-去饱和酶.i^LD2是拟南芥基因组中的单个基因。义i、萄、^^、亚4、义^和小老本实施例说明了如何鉴定并分离编码大豆、稻、玉米、亚麻、大麦和小麦FAD2样多肽的cDNA克隆。为在适当数据库中鉴定样基因，利用BLAST软件(BasicLocalAlignmentSearchTool,2.2.6版本,Altschul等人，1997，NucleicAcidRes.25:3389-3402)进行相似性分析。除e值阈值(le-10)外均使用默认设置，所有蛋白质搜索均利用BLOSUM62矩阵完成。使用拟南芥FAD2多肽的氨基酸序列为搜索查询条件，并利用TBLASTN算法比对大豆、稻、玉米、亚麻、大麦及小麦中在所有六个读框中翻译的DNA数据，此类对BPS内部数据库的相似性分析鉴定到众多的EST和cDNA重叠群。使用从Hyseq聚类方法得到的RNA表达谦数据确定器官特异性。选择种子文库相对其他组织文库表达更多的克隆为LMP候选基因。才艮据其表达镨，选择大豆、稻、玉米、亚麻、大麦和小麦克隆在拟南芥以及特定作物植物中过表达。实施例6:克隆鉴定的LMP基因的全长cDNA及直系同源物已在内部专有Hyseq数据库中鉴定了对应拟南芥、大豆、稻、玉米、亚麻、大麦或小麦全长序列和部分cDNA的克隆。利用ABI377板式凝胶测序仪及BigDyeTerminatorReadyReaction试剂盒(PEBiosystems，FosterCity,CA)对大豆、稻、玉米、亚麻、大麦及小麦的Hyseq克隆中DNA标志处进行测序.进行序列比对以确定Hyseq克隆是否为全长或部分克隆。当确定Hyseq克隆为部分cDNA时，使用以下方法分离全长序列。利用在5，和3，端均可进行cDNA末端快速扩增(RACE)的Clontech的SMARTRACEcDNA扩增试剂盒，通过RACEPCR分离全长cDNA。根据Hyseq克隆序列设计RACEPCR引物。根据生产商的条件进行全长cDNA的分离和RACEPCR方法的使用，利用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)从琼脂糖凝胶中提取RACE产物片断，并按照生产商的说明连入TOPOpCR2.1载体(Invitrogen)。在标准条件(Sambrook等人，1989)下将重组载体转化入TOP10细胞(Invitrogen)。转化细胞在37t:、含50jig/ml卡那霉素的LB琼脂中生长过夜，并涂布40jil40mg/mlX-gal的二甲基曱酰胺贮液，进行蓝白篩选。选择单个白色菌落并用其接种3ml含50ng/ml卡那霉素的液体LB，在37t:生长过夜。才艮据生产商说明，使用QIAprepSpinMiniprep试剂盒(Qiagen)提取质粒DNA。根据标准分子生物学技术进行后续的克隆分析和限制性酶切图镨绘制(Sambrook等人，1989)。通过使用下列方法分离全长cDNA并克隆进二元载体使用得自Hyseq克隆的全长序列或后来的RACE扩增产物设计基因特异引物。以Hyseq克隆或cDNA文库为DNA模板使用降落PCR(touch-downPCR)扩增全长序列和基因。在一些情况下，设计引物向基因起始密码子紧邻上游添加"AACA"Kozak样序列，且在一些情况下下游的两个碱基改变为GC以促进提高基因表达水平(Chandrashekhar等人，1997，PlantMolecularBiology35:993-1001)。PCR反应循环为94X2，5分钟；94X3，1分钟,65^,1分钟，721C，4分钟，9个循环，其中退火温度每循环降低ir;;94匸，1分钟，55X:,1分钟,72X:，4分钟,20个循环；72;10分钟结束PCR循环。使用GenElute-EtBr旋转柱(Sigma)在1%琼脂糖凝胶上凝胶纯化扩增的PCR产物，并在标准酶促消化后连接至植物二元载体pBPS-GBl上，用于转化拟南芥。二元栽体通过在LB培养基和合适的抗生素中在大肠杆菌DH5中过夜培养扩增，并使用QiagenMiniPr印DNA制备试剂盒制备质粒用于后续步骤。在多个克隆步骤中均通过用限制性消化确定插入物大小来确认插入物，并测序插入物以保证拟南芥转化中使用预期的基因。基因序列可用于鉴定cDNA或基因组文库中的同源或异源基因(直向同源物，来自其他植物的相同LMP基因)。可以通过设计由多重序列比对确定的保守序列的PCR引物完成该鉴定。常通过设计目的基因的全长或部分序列的简并引物鉴定直向同源物.基因序列可用于鉴定cDNA或基因组文库中的同源物或直向同源物。利用如cDNA文库等通过核酸杂交，可以分离同源基因(如全长cDNA克隆)才艮据目的基因的丰度不同，铺板100,000至1，000，000个重组噬菌体并转移至尼龙膜。碱变性后，通过如紫外线交联将DNA固定在膜上。在高度严紧条件下进行杂交。在1MNaCl离子强度、温度68n进行水性溶液杂交和洗涤。通过如放射性("P)缺刻转录标记制备杂交探针(HighPrime,Roche,Mannheim,Germany)。自显影法检测信号。可以通过类似上述的方法，在低严紧杂交和洗涤条件下鉴定相关但不相同的部分同源或异源基因。对于水相杂交，离子强度一般保持在1MNaCl，而温度则逐渐从68t:降至42X:。可以使用合成的放射性标记寡核苷酸探针，分离仅在一个截然不同的结构域(如10-20个氨基酸)上具有同源性(或序列同一性/相似性)的基因序列。通过用T4多核苷酸激酶砩酸化两条互补的寡核苷酸的5-引物端，制备放射性标记的寡核苷酸。退火并连接互补的寡核苷酸以形成串联体。然后通过如缺刻转录放射性标记双链串联体，通常使用高寡核苷酸浓度，在低严紧条件下进行杂交。jT祐夯磁染it溶濕.-6xSSCM磷酸钠mMEDTA(pH8)0.5%SDS100ng/ml变性鲑精DNA0.1%脱脂奶粉在杂交过程中，逐步将温度降至估算的寡核苷酸Tm以下5-10C或降至室温，然后进行洗涤步骤和放射自显影。在低严紧条件下洗涤，例如使用4xSSC进行3步洗涤.更多细节述于Sambrook等人(1989，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress),或Ausubel等人(1994，"CurrentProtocolsinMolecularBiology",JohnWiley&Sons)。实施例7:用抗体筛选表达文库来鉴定目的基因cDNA克隆可用于在如大肠杆菌(如QiagenQIAexpresspQE系统)中产生重组蛋白。然后一般使用Ni-NTA亲和层析(Qiagen)对重组蛋白进行亲和纯化。通过使用如兔免疫标准技术，可将重组蛋白用于产生特异性抗体。使用以重组抗原饱和的Ni-NTA柱(如Gu等人，1994，BioTechniques17:257-262所述)，对抗体进行亲和纯化。此后可通过免疫篩选(Sambrook等人，1989，"MolecularCloning:ALaboratoryManual",ColdSpringHarborLaboratoryPress;或Ausubel等人，1994，"CurrentProtocolsinMolecularBiology,"JohnWiley&Sons)，将抗体用于筛选表达cDNA文库以鉴定同源或异源基因。