赋予除草剂抗性的基因的制作方法

专利名称：：赋予除草剂抗性的基因的制作方法赋予除草剂抗性的基因发明领域本发明提供了编码5-烯醇丙酮酰莽草酸盐-3-磷酸盐(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate，EPSP)合酶的新颖基因及其变体。该基因及其变体可用于植物生物学、作物育种和植物细胞培养。发明背景通常被称为草甘膦的N-膦酰曱基甘氨酸是重要的农业化学品。草甘膦抑制将磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和3-磷酰莽草酸(3-phosphoshikimicacid)转化为5-烯醇丙酮酰-3-磷酰莽草酸的酶。对该酶(5-烯醇丙酮酰莽草酸盐-3-磷酸盐合酶，在本文中净皮称为"EPSP合酶")的抑制通过阻断莽草酸盐途径杀死植物细胞，由此抑制芳香族氨基酸的生物合成。因为草甘膦类除草剂能抑制芳香族氨基酸生物合成，所以它们不仅杀死植物细胞，还对细菌细胞有毒性。草甘膦抑制很多细菌EPSP合酶，由此对这些细菌有毒性。但是，某些细菌EPSP合酶具有对草甘膦的高度耐受性。可通过对植物细胞进行转化，以表达抗草甘膦的细菌EPSP合酶，来生产对革甘膦毒性有抗性的植物细胞。尤其地，来自根癌农杆菌(/^ro6fl"er/咖"迈e/"ac/e/2s)菌林CP4的细菌基因已用于在植物中表达之后对植物细胞赋予除草剂抗性。来自鼠伤寒沙门氏菌(5^/迈0/6//30^力^耵/咖)菌林CT7的经突变EPSP合酶在细菌细胞中赋予草甘膦抗性，并且在植物细胞上赋予草甘膦抗性(美国专利号4，535，060、4，769，061和5，094，945)。但是，仍然需要其它的除草剂抗性基因。发明简述本发明提供了用于对细菌、植物、植物细胞、组织和种子赋予除草剂抗性的组合物和方法。组合物包括编码除草剂抗性多肽的序列的核酸分子，包含这些核酸分子的载体，以及包含所述载体的宿主细胞。本发明提供了包含下述多肽的编码序列的组合物，所述多肽赋予对草甘膦除草剂的抗性或耐受性，还提供了针对这些多肽的抗体。本发明的组合物包括编码除草剂抗性多肽的合成核酸分子。编码序列可用于DNA构建体或表达盒，用于在生物体(包括微生物和植物)中转化和表达。组合物还包含经转化的细菌、植物、植物细胞、组织和种子。此外，提供了生产下迷多肽的方法，所述多肽由本发明的合成核苷酸所编码。特别地，提供了对应于赋予除草剂抗性的核酸序列的经分离核酸分子。此外，本发明包括对应于所述多核苷酸的氨基酸序列。特别地，本发明提供了经分离的核酸分子，其包含SEQIDNO:1或2所示的核苷酸序列、编码SEQIDNO:3所示的氨基酸序列的核苷酸序列、以编号No.B-30804在细菌宿主中保藏的草甘膦抗性核苷酸序列，以及它们的变体和片段。与本发明的核苷酸序列互补的核苷酸序列或与本发明的序列杂交的核苷酸序列也包括在本发明中。附图简述图1显示了《i^8的核苷酸序列(SEQIDNO:1)。开放读码框从第296位核苷酸开始，在第1555位核苷酸结束(SEQIDNO:2)。图2显示了GRG8蛋白的氨基酸序列(SEQIDNO:3)。图3显示了对GRG8(SEQIDN0:3)、GRG8迈1画(C22)(SEQIDN0:5)、GRG8m3—(N24)(SEQIDNO:9)、GRG8m2-(N15)(SEQIDNO:7)、GRG8m4_(Al)(SBQIDNO:11)、GRG8m5-(B2)(SEQIDNO:13)、GRG8m6-(B7)(SEQIDNO:15)、GRG8m7-(Bl1)(SEQIDNO:17)、GRG8m8-(CU)(SEQIDNO:19)、GRG8m9-(E3)卿IDN0:21)和GRG8mlO—(E4)(SEQIDNO:23)的氨基酸序列的比对。发明详述现在将参考附图，在下文中对本发明进行更完全的描述，附图中显示了一些但并非全部的发明实施方式。事实上，这些发明可以以很多不同的形式实施，其不应当被限制为本文示出的实施方式；其实，提供这些实施方式是为了使本公开文本满足适用的法律要求。上下文中，相似的编号指相似的元件。对于上述发明所涉及的领域的技术人员(从前述说明书和相关附图的教导受益的)而言，能想到本文示出的本发明的很多改变和其它实施方式。因此，应当理解，本发明不仅限于公开的特定实施方式，改变和其它实施方式也将被包括在所附权利要求的范围内。虽然本文使用了特定的术语，但是它们仅用作普通描述，并非用于限制目的。本发明涉及在生物(特别是植物或植物细胞)中调控除草剂抗性的组合物和方法。所述方法包括用编码本发明草甘膦抗性基因的核苷酸序列对生物加以转化。本发明的核苷酸序列可用于制备展示出对除草剂草甘膦具有提高的耐受性的植物。因此，本发明提供了经转化的细菌、植物、植物细胞、植物组织和种子。组合物包括与微生物和植物中除草剂耐受性相关的核酸和蛋白质，以及经转化的细菌、植物、植物組织和种子。本文公开了草甘膦抗性基因(gr^!)的核苷酸序列以及由此编码的蛋白质的氨基酸序列。所述序列可用于构建表达载体，以随后转化进感兴趣的植物，或者可用作为探针，用于分离其它草甘膦抗性基因，或者可用作为选择标记等。含有本发明的除草剂抗性核苷酸序列的质粒于2004年12月21曰被保藏于AgriculturalResearchServiceCultureCollection,NorthernRegionalResearchLaboratory(NRRU，编号为No.廳LB-30804,永久保藏。该保藏物将按照布达佩斯条约关于国际承认的用于专利程序目的的微生物保藏的规定被保持。该保藏物仅作为本领域技术人员提供便利之用，并非对按照35U.S.C.§112要求保藏物的认可。"草甘膦"意指N-膦酰甲基甘氨酸(包括其任何盐)的任何除草剂形式，以及其它能导致在植物中(//2W^")产生草甘膦阴离子的形式。"除草剂抗性蛋白"或从"编码除草剂抗性的核酸分子，，产生的蛋白包括向细胞赋予下述能力的蛋白，所述能力是较之不表达该蛋白的细胞而言，能耐受更高浓度的除草剂，或者较之不表达该蛋白的细胞而言，在更长的时间耐受某浓度的除草剂。"草甘膦抗性蛋白"包括向细胞赋予下述能力的蛋白，所述能力是较之不表达该蛋白的细胞而言，能耐受更高浓度的草甘膦，或者较之不表达该蛋白的细胞而言，在更长的时间耐受某浓度的草甘膦。"耐受"或"耐受性"意指存活，或以不易与未经处理细胞分辨的方式进行重要的细胞功能，例如蛋白合成和呼吸。经分离的核酸分子及其变体和片段本发明的一个方面涉及经分离的核酸分子，其包含编码除草剂抗性蛋白和多肽或其生物活性部分的核苷酸序列，以及涉及足以作为杂交探针以鉴定编码除草剂抗性的核酸的核酸分子。本文中使用的术语"核酸分子"意在包括DNA分子(例如cDM或基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)以及使用核苷酸类似物产生的DM或RNA的类似物。核酸分子可以是单链的或双链的。编码本发明的蛋白质的核苷酸序列包括SEQIDN0s:1和2所示的序列，以编号No.NRRLB-30804在细菌宿主中保藏的除草剂抗性核苷酸序列以;5L它们的变体、片段和互补序列。"互补序列"意指下述核苷酸序列，其与给定的核苷酸序列足够互补，使得其可与给定的核苷酸序列杂交，由此形成稳定双链体。这些核苷酸序列编码的除草剂抗性蛋白的相应氨基酸序列示于SEQIDNO:3中。本发明还包括包含下述核普酸序列及其互补序列的核酸分子，所述核苷酸序列编码部分长度的除草刑抗性蛋白."经分离的"或"经纯化的"核酸分子或蛋白质或其生物活性部分，基本(substantially)不含其它细胞物质或培养基(当通过重组技术生产时)，或基本不含化学品前体或其它化学品(当化学合成时)。优选地，"经分离的"核酸不含在获得所述核酸的生物基因组DNA中天然连接于所述核酸侧翼的序列(优选地，蛋白质编码序列)(即，位于所述核酸5，和3，末端的序列)。就本发明的目的而言，当用于指代核酸分子时，"经分离的"排除了经分离的染色体。例如，在多种实施方式中，经分离的编码草甘膦抗性的核酸分子可含有少于大约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的下述核苷酸序列，所述核苷酸序列在获得所述核酸的细胞的基因组DNA中天然连接于所述核酸侧翼。基本不含细胞物质的除草剂抗性蛋白质包括下述蛋白质制剂，所述制剂具有少于大约30%、20°/。、10%或5%(以干重计)的非除草剂抗性蛋白(也被称为"污染性蛋白")。是上述编码除草剂抗性的核苷酸序列的片段的核酸分子也包括在本发明内。"片段"指编码除草剂抗性蛋白的核苷酸片段。核苷酸序列的片段可编码除草剂抗性蛋白的生物活性部分，或者其可以是使用下文公开的方法可用作杂交探针或PCR引物的片段。是除草剂抗性核苷酸序列的片段的核酸分子包含至少大约15、20、50、75、100、200、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950个连续的核苷酸，或者多达本文公开的编码除草剂抗性的全长核苷酸序列中存在的核苷酸数量(例如，对SEQIDNO:1而言，2000个核苷酸，对SEQIDNO:2而言，1257个核苷酸)。"连续的"核苷酸意指互相紧邻的的核苷酸残基。本发明的核苷酸序列的片段通常将编码保留了全长草甘膦抗性蛋白的生物活性(即，除草剂抗性活性)的蛋白片段。"保留了除草剂抗性活性"舉指该片段将具有本文中作为SEQIDNO:3公开的全长草甘膦抗性蛋白的除草剂抗性活性的至少大约30%，至少大约50%，至少大约70%或者至少大约80%。用于测量除草剂抗性活性的方法是本领域公知的。见，例如，美国专利Nos.4，535，060和5,188,642，它们每份都通过引用整体并入本文。