实施例8:Northern杂交为进行RNA杂交，如Amasino(1986，Anal.Biochem.152:304)所述，使用甲醛在1.25%的琼脂糖凝胶中电泳分离20吗总RNA或1Jigpoly-(A)+RNA，使用10><SSC，通过毛细吸引将其转移到带正电的尼龙膜(HybondN+，Amersham，Braunschweig)上，用紫外线固定，并使用杂交緩冲液(10%硫酸右旋糖酐w/v，1MNaCl，1%SDS，100jig/ml鯡精DNA)在68匸预杂交3小时.在预杂交中使用a-32PdCTP(Amersham，Braunschweig,Germany)、HighprimeDNA标记试剂盒(Roche，Mannheim,Germany)标记DNA探针。在相同緩冲液中加入经标记的DNA探针，于68C杂交过夜。68XM吏用2xSSC、15分钟洗涤两次，1xSSC、1%SDS、30分钟洗涤两次。密封滤膜于-70X:膝光，为期1至14天。实施例9:DNA测序和计算机功能分析cDNA文库可用于根据标准方法进行DNA测序，特别是通过使用ABIPRISMBigDyeTerminatorCycleSequencingReadyReaction试剂盒(Perkin-Elmer，Weiterstadt，Germany)的链终止法，从cDNA文库回收制备质粒后通过体内大量切割进行随机测序、重转化，随后在琼脂平板上涂布DH10B(材料和方案细节来自Stratagene，Amsterdam,Netherlands).可从用含氨爷青霉素的Luria-Broth培养基过夜培养的大肠杆菌培养物中制备质粒DNA(参阅Sambrook等人(1989，ColdSpringHarborLaboratoryPress:ISBN0-87969-309-6)关于根据生产商方案的QiageneDNA制备机器人(Qiagen，Hilden))。可使用由Bio-Max(Munich,Germany)商业提供的软件包EST-MAX处理并注释序列。该程序包含了所有对蛋白质序列功能及结构表征有重要意义的生物信息学方法。参见/t加.v/pgfto/iA附/卵,A/fc/;g抓/M/lg.fife.EST-MAX中并入的最为重要的算法有FASTA:高度敏感的蛋白质序列数据库检索，附统计学显著性评价(PearsonW.R.19卯，RapidandsensitivesequencecomparisonwithFASTPandFASTA.MethodsEnzymol.183:63-98);BLAST:高度敏感的蛋白质序列数据库检索，附统计学显著性评价(AltschulS.F.，GishW.，MillerW.，MyersE.W.和LipmanD丄Basiclocalalignmentsearchtool.J.Mol.Biol.215:403-410);PREDATOR:高精确度单个及多个序列的二级结构预测(Frishman和Argos1997，75%accuracyinproteinsecondarystructureprediction.Proteins27:329-335);CLUSTALW:多重序列比对(Thompson，J.D.，Higgins，D.G和Gibson,T.J.1994，CLUSTALW:improvingthesensitivityofprogressivemultiplesequencealignmentthroughsequenceweighting,positions-specificgappenaltiesandweightmatrixchoice,NucleicAcidsRes.22:4673-4680);TMAP:多重比对序列的跨膜区域预测(PerssonB.和ArgosP.1994，Predictionoftransmembranesegmentsinproteinsutilizingmultiplesequencealignments,J.Mol.Biol.237:182-192);ALOM2:单个序列的跨膜区域预测(KleinP"KanehisaM.和DeLisiC.1984，Predictionofproteinfunctionfromsequenceproperties:Adiscriminantanalysisofadatabase.Biochim.Biophys.Acta787:221-226.Dr.K.Nakai第2版)；PROSEARCH:PROSITE蛋白质序列模式检测(KolakowskiL.F.Jr.,LeunissenJ.A.M.和SmithJ.E.1992，ProSearch:fastsearchingofproteinsequenceswithregularexpressionpatternsrelatedtoproteinstructureandfunction.Biotechniques13:919-921);BLIMPS:针对无空位构件(ungappedblocks)数据库的相似性搜索(Wallace和Henikoff1992,PATMAT:Asearchingandextractionprogramforsequence,patternandblockqueriesanddatabases,CABIOS8:249-254.BillAlford执笔)'实施例10:进行植物转化的质粒可4吏用诸如pBinAR的二元载体转化植物(H6fgen&Willmitzer1990，PlantSci.66:221-230)。将cDNA以正义或反义方向连入T-DNA，构建二元载体。cDNA5，端的植物启动子激活cDNA的转录。多聚腺苷化序列定位于cDNA的3，端。可使用组织特异性启动子进行组织特异性表达。例如将napin或LeB4或USP启动子克隆入cDNA5，端，可进行种子特异性表达。也可使用其他任何种子特异性启动子元件.整个植物中的组成型表达也可使用CaMV35启动子.也可以使用信号肽将表达蛋白质定位于细胞区室内，如质体、线粒体或内质网(Kermode，1996，Crit.Rev.PlantSci.15:285-423)。信号肽于读框内克隆入cDNA5，端以实现融合蛋白的亚细胞定位。使用的植物二元载体实例为克隆进LMP候选基因的pBPS-GBl、pSUN2-GW或pBPS-GB047栽体。这些二元栽体包含AtAct2-I启动子控制下的抗生素抗性基因和候选基因前的USP或其他种子特异性启动子或组成型启动子，所述候选基因后带有NOSpA终止子或OCS终止子。将部分或全长LMPcDNA以正义或反义方向克隆入植物二元载体USP或种子特异性的、或其他种子特异性的或组成型启动子后的多克隆位点。可用于不同作物物种的其他启动子见实施例11.在标准条件下将含有目的基因的重组栽体转化到Topl0细胞(Invitrogen)中。在含有50ng/ml卡那霉素的LB琼脂上选择转化细胞，并使细胞在37X:生长过夜。按照生产商说明使用QIAprepSpinMiniprepKit(Qiagen)提取质粒DNA。