编码本发明蛋白的生物活性部分的、除草剂抗性编码核苷酸序列的片段将编码至少大约15、25、30、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400个连续的氨基酸，或者多达本发明的全长除草剂抗性蛋白中存在的氨基酸的总数(例如对于本发明的蛋白质而言，419个氰基酸)。本发明的除草剂抗性蛋白由与SEQIDNO:1或2的核苷酸序列足够相同的核苷酸序列编码。术语"足够相同"意指采用标准参数，使用本文所述的比对程序之一，较之参照序列具有至少大约60%或65%序列相同性，大约70%或75%序列相同性，大约80%或85%序列相同性,大约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列相同性的氨基酸或核苷酸序列。本领域技术人员将理解，可以考虑到密码子简并性、氨基酸相似性、读码框位置等，对这些值适当地调节，以确定两条核苷酸序列编码的蛋白质的对应相同性。为确定两条氨基酸序列或两条核酸序列的百分比相同性，针对最优比较的目的，对序列加以比对。两条序列间的百分比相同性是序列共有的相同位置数的函数(即，百分比相同性-相同的位置数/总位置数(例如重叠的位置)x100)。在一种实施方式中，两条序列长度相同。可使用与下文所述类似的技术，允许或不允许存在缺口，来测定两条序列间的百分比相同性。在对百分比相同性的计算中，典型地，计算完全的匹配。对两条序列间百分比相同性的测定可使用数学算法来完成。用于比较两条序列的数学算法的非限制性例子是按照KarlinandAltschul(1993)Jcad.S"',USA90:5873-5877改良的KarlinandAltschul(1990)户roc.Sc/.USA87:2264-2268算法。此算法被并入Altschuletal.(1990)JMol.Biol.215:403-410的BLASTN和BLASTX程序。可用BLASTN程序,分数-100，字长-12，进行BLAST核苷酸搜索，以获得与本发明的GDC样核酸分子同源的核苷酸序列。可以用BLASTX程序，分数-50，字长t3,来进行BLAST蛋白质搜索，以获得与本发明的除草剂抗性蛋白分子同源的氨基酸序列。为获得有缺口的比对用于比较目的，可使用有缺口BLAST,如Altschulef".(1997)肠/e7c爿c油紋25:3389-3402所述。或者，可以用PSI-Blast进行迭代搜索，以探测分子之间较远的关系。见上文所述的Altschulefa人(1997)。当利用BLAST、有缺口BLAST和PSI-Blast程序时，可使用各程序(例如BLASTX和BUSTN)的缺省参数。见www,ncbi.nlm.nih.gov。用于比较序列的数学算法的另一非限制性例子是ClustalW算法(Higgins"(1994)細7e/c22:4673-4680)。ClustalW对序列加以比较，对氨基酸或DNA序列的整体加以比对，因此能提供关于整个氨基酸序列的序列保守性的数据。ClustalW算法用于多种可商业获得的DM/氨基酸分析软件包，例如VectorNTI程序套装(InvitrogenCorporation,Carlsbad,CA)的AUGNX模块。用ClustalW对氨基酸序列进行比对之后，可以估计出氨基酸百分比相同性。可用于ClustalW比对分析的软件程序的一个非限制性例子是GeneDocTM。GeneDoc(KarlNicholas)允许对多个蛋白质之间的氨基酸(或DM)相似性或相同性加以评估。用于比较序列的数学算法的另一非限制性例子是MyersandMiller(1988)"丑/(^4:11-17的算法。此算法被并入ALIGN程序(版本2.0)，该程序是GCG序列比对软件包(可从Accelrys，Inc.，SanDiego，CA获得)的一部分。当利用ALIGN程序用于比较氨基酸序列时，可以使用PAM120权重残基表(weightresiduetable)、12的缺口长度惩罚以及4的缺口惩罚。除非另有指明，使用NeedlemanandWunsch(1970)A/o/.48(3):443-453算法的GAP版本10将用于确定序列相同性或相似性，其中使用下述参数对于核苷酸序列的％相同性和％相似性，使用50的GAP权重，3的长度权重，以及nwsgapdna.cmp计分矩阵；对于氨基酸序列的％相同性或％相似性，使用8的GAP权重，2的长度权重以及BL0SUM62计分程序。还可使用等同程序。"等同程序"意指下述任何序列比较程序，对于用于比对的任何两条序列而言，较之GAP版本IO产生的对应比对，其能产生出具有相同核苷酸残基匹配的比对以及相同的百分比序列相同性。本发明还包括变体核酸分子。编码除草剂抗性的核苷酸序列的"变体"包括下述这些序列，它们编码本文公开的除草剂抗性蛋白，但是由于遗传密码简并性它们有一定程度的不同，"变体"还包括上文所述足够相同的那些。可以用公知的分子生物学技术来鉴定天然存在的等位变体，例如用聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术，如下文所概述的。变体核苷酸序列还包括通过合成获得的核苷酸序列，它们是例如用定点诱变产生的，但是将仍然编码本发明公开的除草剂抗性蛋白，如下文所讨论。本发明包括的变体蛋白是具有生物活性的，即，它们保留有人们想要的天然蛋白的生物活性，即保留了除草剂抗性活性。"保留了除草剂抗性活性"意指变体将具有天然蛋白除草剂抗性活性的至少大约30%，至少大约50%，至少大约70%，或者至少大约80%。用于测量除草剂抗性活性的方法是本领域公知的。见，例如，美国专利Nos.4，535，060和5，188，642，它们每份都通过引用整体并入本文。本领域技术人员还将知道，可通过突变向本发明的核苷酸序列引入变化，由此导致被编码的除草剂抗性蛋白的氨基酸序列中的改变，而不改变蛋白的生物活性。因此，可以这样制造经分离的核苷酸分子的变体向本文公开的对应的核苷酸序列引入一个或多个核苷酸取代、添加或缺失，使得向被编码的蛋白中引入一个或多个氨基酸取代、添加或缺失。可以通过标准技术，例如定点诱变和PCR介导的诱变来引入突变。此类变体核苷酸序列也被本发明所包括。例如，可在一个或多个预定的、非关键的氨基酸残基制造保守氨基酸取代。"非关键的"氨基酸残基是下述残基，其可从除草剂抗性蛋白的野生型序列改变，但不改变生物活性，而"关键"氨基酸残基是生物活性所需要的。"保守氨基酸取代"是这样的其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基代替.具有相似侧链的氨基酸家族在本领域中已被定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、带P-支链的側链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。氨基酸取代可在保留功能的非保守区域发生。通常，此类取代将不对保守氨基酸残基，或处于保守基元(motif)(在该处的此类残基对于蛋白质活性来说是很重要的)中的氨基酸残基进行。但是，本领域技术人员将理解，功能性变体可能在保守残基处具有较少保守性的或非保守性的改变。或者，可通过在编码序列的全部或部分上随机引入突变来产生变体核苷酸序列，例如，通过饱和诱变来产生，可针对赋予除草剂抗性活性的能力对得到的突变体加以筛选，以鉴定出保留有活性的突变体。诱变之后，被编码的蛋白质可在细胞中表达，可使用标准试验技术来测定蛋白活性。使用PCR、杂交等方法，可鉴定出对应的除草剂抗性序列，此类序列具有与本发明序列的基本相同性。见，例如SambrookandRussell(2001)^Zo7ecw7arr/ofl/z2g.'JZa6orafor/J/4/2i/a/(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)和Iimis，etal.(1990)户CA户rofoco/夕.'JCw/f/etoVet力oc^a"f/Jp/7/2.caf/o/2s(AcademicPress,St.Louis,M0)。在杂交方法中，除草剂抗性核苷酸序列的全部或部分可用于筛选cDNA或基因组文库。用于构建此类cDNA和基因组文库的方法通常是本领域已知的，并在上文所述的SambrookandRussell(2001)中有所描述。所谓的杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，可用可探测基团，例如"P或任何其它可探测标志(marker)，例如其它放射同位素、荧光化合物、酶或酶辅助因子对其进行标记。可基于本文公开的编码除草剂抗性的已知核苷酸序列，对合成的寡核苷酸加以标记，来制造用于杂交的探针。可额外使用基计的简并引物。探针典型地包含下述核苷酸序列区域，所述区域在严谨条件下能与本发明的除草剂抗性编码核苷酸序列或其片段或变体的至少大约12，至少大约25，至少大约50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1600或1800个连续核苷酸杂交。用于制备杂交用探针的方法通常是本领域已知的，其公开于上文的SambrookandRussell(2001)和Sambrooketal.(1989)船/ecw/arC/o"2'w^Za6or"or/it/is/2ua/(2ded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarborNY)中，这两者都通过引用并入本文。例如，本文公开的整个除草剂抗性序列或其一个或多个部分可用作探针，所述探针能与相应的除草剂抗性序列和信使RNA特异性杂交。为在多种条件下获得特异性杂交，此类探针包括独特的(imiQue)以及至少大约10个核苷酸长的序列，以及至少大约20个核苷酸长的序列。此类探针可用于通过PCR从选定的生物扩增相应的除草剂抗性序列。该技术可用于从想要的生物中分离额外的编码序列，或者作为诊断试验，用于探测生物体中编码序列的存在。