根据标准分子生物学技术进行后续克隆的分析以及限制性图镨的绘制(Sambrook等人，1989，MolecularCloning,ALaboratoryManual,第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress.ColdSpringHarbor,NY)。实施例ll:农杆菌介导的植物转化可以使用标准转化和再生技术(Gelvin，StantonB.&SchilperoortR.APlantMolecularBiologyManual，第二版.Kl鼎erAcademicPubl"Dordrecht1995，见于Sect"RingbucZentraleSignatur:BTll-P;Glick，BernardR.和Thompson,JohnE.MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology,S.360，CRCPress,BocaRaton1993)，利用本文所述的LMP核酸进行农杆菌介导的植物转化。例如，可以使用GV3(pMP卯)(Koncz&Schell，1986，Mol.Gen.Genet.204:383-396)或LBA4404(Clontech)根癌农杆菌菌抹进行农杆菌介导的植物转化。在标准条件下(Bechtold，1993，Acad.Sci.Paris.316:1194-1199;Bent等人，1994，Science265:1856-1860)种植并转化拟南芥。此外，可以通过子叶或胚轴转化(Moloney等人，1989，PlantCellR印ort8:238-242;DeBlock等人，1989，PlantPhysiol.91:694-701)，利用本发明的LMP核酸转化油菜籽，选择农杆菌及植物的抗生素使用取决于转化所用的二元栽体和农杆菌菌林，通常使用可选拷r植物标记进行油菜籽选择，此外，可以使用如Mlynarova等人所述的技术(1994，PlantCellR印ort13:282-285)，进行农杆菌介导至亚麻的基因转移.拟南芥尸/lZ)2或/^D2样基因可被克隆入二元栽体，转化并通过以下启动子表达组成型启动子如超启动子(StantonB.Gelvin，USP#5，428，147和USP然，217，卯3)、或种子特异性启动子如蚕豆USP(未知种子蛋白质)(Baeumlein等人.1991，Mol.Gen.Genetics225:459-67)、或豆球蛋白B4启动子(LeB4;Baeumlein等人.1992，PlantJ.2:233-239)以及可导致单子叶植物如玉米、大麦、小麦、棵麦、稻进行种子特异性表达的启动子.拟南芥AHAS(AtAHAS)基因可用作这些构建体的可选择标记。可使用如EP0424047、美国专利号5,322,783(PioneerHi-BredInternational)或EP0397687、美国专利号5,376,543或美国专利号5,169,770(UniversityToledo)所述的技术、或利用本领域所公知的多种其他转化方法中的任一种转化大豆。用70%乙醇在室温对大豆种子连续振荡表面消毒4分钟，然后加入补充有0.05%(v/v)Tween的20%(v/v)Clorox连续振荡20分钟。用蒸馏水漂洗种子4次，并将其置于Petri盘中的润湿无菌滤纸上，室温留置6至39小时。剥去种皮，将子叶从胚轴上分离下来。检查胚轴确保分生组织区没有损伤。收集切下的胚轴于半开无菌Petri盘中，并风千至湿度小于20%(鲜重)，置于密封Petri盘中备用。这一植物转化方法也适用于欧洲油菜、亚麻和其他作物。具体而言，用70%乙醇在室温对芸莒的种子连续振荡表面消毒4分钟，然后加入补充有0.0S%(v/v)Tween的加％(v/v)Clorox连续振荡20分钟。用蒸馏水漂洗种子4次，并将其置于Petri盘中的润湿无菌滤纸上，室温留置18小时。剥去种皮，种子于半开无菌Petri盘中风干过夜。在此期间，种子丧失了约85%水分。然后将种子保存于室温密封Petri盘中备用。取含适当抗生素(如100mg/l链霉素、50mg/l卡那霉素)的LB固态培养基中的单菌落，在液态LB培养基中长至600nm处光密度为0.8,制务根癌农杆菌培养物.然后在室温、7000rpm、7分钟离心沉淀细菌培养物，并重悬浮于补加100mM乙酰丁香酮的MS培养基(Murashige&Skoog:1962,Physiol.Plant.15:473-497)中，在此预诱导培养基中室温孵育细菌培养物2小时，之后使用.大豆合子种子的胚轴在约44%湿度、室温用预诱导的农杆菌悬浮培养物吸胀2小时(干胚在农杆菌培养物中吸胀对于玉米胚轴也适用)。将胚从吸胀培养物中取出并转移到含有固态MS培养基(补加2%蔗糖)的Petri盘中，在室温暗处孵育2天。还可以将胚置于Petri盘中的润湿(液态MS培养基)无菌滤纸上，在前i^目同条件下粹育。此后将胚转移到固态或液态含有500mg/l羧节青霉素或300mg/1头孢參將的MS培养基中以杀死农杆菌。使用液态培养基润湿无菌滤纸.将胚在25"C、440junoln^s"和12小时光周期中孵育4周。一旦幼苗生根，将其转移到无菌metromix土壤中.转移植物至土壤之前洗去体外植物的培养基。植物在塑料罩下维持l周以促进累积过程。随后将植物转移到生长室内，在25X:、440jimolm、"光强度和12小时光周期下孵育大约80天。通过PCR分析初级转基因植物(T。)样品以证实T-DNA的存在。Southern杂交证实了这些结果，其中在1%琼脂糖凝胶上进行DNA电泳并转移到带正电的尼龙膜(RocheDiagnostics)上。使用PCRDIG探针合成试剂盒(RocheDiagnostics),按照生产商建议通过PCR制备地高辛标记的探针。作为单子叶植物转化的实例，可使用组成型或种子特异性启动子以及玉米泛素内含子和/^2X2或尸A02样核酸分子。例如，用和ATmiI消化pUC中的Pfc^4-F/ia2直系同源物基因构建体。用和ATmaI消化pBPSMM348,以分离玉米泛素内含子(ZmUbi内含子)，然后进行电泳和QIAEXII凝胶提取试剂盒(cat弁20021)处理。将ZmUbi内含子连接于pUC中的PtxA->K42)2或F/1D2样核酸分子，产生基于pUC的PtxA-ZmUbi内含子-7^D2或Z^D2样核酸分子构建体，然后以J/el和尸wd进行限制性酶消化。电泳后将PtxA-ZmUbi内含子/^/X2或E4D2样基因盒从Seaplaque低熔点琼脂糖凝胶(SeaPlaque⑧GTGAgarose目录号50110)中切下。用i^el消化含有可选择标记盒(单子叶型载体)的单子叶植物型栽体。将含有种子特异性启动子—ZmUW内含子的FAD2或i^ZX样核酸分子表达盒连于单子叶型载体。随后，根据本领域常规方法，利用电穿孔法将该构建体转化入含有pSBl(超级v/r质粒)的重组LBA4404菌林中.根据US5,591,616所述的方法使用未成熟胚进行农杆菌介导的玉米转化。应用咪唑酮除草剂选择获得转基因玉米林系。用于玉米的启动子实例也是玉米醇溶蛋白，后者为一组见于玉米胚乳的贮存蛋白质。已经分离了玉米醇溶蛋白基因的基因组克隆(Pedersen等人，Cell29:1015-1026，1982)，并且也可使用来自这些克隆的启动子，包括15kD、16kD、19kD、22kD、27kD基因。