杂交技术包括对铺板的(plated)DM文库进行杂交篩选(噬菌斑或菌落，见，例如Sambrooketal.(1989)etal.(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual(2ded.，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY))。此类序列的杂交可在严谨条件下进行。"严谨条件"或"严谨杂交条件"意指下述条件，在所述条件下，探针将与其靶序列杂交至较之其它序列而言探测到的更高的程度(例如背景的至少2倍)。严谨条件是序列依赖性的，在不同环境下将有所不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严谨度，可以鉴定出与探针100%互补的靶序列(同源探查)。或者，可将严谨度条件调节为允许序列中有一些错配，从而探测到更低的相似性程度(异源探查)。通常，探针长度小于大约1000个核苷酸，奉者长度小于大约500个核普酸。典型地，严谨条件将是下述这些，其中，在pH7.0至8.3下，盐浓度小于大约1.5MNa离子，典型地，大约0.01至1.0MNa离子浓度(或其它盐)，对短的探针(例如10至50个核苷酸)而言温度为至少大约30°C，对长的探针(例如超过50个核苷酸)而言温度为至少大约60。C。严谨条件还可以通过加入去稳定剂(例如甲酰胺)来获得。示例性低严谨度条件包括用30至35°/。甲酰胺、1MNaCl、1%SDS(十二烷基硫酸钠)的緩冲溶液在37°C进行杂交，在IX至2XSSC(20XSSC=3.0MNaC1/0.3M柠檬酸三钠)中于50至55。C进行洗涤.示例性中等严谨度条件包括在40至45%甲酰胺、l.OMNaCl、1%SDS中在37°C进行杂交，在0.5X至IXSSC中于55-60。C进行洗涤。示例性高严谨度条件包括在50%甲酰胺、1MNaCl、1%SDS中在37。C进行杂交，在0.1XSSC中于60至65°C进行洗涤。可选地，洗涤緩冲液可以含有大约0.1%至大约1%的SDS。杂交持续通常短于大约24小时，通常为大约4至大约12小时。典型地，特异性是杂交后洗涤的函数，关键因子是最后的洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体而言，Tm可以从MeinkothandWahl(1984)J/a/.A/oc力e迈.138:267-284的等式估算:Tm=81.5。C+16.6(logM)+0.41(%GC)-0.61(%曱酰胺)-500/L;其中，M是单价阳离子的摩尔浓度，％GC是DNA中鸟苷和胞嘧啶的百分比，%甲酰胺是杂交溶液中曱酰胺的百分比，L是以碱基对表示的杂交体长度。Tm是(在给定的离子强度和pH下)互补靶序列的50%与完全匹配的探针杂交的温度。对于每1°/。的错配，Tm减少大约1°C;因此，可对Tm、杂交和/或洗涤条件加以调节，以与具有想要的相同性的序列杂交。例如，如果想要>90%相同性的序列，Tm可降低10°C。通常，对严谨条件加以选择，使得比给定的离子强度和pH下特定序列及其互补序列的热解链温度(Tm)低大约5°C。但是，严格的严谨度条件可利用比热解链温度(Tm)低1、2、3或4。C的杂交和/或洗涤；中等严谨度条件可利用比热解链温度(Tm)低6、7、8、9或10°C的杂交和/或洗涤；低严谨度条件可利用比热解链温度(Tm)低11、12、13、14、15或20°C的杂交和/或洗涤条件。使用该等式、杂交和洗涤组合物以及想要的Tm，本领域技术人员将能理解，杂交和/或洗涤溶液的严谨度可以固有地变化。如果想要的错配程度导致Tm低于45。C(水溶液)或32。C(甲酰胺溶液)，优选增加SSC浓度，以便可以使用更高的温度。对于核酸分子杂交的详细指导可在Tijssen(1993)^/6r/cf/z"io/jV"c/e/c爿c/dro6es，PartI，Chapter2(Elsevier,NewYork);和Ausubeletal，eds.(1995)Ci/rre/fProfoco/s7力#o/ecw/ar》2.0/0^7，Chapter2(GreenePublishingandWiley-Interscience，NewYork)中找到。见Sambrooka人(1989)#o/ecw/s_r"0/7/跟.爿L360r"or7(2ded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)。经分离的蛋白质及其变体和片段除草剂抗性蛋白也包括在本发明中。"除草剂抗性蛋白"意指具有SEQIDN0:3所示氨基酸序列的蛋白。还提供了其片段、生物活性部分和变体，它们也可用于实施本发明的方法。"片段"或"生物活性部分"包括下述多肽片段，所述多肽片段包含编码SEQIDNO:3所示的除草剂抗性蛋白的氨基酸序列的部分，并且保留有除草剂抗性活性。除草剂抗性蛋白的生物活性部分可以是长度为例如IO、25、50、IOO或更多个氨基酸的多肽。此类生物活性部分可通过重组技术来制备，并针对除草剂抗性活性加以评估。用于测量除草剂机性活性的方法是本领域公知的。见，例如，美国专利号4，535，060和5,188,642，每一专利都通过引用整体并入本文。如在本文中所用的，片段包含SEQIDNO:3的至少8个连续氨基酸。但是，本发明也包括其它片段，例如，蛋白质中超过大约IO、20、30、50、100、150、200、250、300、350或400个氨基酸的任何片段。"变体"意指下述蛋白质或多肽，它们具有与SEQIDNO:3的氨基酸序列至少大约60%、65%,至少大约70%、75%，至少大约80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸20200580047922.7说明书第12/31页合物以及想要的Tm序列。变体还包括下述核酸分子编码的多肽，所述核酸分子能在严谨条件下与SEQIDN0S:l或2或其互补序列杂交。变体包括由于诱变导致氨基酸序列有所不同的多肽。本发明包括的变体蛋白具有生物活性，即，它们继续拥有天然蛋白的想要的生物活性，即，保留有除草剂抗性活性。用于测量除草剂抗性活性的方法是本领域公知的。见，例如，美国专利Nos.4，535，060和5，188，642，它们每份都通过引用整体并入本文。本发明的细菌基因，例如^^基因，相当通常地，拥有与开放读码框的起点邻近的多个甲硫氨酸起始密码子。通常，在这些起始密码子的一个或多个起始翻译将导致功能性蛋白的产生。这些起始密码子可以包括ATG密码子。但是，细菌，例如芽孢杆菌属物种还能将密码子GTG识别为起始密码子，在GTG密码子起始翻译的蛋白在笫一个氨基酸含有甲硫氨酸。此外，通常不能预先确定这些密码子中的哪些天然在细菌中使用。因此，应当理解，使用备选的曱硫氨酸密码子之一可能导致产生赋予除草剂抗性的gi^《变体。这些除草剂抗性蛋白也包括在本发明中，并且可用于本发明的方法。本发明的多肽、其变体或片段的抗体也包括在本发明内。用于生产抗体的方法是本领域公知的(见，例如，HarlowandLane(1988)Antibodies:ALaboratoryManual(ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY);美国专利No.4，196，265)。改变的或改进的变体应当认识到，g/^的DNA序列可被多种方法改变，这些改变可能导致产生编码具有与grg8所编码的不同的氨基酸序列的蛋白的DM序列。可以以多种途径对该蛋白加以改变，包括氨基酸取代、缺失、截短和插入。用于此类操作的方法通常是本领域已知的。例如，GRG8蛋白的氨基酸序列变体可通过DNA中的突变来制备。这可通过若干形式的i秀变之一和/或通过定点进化(directedevolution)来完成。在一些方面，氨基酸序列中编码的变化将不会对蛋白质功能造成实质性影响。此类变体将具有想要的除草剂抗性活性。但是，应当理解，可通过在本发明的组合物上使用此类技术来改进GRG8赋予除草剂抗性的能力。例如，GRG8可在下述宿主细胞中表达，所述细胞在DNA复制期间展示出高比侈寸的械基错误加入(misincorporation)，命J:it口XL—1Red(Stratqgene，LaJolla，CA)。在此类菌抹中扩增之后，可以对^rg《DNA加以分离(例如通过制备质粒DNA，或者通过PCR进^f亍扩增以及将得到的PCR片段克隆进载体)，并在非诱变菌林中培养。可通过测量对于除草剂(例如草甘膦)的提高的抗性，例如通过在增加的浓度的草甘膦中培养细胞，以及对赋予对增加的浓度的草甘膦的耐受性的克隆加以测试，来鉴定出含有grg8中的突变的克隆。或者，可以在氨基或羧基末端对很多蛋白的蛋白序列加以改变，而不实质性影响活性。这些改变可包括通过现代分子方法引入的插入、缺失或改变，所述方法例如PCR，包括改变或延伸蛋白质编码序列的PCR扩增，这利用了将氨基酸编码序列包括进PCR扩增中利用的寡核普酸的过程。或者，加入的蛋白序列可包括整个蛋白质编码序列，例如通常用于本领域中产生蛋白质融合物的那些。此类融合蛋白通常用于(1)增加感兴趣蛋白的表达；(2)引入结合结构域，酶活性，或表位，以协助蛋白质纯化、蛋白质检测或者本领域已知的其它实验用途；或(3)将蛋白质靶向分泌或翻译进亚细胞细胞器，例如，革兰氏阴性细菌的周质空间，或真核细胞的内质网，后者通常导致蛋白质糖基化。本发明的变体核苷酸和氨基酸序列还包括从诱变和重组程序(例如DNA改组(shuffling))获得的序列。采用此类程序，一种或多种不同的除草剂抗性蛋白编码区域可用于制造拥有想要的性质的新的除草剂抗性蛋,白。以这种方式，从一群相关序列多核苷酸(包含具有高度序列相同性，并可被体外或体内同源重组的序列区域)产生重组多核普酸的文库。例如，使用该手段，可在本发明的除草剂抗性基因和其它已知除草剂抗性基因之间对编码感兴趣结构域的序列基元进行改组，以获得编码具有改进的感兴趣的性质(例如增加的草甘膦抗性活性)的蛋白的新基因。