已知在玉米中起作用的其他启动子为淀粉合酶、分支酶、去分支酶、油体蛋白、谷蛋白和蔗糖合酶启动子。特别优选用于玉米胚乳表达的启动子为稻的谷蛋白基因的启动子，特别是Osgt-l启动子(Zheng等人，Mole.CellBiol.13:5829-5842,1993)。适用于小麦中表达的启动子实例包括ADP葡萄糖焦磷酸化酶(ADPgluscosepyrosynthase)亚基启动子、淀粉粒结合淀粉合酶及其他淀粉合酶启动子、分支和去分支酶启动子、胚胎发生丰富蛋白启动子、麦醇溶蛋白启动子和谷蛋.白启动子。适用于大麦中表达的启动子实例包括ADP葡萄糖焦磷酸化酶亚基启动子、淀粉粒结合淀粉合酶及其他淀粉合酶启动子、分支和去分支酶启动子、蔗糖合酶启动子、大麦醇溶蛋白启动子、胚球蛋白启动子和糊粉特异性蛋白质启动子。适用于大豆中表达的启动子实例包括本文已经提及的启动子。然而，其他可用的启动子为大豆7S启动子和大豆7S，P伴大豆球蛋白启动子.一般而言，可将植物启动子如USP控制下的稻(或其他单子叶植物)E4D2基因或E4D2样基因可转化入玉米或另一作物植物中，以在其他单子叶植物中产生单子叶/^2)2基因的功能，或在其他双子叶植物中产生双子叶i^2X基因的功能，或在双子叶植物中产生单子叶基因的功能，或反之亦然。可通过与本文所述构建其他质粒方法类似的方法构建含有这些/^D2或FJ/)2样编码序列、5，端为启动子和3，端为终止子的质粒。适用于稻中表达的启动子实例包括ADP葡萄糖焦磷酸化酶亚基启动子、淀粉粒结合淀粉合酶及其他淀粉合酶启动子、分支酶启动子、去分支酶启动子、蔗糖合酶启动子、谷蛋白启动子。特别优选的启动子为稻谷蛋白启动子，Osgt-l。实施例12:体内诱变可以通过用大肠杆菌或其他微生物(如芽孢杆菌属(5flci7/附印p.)或酵母，如酿酒酵母)掺入并传代质粒(或其他载体)DNA，进行微生物的体内诱变，其中所述微生物保持其遗传信息完整性的能力受损。典型的突变菌林中DNA修复系统的基因有突变(如mutHLS，mutD，mutT等；参考RuppW.D.1996，DNArepairmechanisms,in:Esc/rer/由Vicd'and^Ww^ie//",第2277-2294页，ASM:Washington),此类菌株为本领域技术人员所熟知，其用途在例如Greener和Callahan,1994，Strategies7:32-34中有所阐释。优选在微生物中选择并检测之后再将突变DNA分子转移到植物中。根据本文件中的多个实施例产生转基因植物。实施例13:评估转化生物中的mRNA表达和重组基因产物的活性转化宿主生物中重组基因产物的活性可在转录水平或/和翻译水平上测量。确定基因转录水平(可翻译为基因产物的mRNA量的指标)的有效方法之一是进行Northern印迹(参见如Ausubel等人，1988，CurrentProtocolsinMolecularBiology,Wiley:NewYork),其中用可检测的标签(通常具有放射活性或可化学发光)标记为结合目的基因而设计的引物，从而使得在生物培养物总RNA提取、胶上电泳、转移到稳定基质并与该探针孵育时，探针的结合和结合量能够提示该基因mRNA的存在和量。这一信息至少部分汪实了转化基因的转录程度。可以通过本领域已知的若干方法，例如Bormann等人，1992，Mol.Microbiol.6:317-326所述的方法，从植物细胞、组织或器官中制备总细胞RNA。可以使用诸如Western印迹的标准技术(见如Ausubel等人，1988，CurrentProtocolsinMolecularBiology,Wiley:NewYork)，评估从mRNA翻译的蛋白质的存在或相对量。这一方法中，提取总细胞蛋白质，通过凝胶电泳分离之，转移到诸如硝化纤维的基质上，并与可特异性结合于目的蛋白质的探针(如抗体)一同孵育.通常使用易于检测的化学发光物或比色标记标记此探针。观测到的标记存在与否及其数量提示了细胞中期望突变蛋白的存在与否及其数量。可以通过若干充分确立的方法，如DNA条带移位测定法(也称为凝胶迟滞测定法)，测量结合于DNA的LMP活性.可以使用报告基因测定法(如KolmarH.等人，1995，EMBOJ.14:3895-3卯4及其引用参考文献所述)测量此类LMP对其他分子表达的影响。报告基因检测系统众所周知，使用如P-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白以及其他酶，在原核和真核细胞中都可应用该系统。根据如GennisR.B.所述的技术(1989Pores，ChannelsandTransporters,inBiomembranes，MolecularStructureandFunction,Springer:Heidelberg,85-137、199-234和270-322页)，进行脂质代谢膜转运蛋白活性的测定。实施例14:转基因植物中拟南芥、大豆、稻、玉米、亚麻、大麦或小麦中F^"2或E4Z)2样基因功能的体外分析确定酶的活性和动力学参数是本领域的成熟技术。确定任何给定的改变蛋白质活性的实验必须根据野生型酶的特异性活性量体而做，这也完全在本领域技术人员的能力范围内.为确定多种酶的活性，酶的大致情况以及涉及其结构、动力学、原则、方法、应用和实例的具体细节可见于以下参考文献，如Dixon，M.&Webb,E.C.1979，Enzymes.Longmans:London;Fersht，(1985)EnzymeStructureandMechanism.Freeman:NewYork;Walsh(1979)EnzymaticReactionMechanisms.Freeman:SanFrancisco;Price,N.C.，Stevens,L.(1982)FundamentalsofEnzymology.OxfordUniv.Press:Oxford;Boyer，P.D.编.(1983)TheEnzymes,第三版.AcademicPress:NewYork;Bisswanger,H.，1994，Enzymkinetik,第二版，VCH:Wdnheim(ISBN3527300325);Bergmeyer，H.U.，Bergmeyer，J.，GraBl,M.编，(1983-1986)MethodsofEnzymaticAnalysis,第三版，I-XII巻，VerlagChemie:Weinheim;以及UllmannEncyclopediaofIndustrialChemistry(1987)巻A9，Enzymes.VCH:Weinheim，352-363页。实施例15:分析重组蛋白对期望种子贮存化合物产量的影响作为种子油改变的实例，以气相色镨(GC)分析经转化拟南芥植物种子的脂肪酸谦，图10和11中的每一柱形代表从野生型植物或突变体或突变体背景上独立的转基因事件的5mg大量种子中得到的数值。如图10所示，拟南芥的/flrf2突变体中油酸(C18:1)含量从野生型的16%增加至/iw/2突变体的约60%,与之类似，亚油酸(C18:2)的比例大幅下降，从野生型的约31%降至/"突变体的2%。