用于此类DNA改组的策略是本领域已知的。见，例如Stemmer(1994)5W.91:10747-10751;Stemmer(1994)#"z/re370:389-391;Cramerie"/.(1997)A""wre》/c^ec力.15:436—438;Moorea人(1997)/A/o/.272:336—347;Zhanga/.(1997)户roc.^〃.Jcad.Jc/.94:4504-4509;Cramerie"/.(1998)A""re391:288-291和美国专利Nos.5，605，793和5，837，458。转化细菌或植物细胞本发明提供了新颖的经分离基因，其赋予对除草剂的抗性。本发明还提供了GRG8蛋白的氨基酸序列。从翻译该基因得到的该蛋白允许细胞在存在对细胞(包括植物细胞和细菌细胞)有害的浓度的除草剂的情况下发挥功能。在本发明的一方面，^^《基因可用作标志，以评估细菌或植物细胞的转化。通过对gr^进行下述工程改造——(1)从已知能在待测试生物中刺激转录的细菌启动子表达，(2)正确翻译，以产生完整GRG8肽，和(3)将细胞放置于除草剂毒性浓度下，利用它们对除草剂的抗性可以鉴定出已被DNA转化的细胞。"启动子"意指功能是指导下游编码序列的转录的核酸序列。启动子以及其它转录和翻译调控核酸序列(也称为"控制序列")对于表达感兴趣的DNA序列来说是必要的。对细菌细胞的转化通过本领域已知的若干技术之一来完成，所述技术包括但不限于电穿孔或化学转化(见，例如，Ausubel(ed.)(1994)Cwrre刀f户rotoco7s2."#o/ecu/arA/0/c^7(JohnWileyandSons,Inc.,Indianapolis,IN))。赋予对毒性物质的抗性的标志可用于从未经转化的细胞(不含或不表达测试DM的那些)鉴定经转化的细胞(已具有并表达测试DNA)。在本发明的一个方面，gi^《基因可用作标志，以评估对细菌或植物细胞的转化。对植物细胞的转化可以以相似的方式来进行。"植物"意指整林植物、植物器官(例如，叶、茎、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、胚及它们的后代。植物细胞可以是分化的或未分化的(例如，愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、叶细胞、根细胞、韧皮部细胞、花粉)。"转基因植物"或"经转化的植物"或"稳定转化的"植物、细胞或组织表示已将外源核酸序列或DNA片段包括或整合进植物细胞的植物。"稳定转化"意指引入植物的核苷酸构建体整合进植物基因组，并且能被其后代所遗传。可对本发明的《r^!基因加以修饰，以获得或增强在植物细胞中的表达。本发明的除草剂抗性序列可被提供于表达盒中，用于在感兴趣的植物中的表达。"植物表达盒"包括能导致蛋白质在植物细胞中从开放读码框表达的DNA构建体。表达盒将包括以5，-3，转录的方向而言，在植物中具有功能的、与本发明的DNA序列可操作地相连的转录起始区域(即，启动子)以及翻译和转录终止区域(即，终止区域)。表达盒可额外含有至少一种额外的基因，其将被共转化进生物，所述额外的基因例如选择标志基因。或者，额外的基因可以在多个表达盒上提供。此类表达盒提供有多个限制性位点，用于插入将处于调控区域的转录调控下的除草剂抗性序列。启动子相对植物宿主和/或本发明的DNA序列来说可以是天然的或类似的，或者外源的或异源的。此外，启动子可以是天然序列，或者备选地，合成序列。启动子对于植物宿主来说是"天然的"或"同源的"的情况下，这表示，在将引入该启动子的天然植物中能找到该启动子。启动子对于本发明的DNA序列来说是"外源的"或"异源的"的情况下，这表示，启动子不是天然的，或者不是用于本发明的可操作地相连的DNA序列的天然存在的启动子。"异源的"通常指下述核酸序列，它们并非其存在的天然基因组的一部分或是细胞内源的，其通过感染、转染、微注射、电穿孔、显微操作等加入进细胞。"可操作地相连"意指启动子和第二序列间的功能性连接，其中，启动子序列起始和介导对应于第二序列的DM序列的转录。通常，可操作地相连表示，相连的核酸序列是连续的，并且，需要将两个蛋白编码区域连接时，其是连续的、按读码框连接的。通常，此类构建体还将含有5，和3，非翻译区域。此类构建体可含有"信号序列"或"前导序列"，以协助感兴趣的肽向某些细胞内结构(例如，叶绿体(或其它质体)、内质网或高尔基体(Golgiapparatus))的共翻译或翻译后转运，或被分泌。例如，可对基因进行工程改造，以含有信号肽，以协助将肽转移进内质网。"信号序列"意指下述序列，该序列已知或被怀疑能导致共翻译或翻译后的、经过细胞膜的肽转运。在真核细胞中，该转运典型地涉及向高尔基体中的分泌，其中某些导致糖基化。"前导序列"意指下述任何序列当其翻译时，产生足以触发肽链向亚细胞细胞器的共翻译转运的氨基酸序列。