用稻基因OsFAD-01(SeqIDNo.17)转化的拟南芥/似/2突变体种子中出现了由若干/似^突变体背景上独立转基因抹系的脂肪酸模式(见图10的事件FAD1172、FAD1214、FAD1246和FAD1294)向野生型组成的重建，即使在分离的T2种子群中也是如此。使用大麦基因HvFAD-01(SeqIDNo.23)得到了相似的反应，如图11中事件FAD0503、FAD0483、FAD0475和FAD0465所示。这一结果提示，稻基因(OsFAD-01)和大麦基因(HvFAD-01)均能够互补(complement)拟南芥突变体中种子脂肪酸镨，提示其作为脂肪酸去饱和酶的功能。本申请中提及的不同作物的所有其他脂肪酸去饱和酶基因在拟南芥突变体背景中也均显示类似的表现(数据未显示)。通过在合适的条件下种植经修饰的植物，并分析其种子或其他任何植物器官中期望产物(即脂质或脂肪酸)产量的增加，可以评价植物中遗传修饰对期望种子贮存化合物(如糖、脂质或脂肪酸)的影响。此类分析技术为本领域技术人员所熟知，包括质语法、薄层层析法、多种染色法、酶学和微生物学方法以及分析色镨法，如高效液相色镨法(见如Ullman，1985，EncyclopediaofIndustrialChemistry,巻A2，第89-卯及443-613页，VCH:Weinheim;Fallon,A.等人，1987,ApplicationsofHPLCinBiochemistryin:LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology,巻17;Rehm等人，1993Productrecoveryandpurification,Biotechnology,巻3，第III章，469-714页，VCH:Weinheim;Belter,P.A.等人，1988Bioseparations:downstreamprocessingforbiotechnology,JohnWiley&Sons;KennedyJ.F.&CabralJ.M.S.，1992,Recoveryprocessesforbiologicalmaterials,JohnWileyandSons;ShaeiwitzJ.A.&HenryJ.D.，1988，"Biochemicalseparations",见Ulmann，sEncyclopediaofIndustrialChemistry,"Separationandpurificationtechniquesinbiotechnology",巻B3，第11章1画27页，VCH:Weinheim;以及DechowF.J.1989)。除上述方法外，如Cahoon等人(1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA96，22:12935-12940)和Browse等人(1986，Anal.Biochemistry442:141-145)所述，从植物材料中提取植物脂质。脂质或脂肪酸的定性及定量分析描述于Christie,WilliamW.AdvancesinLipidMethodology,Ayr/Scotland:OilyPress.-(OilyPressLipidLibrary;Christie,WilliamW"GasChromatographyandLipids.APracticalGuide-Ayr,Scotland:OilyPress,1989Repr.1992.-IX,307S.-(OilyPressLipidLibrary;以及ProgressinLipidResearch,Oxford:PergamonPress,1(1952)-16(1977)ProgressintheChemistryofFatsandOtherLipidsCODEN)。可以按照标准分析方法GC、GC-MS或TLC,通过分析转基因植物，获取脂肪酸产物存在的明确证据，分别见于Christie的不同论述及其参考文献(1997，AdvancesonLipidMethodology,第4版Christie,OilyPress,Dundee,119-169页；1998)。以叶为例的详细方法见于Lemieux等人(1990，Theor.Appl.Genet.80:234-240),以种子为例的见于Focks&Benning(1998，PlantPhysiol.118:91-101)。通过脂酶消化对甘油主链的sn-l、sn-2或sn-3位进行脂肪酸组成的位置分析(见如Siebertz&Heinz1977，Z.Naturforsch.32c:193-205，以及Christie,1987，《LipidAnalysis》第2版，PergamonPress,Exeter，ISBN0画08-023791-6).可通过任何适当的方法测量总种子油水平。通常使用常规方法如近红外分析(NIR)或核磁共振成像(NMR)进行种子油含量的定量.NIR光谱法业已成为用于筛选种子样品的标准方法，只要目的样品适用于该技术即可。研究的样品包括芸苔、大豆、玉米、小麦、稻等等.可使用单个种子的NIR分析(参见例如Velasco等人"Estimationofseedweight,oilcontentandfattyacidcompositioninintactsingleseedsofrapeseed(丑,"柳'caw"j9附L)bynear-infraredreflectancespectroscopy",Euphytica，巻106，1999，79-85页)。NMR也用于分析种子的油含量(参见例如Robertson&Morrison,"Analysisofoilcontentofsunflowerseedbywide-lineNMR，"JournaloftheAmericanOilChemistsSociety,1979，巻56，1979，961-964页，其整体在本文引用作为参考)。收集蛋白质活性增加或减少对脂质和糖生物合成路径影响的相关信息的典型方法是例如用"c-醋酸盐或"c-丙酮酸盐的标记，研究分析叶或种子的碳流通(见如Focks&Benning，1998，PlantPhysiol.118:91-101;Eccleston&Ohlrogge，1998，PlantCell10:613-621)。包括标准物如"C-蔑糖和"C-苹果酸的相应分离(如在TLC板上)后，通过液体闪烁计数可以确定14C在脂质和水性可溶成分间的分布(Eccleston&Ohlrogge,1998，PlantCell10:613-621)。可以通过声波破碎、玻璃磨、液氮和研磨或其他适用的方法碎裂待分析的材料.碎裂后的材料需进行离心。将沉淀重悬于蒸馏水中，在100'c加热io分钟，冰上冷却并再次离心后，卯t;用含o.sM硫酸、2%二甲氧基丙烷的甲醇提取1小时，产生可生成转曱基脂质的水解油和脂质化合物，在petrolether中抽提这些脂肪酸甲酯，并最终使用毛细柱(Chrompack，WCOTFusedSHica，CP-Wax-52CB，25m,0.32mm)在1701C-2401C的温度梯度下进行20分钟GC分析，并于240C进行5分钟。通过使用商业来源可得的标准(即Sigma)，鉴定产生的脂肪酸甲酯。当无法得到脂肪酸的标准物时，通过衍生化以及此后的GC-MS分析完成分子鉴定。例如，在4，4-二甲氧基噁唑啉衍生物衍生反应后，通过GS-MS显示三键脂肪酸的定位(Christie，OilyPress,Dundee,1998)。分析糖(特别是淀粉)的常用标准方法，由StittM.，LilleyR.Mc.C.，GerhardtR.和HeldtM.W,发表(1989，"Determinationofmetabolitelevelsinspecificcellsandsubcellularcompartmentsofplantleaves,"MethodsEnzymol.174:518-552;其他方法也可见Hartel等人，1998，PlantPhysiol.Biochem.36:407-417及Focks&Benning,1998，PlantPhysiol.118:91-101),为抽提可溶性糖和淀粉，在1.5ml聚丙烯试管中将50粒种子于500jil80%(v/v)乙醇中匀浆，在701C孵育卯分钟。16，000g离心5分钟后，将上清液转移至新的试管中。用500jU80。/。乙醇抽提沉淀两次。真空室温蒸发混合上清液中的溶剂.将残留物溶解于50nl水，即为可溶性糖类级分.乙醇抽提后留下的沉淀中含有包括淀粉在内的不可溶性糖类，在200jil0.2NKOH中匀浆，将悬浮物在95X:孵育1小时以溶解淀粉。加入35jil1N醋酸后，在16，000g离心5分钟，使用上清液进行淀粉定量。为量化可溶性糖，向含有100mM咪唑、pH6.9、5mMMgCl2、2mMNADP、1mMATP和2单位2ml"葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的990jil反应緩冲液中加入10fil糖提取物。依次向其中加入4.5单位己糖激酶、l单位葡萄糖磷酸异构酶以及2nl饱和果糖苷酶溶液，以酶促测定葡萄糖、果糖和蔗糖。在波长340nm处光度法监测NADPH的产生.与之相似，使用BoehringerMannheim的试剂盒分析30jil不可溶糖类级分中的淀粉。分析叶和种子中蛋白质含量的实例可见于BradfordM.M.(1976，"Arapidandsensitivemethodforthequantificationofmicrogramquantitiesofproteinusingtheprincipleofproteindyebinding"Anal.Biochem.72:248-254)。为定量总种子蛋白质，在1.5ml聚丙烯试管中将15-20粒种子于250jil丙酮中匀浆。16，000g离心后弃去上清液，将真空干燥的沉淀重悬于250jil含有50mMTris画HCl(pH8.0)、250mMNaCl、1mMEDTA和l。/。(w/v)SDS的提^^沖液中。25X:孵育2小时后，将匀浆在16,000g离心5分钟，使用200ml上清液进行蛋白质测量。在该测定中用，球蛋白进行校准。使用LowryDC蛋白质测定法(Bio-Rad)或Bradford测定法(Bio-Rad)进行蛋白质测量，根据Renz等人(1993，Planta1卯:156-165)，分光光度法酶法测定己糖激酶和果糖激酶；根据Burrell等人(1994，Planta194:95-101)，酶法测定葡萄糖磷酸异构酶、ATP依赖性6^酸果糖激酶、焦磷酸盐依赖性6^酸果糖激酶、果糖-l，6-二磷酸醛缩酶、丙糖磷酸异构酶、甘油-3-磷酸脱氢酶、磷酸甘油激酶、磷酸甘油变位酶、烯醇酶和丙酮酸激酶；根据Zrenner等人(1995，PlantJ.7:97-107),酶法测定UDP-葡萄糖-焦磷酸化酶。如H3rtel等人所述(1998,PlantPhysiol.Biochem.36:407-417)，测量糖类代谢的中间产物，如葡萄糖-l-磷酸、葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、磷酸烯醇丙酮酸、丙酮酸和ATP;根据Jelitto等人(1992，Planta188:238-244)，测量代谢产物。除测量最终种子贮存化合物(即脂质、淀粉或贮存蛋白质)外，也可以分析产生期望种子贮存化合物所用的代谢路径的其他成分(如中间产物和副产物)，以确定化合物产生的总效率(Fiehn等人，2000，NatureBiotech.18:1447-1161)'例如，可使用标准程序构建含有本文公开的核酸或其片断的酵母表达载体，并将其转化至酿酒酵母中。可分析产生的转基因细胞在糖、油、脂质或脂肪酸含量上的变化。与之相似，可使用标准程序构建含有本文公开的核酸或其片断的植物表达载体，并将其转化至合适的植物细胞中，如拟南芥、大豆、油菜籽、稻、玉米、小麦、蒺藜状苜蓿(ikfe必cagofrM/ica似/fl)等，可分析产生的转基因细胞和/或其衍生植物在糖、油、脂质或脂肪酸含量上的变化。此外，本文公开的序列或其片断可用于在多种生物基因组中产生敲除突变，如细菌、哺乳动物细胞、酵母细胞和植物细胞(Girke等人，1998，PlantJ.15:39-48)。然后可评价产生的敲除细胞中种子贮存化合物的组成和含量，以及突变对表型和/或基因型的影响。其他基因失活的方法包括US6，004，804"非嵌合突变栽体"和Puttaraju等人(l"9，"Spliceosome-mediatedRNA加附-splicingasatoolforgenetherapy"NatureBiotech.17:246-252)所述的那些。实施例16:从转化生物中纯化期望产物可以通过本领域已知的多种方法从植物材料中回收LMP.从植物器官中分离种子贮存化合物前，先将植物器官与其他组织或器官机械分离。组织匀浆后，离心除去细胞碎片，保留含有可溶性蛋白质的上清液级分，以进一步纯化期望化合物。若产物是由培养的细胞分泌的，则通过低速离心将细胞从培养物中去除，保留上清液级分，作进一步纯化。在适当的树脂上对来自任一种纯化方法的上清液级分进行色镨分析，其中期望分子而非样品中的多种杂质留存于色i普树脂上，或杂质而非样品留存于树脂上。必要时可使用相同或不同的色镨树脂重复此类色谱步骤。本领域技术人员擅长选择适当的色i普树脂，并将其最有效地运用于纯化具体的待纯化分子。可以通过过滤或超滤法浓缩纯化产物，并于可最大化产物稳定性的温度保存。本领域公知多种纯化方法，因而前述纯化方法并非限制性的。此类纯化方法的描述见于如Bailey&Ollis，1986，BiochemicalEngineeringFundamentals,McGraw-Hill:NewYork,根据本领域标准技术鉴定分离化合物并评估其纯度。这些技术包括高效液相色谱法(HPLC)、分光光度法、染色法、薄层层析法、分析色谱法如高效液相色镨法、NIRS、酶法测定或微生物学测定。此类分析方法可见于Patek等人(1994，Appl.Environ.Microbiol.60:133-140)、Malakhova等人(1996，Biotekhnologiya11:27-32)，以及Schmidt等人(1998，BioprocessEngineer19:67-70)、Ulmann，sEncyclopediaofIndustrialChemistry(1996，巻A27，VCH:Weinheim，第89-90、521-540、540-547、559-566、575-581和581-587页)，以及MichalG(1999，BiochemicalPathways:AnAtlasofBiochemistryandMolecularBiology,JohnWileyandSons;Fallon,A.等人，1987，ApplicationsofHPLCinBiochemistry,LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology，巻17)。实施例17:通过设计微RNA前体下调基因表达微RNA(miRNA)是植物和动物中进化保守的基于RNA的基因表达调节物,miRNA(~21至25nt)来源于转录自非蛋白质编码基因的具有茎环结构的较大前体.miRNA寻靶特定的mRNA，以在转录后水平(即降解mRNA)或翻译水平(即抑制蛋白质合成)上抑制基因表达(BartelD2004，Cell116，281-297).可以设计m股NA前体(前miRNA)，使由前miRNA编码的内源miRNA能被miRNA取代，以寻靶目的基因如dsRed报告基因。选用玉米m股166前体进行设计。编码miR166前体的核苷酸序列如SEQIDNO:47所示。通过多点通路克隆方法(multi-siteGatewaycloingapproach)(Invitrogen，Carlsbad,CA)产生两个二元表达构建体。如SEQIDNO:41所示的RLM323用作对照，即处于ScBV(甘蔗杆状病毒)启动子及NOS(胭脂碱合酶)终止子调控下的天然玉米miR166表达。如SEQIDNO:42所示的RLM325与RLM323相同，只是前体中如SEQIDNO:37和SEQIDNO:38所述的天然miR166(5，tcggaccaggcttcattcccc3，)被如SEQIDNO:39所示的miRNA乾向dsRed(5，ttgtagatgaagcagccgtcc3，)所取代。MiRdsRed与dsRedmRNA的3，区域互补。通过农杆菌将RLM323及RLM325转化入纯合子玉米SDM10828中，其中已经携有二元载体RLM185,以在ScBV启动子和NOS终止子的调控下表达dsRed。收集3个携带RLM323的独立TO事件和29个携带RLM325的独立T0事件的叶样品，然后使用Typhoon9400(GeneralEngineering,配套的成像系统)分析该样品，以检测dsRed荧光。RLM325事件的荧光强度与对照RLM323事件的强度相比，降低了卯％以上.在Northern印迹分析中证实了RLM325事件中miRdsRed的产生，利用与miRdsRed互补的放射活性标记探针，能在RLM325事件中检测到~21nt的特异性条带，而RLM323事件(对照)中则没有.通过qRT-PCR证实了RLM325事件中dsRedmRNA相对于对照RLM323的减少(近卯％).总之，这些数据证实可以设计miRNA前体以寻把目的基因。在包括种子在内的多种组织中表达编码脂肪酸去饱和酶的玉米基因。使用19至21nt(如SEQIDNO:40所述的ACCAGACCCCGAACGCCGC)的玉米去饱和酶编码区或mRNA中5，UTR及3，UTR互补物，取代ZmmiR166前体中如SEQIDNO:37及SEQIDNO:38所述的ZmmiR166(5，tcggaccaggcttcattcccc3，)。然后将该转基因转化入玉米，该基因改造的ZmmiR166基因的表达受玉米种子特异性启动子(如胚乳特异性10KD玉米醇溶蛋白启动子或Globl胚特异性启动子)的调控，当处理基因改造的ZmmiR166前体时，在种子中产生了微RNA(如SEQIDNO:40所述的ACCAGACCCCGAACGCCGC).该miRNA特异性结合玉米脂肪酸去饱和酶mRNA中与该miRNA互补的区域，从而通过基因沉默机制导致种子中转录或翻译水平上该靶定玉米去饱和酶的表达减少。从而使转基因玉米具有期望的脂肪酸水平和组成，例如种子中l氐亚麻酸和/或中等或高油酸水平。实施例18:有关种子大小增加的筛选i^ZX和作物样基因的条件性表达可导致种子大小增加。将会产生表达i^2)2或E4i)2样基因的转基因拟南芥或作物植物。利用显微镜确定种子大于野生型的转基因植物。此外，还测量转基因株系的种子重量。例如，/iw/2突变体种子与野生型相比种子重量减少了20%。在独立的拟南芥转基因林系pFAD2RT-7及pFAD2RT-5的分离T2种子世代中，100粒种子的重量分别增加了30%及40%。纯合子T3种子中，种子重量与空载体对照相比增加高达60%(数据未示)。种子重量的增加体现在拟南芥中MZ)2基因过表达种子大小的增加。种子大小的增加使得多种经济上重要的作物植物的产率增加。因此，种子大小的增加是使用本申请所述的/^D2或Z^D2样核酸分子进行遗传工程和选择的目标之一.表l.植物脂质类别<table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table>表2.常见植物脂肪酸<table>tableseeoriginaldocumentpage97</column></row><table>这些脂肪酸不常规见于植物种子油中，但其在转基因植物种子油中的产生在植物生物技术中至关重要。表3.推定的i^D2样LMP功能表(全长核酸序列可使用序列代号在附录A中找到)<table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table>本领域技术人员通过常规试验，能识别或能确定本文所述本发明具体实施方案的多种等效物。此类等效物旨在涵盖于本文公开和要求的本发明权利要求书中。附录A图1A:SEQIDNO:1-AtFAD-01的核酸序列图IB:SEQIDNO:3-AtFAD-01开放读才匡的核酸序列图1C:SEQIDNO:4-AtFAD-01开放读框的絲酸序列图2A:SEQIDNO:5-GmFAD-01的核酸序列图2B:SEQIDNO:7-GmFAD-01开-文读框的核酸序列图2C:SEQIDNO:8-GmFAD-01开放读框的氨基紗列图3A:SEQIDNO:9-GmFAD-02的核酸序列图3B:SEQIDNO:11-GmFAD-02开放读框的核酸序列图3C:SEQIDNO:12-GmFAD-02开放读冲匡的氨基酸序列图4A:SEQIDNO:12-GmFAD-03的核酸序列图4B:SEQIDNO:15-GmFAD-03开放读框的核絲列图4C:SEQIDNO:16-GmFAD-03开放读框的氨基酸序列图5A:SEQIDNO:17-ZmFAD-01的核酸序列图5B:SEQIDNO:19-ZmFAD-01开放读框的核酸序列图5C:SEQIDNO:20-ZmFAD-01开放读框的氨基酸序列图6A:SEQIDNO:21-OsFAD-01的核財列图6B:SEQIDNO:23-OsFAD-01开放读框的核酸序列图6C:SEQIDNO:24腸OsFAD-01开放读框的M断列图7A:SEQIDNO:25-LuFAD-01的核狄列图7B:SEQIDNO:27-LuFAD-01开放读框的核酸序列图7C:SEQIDNO:28國LuFAD-01开放读框的氨基酸序列图8A:SEQIDNO:29-HvFAD-01的核酸序列图8B:SEQIDNO:31-HvFAD-01开放读框的核酸序列图8C:SEQIDNO:32-HvFAD-01开放读框的氨基酸序列图9A:SEQIDNO:33國TaFAD-01的核酸序列图9B:SEQIDNO:35-TaFAD-01开放读框的核酸序列图9C:SEQIDNO:36-TaFAD-01开放读框的氨基,列。权利要求1.分离的多肽，包含选自如下的氨基酸序列X1X2X3LX4X5X6X7LX8X9PX10YL，其中X1不为M，且X3不为T，且X6不为F，且X7不为V，GX11X12X13X14X15X16X17X18HX19X20PX21X22X23X24X25X26X27X28ER，其中X15不为G，且X20不为F，且X21不为N，且X22不为A，HX29X30PX31X32X33X34X35X36X37X38ER，其中X30不为F，且X31不为N，且X32不为A，LX39X40X41X42X43X44X45GX46X47X48X49X50X51X52YX53X54P，其中X41不为Y，且X45不为Q，且X48不为S，且X49不为M，且X50不为I，TX55X56X57X58HX59X60X61X62X63X64X65X66X67X68X69X70X71T，其中X67不为N，以及PX72X73X74X75X76X77X78X79X80X81X82X83X84X85X86，其中X84不为W，且X85不为Y，且X86不为V，且其中若无上述其他限定，X代表任何氨基酸。2.分离的多肽，包含选自如下的氨基財列AWYTPYX87YNNPX88GRLVHIX89VQLTLGWPLYLAX90NX91SGRPYPRFACHFDPYGPIYNDRER，FISDVGV，ALX92KLX93SX94FGFWWVVRVYGVP,ILGEYYQFDX9STPVAKAT,且其中X代表任意氨基酸。3.分离的核酸序列，编码包含权利要求1或2的^酸序列的蛋白质。4.分离的多肽，由权利要求3的核M列编码。5.分离的核酸，包含选自如下的多核苷酸序列如SEQIDN0:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35所示的多核苷酸序列；编码如SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34或SEQIDNO:36所示多肽的多核苷酸序列；与上述a)或b)中核酸具有至少70%序列同一性的多核苷酸序列；与上述a)或b)中核酸互补的多核苷酸序列；以及在严紧条件下与上述a)或b)中核酸杂交的多核苷酸序列。6.分离的多肽，由权利要求5的多核苷酸序列编码。7.权利要求5的分离的核酸，其中所述分离的核酸编码作为微生物或植物中种子贮存化合物调节物起作用的多肽。8.权利要求6的分离的核酸，其中分离的LMP多肽序列作为孩t生物或植物中种子贮存化合物调节物.9.表达载体，含有权利要求3或5的核酸，其中所述核酸有效连接于选自种子特异性启动子、根特异性启动子及非组织特异性启动子的启动子。10.产生转基因植物的方法，所述转基因植物的种子贮存化合物重量百分比的水平与野生型相比发生改变，所述方法包括a.第一步将含有核酸的表达栽体引入植物细胞，和b.第二步从该植物细胞产生转基因植物，且其中所述核酸包含选自如下的多核苷酸序列a.如SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35所示的多核苷酸序列；b.编码如SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34或SEQIDNO:36所示多肽的多核苷酸序列；c.与上述a)或b)中核酸具有至少70%序列同一性的多核苷酸序列；d.与上述a)或b)中核酸互补的多核苷酸序列；以及e.在严紧条件下与上述a)或b)中核酸杂交的多核苷酸序列。11.权利要求10的方法，其中的核酸包含与权利要求5中a)或b)的多核苷酸序列具有至少卯％序列同一性的多核苷酸序列。12.权利要求10的方法，其中转基因植物的油酸水平与该植物野生型品种相比提高.13.产生转基因植物的方法，所述转基因植物的油酸重量百分比水平与野生型相比提高，所述方法包括第一步用RNA前体构建体转化植物细胞，和第二步从该植物细胞产生转基因植物，其中所述构建体含有在植物细胞中驱动表达的启动子，该启动子有效连于编码前体微RNA序列的核苷酸序列，其中编码所述微RNA前体序列的核苷酸序列选自a.如SEQIDNO:47所示的核苷酸序列b.与上述a)中核酸具有至少70%序列同一性的多核苷酸序列；c.与上述a)中核酸互补的多核苷酸序列；以及d.在严紧条件下与上述a)中核酸杂交的多核苷酸序列。14.权利要求13的方法，其中设计编码前体微RNA序列的核苷^列，从而使编码SEQIDNO:37所示微RNA的核苷酸序列被编码SEQIDNO:40所示微RNA的核苷酸序列所取代。括:15.分离的核酸，包含选自如下的多核苷酸序列如SEQIDNO:47所示的核苷酸序列；与上述a)中核酸具有至少70%序列同一性的多核苷酸序列；与上述a)中核酸互补的多核苷酸序列；以及在严紧条件下与上述a)中核酸杂交的多核苷酸序列。16.调节植物中种子贮存化合物重量百分比水平的方法，所述方法包a.第一步将含有核酸的表达载体引入植物细胞，和b.第二步从该植物细胞产生转基因植物，且其中所述核酸包含权利要求5的多核苷酸序列。17.权利要求16的方法，其中油酸重量百分比的水平改变。18.通过权利要求IO、13或16的方法制备的转基因植物。19.权利要求18的转基因植物，其中转基因植物的油酸重量百分比水平与该植物野生型品种相比提高。20.权利要求18的转基因植物，其中植物选自油菜籽、芸苔、亚麻籽、大豆、向日葵、玉米、燕麦、棵麦、大麦、小麦、胡椒、万寿菊、棉花、油椰、椰树、亚麻、蓖麻、甜菜、稻和花生。21.由权利要求18的转基因植物所产生的种子，其中所述植物表达作为种子贮存化合物调节物起作用的多肽，且其中所述植物为种子贮存化合物重量百分比水平与该植物野生型品种相比改变的真实遗传.全文摘要本发明一般性涉及与植物中种子贮存化合物的存在相关的蛋白质的编码核酸序列。更具体而言，本发明涉及脂质代谢调节蛋白质的FAD2样编码核酸序列，及这些序列在转基因植物中的用途。具体而言，本发明涉及脂质代谢相关化合物的操作方法，以及在植物和种子中提高油水平和改变脂肪酸组成的方法。本发明还涉及应用这些新的植物多肽刺激植物生长和/或提高产率和/或种子贮存化合物组成的方法。文档编号C12N9/02GK101120091SQ200580048074公开日2008年2月6日申请日期2005年12月19日优先权日2004年12月20日发明者H·黑特尔,J·吉布森,P·任申请人:巴斯福植物科学有限公司