因此，这包括引导转运和/或糖基化的前导序列，这通过进入内质网，进入液泡，质体(包括原生质体、线粒体等)来实现。还可对植物表达盒进行工程改造，使其含有内含子，从而对内含子的mRNA加工是表达所需要的。"3，非翻译区域"意指定位于编码序列下游的核苷酸序列。聚腺苷酸化信号序列和编码调控信号(能影响聚腺苷酸片断向mRM前体的3，末端的加入)的其它序列是3，非翻译区域。"5，非翻译区域"意指定位于编码序列上游的核苷酸序列。其它上游或下游非翻译元件包括增强子。增强子是发挥作用以增强启动子区域的表达的核苷酸序列。增强子是本领域已知的，其包括但不限于，SV40增强子区域和35S增强子元件。终止区域可以是相对转录起始区域天然的，可以是相对本发明的除草剂抗性序列天然的，或者可以从另外的来源获得。可以从根癌农杆菌的Ti质粒获得方便的终止区域，例如章鱼碱合酶以及胭脂碱合酶终止区域。还见Guerineauefa厶(1991)^Zo/.Ce/.6^力e"262:14卜144;Proudfoot(1991)Ce7764:671-674;Sanfaconetal.(1991)fe/3es"er.5:141—149;Mogenefa/.(1990)/Vfl/zfCe//2:1261-1272;Munroeefa7.(1990)fe/e91:151-158;Ballaseta/.(1989)肠7e/cJ".&组17:7891-7903和Joshi"".(1987)肠/e/ck.15:9627-9639。合适的情况下，可对基因加以优化，以提高在经转化宿主细胞中的表达。即，可使用宿主细胞偏爱的密码子来合成基因，用于提高的表达，或者可以使用宿主偏爱的密码子使用频率来合成基因。通常，基因的GC含量将增加。关于对宿主偏爱的密码子使用的讨论，见，例:i口，CampbellandGowri(1990)/Va/^尸力j^/o厶92:l—ll。用于合成宿主偏爱的基因的方法是本领域已知的。见，例如，美国专利Nos.6,320,100、6，075,185、5,380,831和5，436，391，美国公开的申请Nos.20040005600和20010003849，以及Murray"a人(1989)肠/e/c爿c油紐17:477-498，它们通过引用并入本文。在一种实施方式中，感兴趣的核酸耙向叶绿体，用于表达。以这种方式，当感兴趣的核酸不直接插入叶绿体时，表达盒将额外含有编码转移肽(transitpeptide)的核酸，以将感兴趣的基因产物指导向叶绿体。此类转移肽是本领域已知的。见，例如，VonHeijneefa/.(1991)P/a/^Vo/.S/o/.Rep.9:104-126;ClarkWa/.(1989)/."2'o/.C力e迈.264:17544-17550;Della-Cioppaefa/.(1987)户/a;^户力7^7o厶84:965—968;Romerefa/.(1993)A/oc力e瓜Co2Z/迈"".196:1414-1421和Shaheta人(1986)Sc/e/7ce233:478—481。可对将靶向叶绿体的感兴趣的核酸加以优化，以在叶绿体中表达，以解决植物的核与该细胞器之间密码子使用不同的问题。以这种方式，可使用叶绿体偏爱的密码子来合成感兴趣的核酸。见，例如，美国专利No.5,380,831，其通过引用并入本文。典型地，该"植物表达盒"将被插入"植物转化载体"。"转化载体"意指对于细胞的有效转化来说必要的DNA分子。此类分子可由一个或多个表达盒构成，其可被组织为多于一个"载体"DNA分子。例如，二元载体是下述植物转化载体，它们利用两个非邻接的DNA载体，编码转化植物细胞必需的所有顺式和反式作用功能(HellensandMullineaux(2000)7>e/7C^/'/z尸7a/7f5"c/e/ce5:446—451)。"载体"指设计来在不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。"表达载体"指下述载体，其具有在外源细胞中并入、整合和表达异源DM序列或片段的能力。该植物转化载体可包含实现植物转化所需的一种或多种DNA载体。例如，利用包含超过一条的邻接的DM片断的植物转化载体在本领域中是常见的操作。这些载体在本领域中通常被称为"二元载体"。二元载体以及具有辅助质粒(helperplasmid)的载体最常用于农杆菌介导的转化，这种转化中，实现有效转化需要的DNA片断的大小和复杂度相当大，并且将不同功能分开到不同DNA分子上是有利的。典型地，二元栽体含有下述质粒载体，所述质粒载体含有T-DNA转移所需要的顺式作用序列(例如左边界和右边界)、选择标志(被工程改造为能在植物细胞中表达)以及"感兴趣的基因"(被工程改造为能在下述植物细胞中表达的基因，对所述植物细胞来说，转基因植物的产生是想要的)。在该质粒载体上还存在细菌复制所需要的序列。顺式作用序列以允许有效转移进植物细胞并且在其中表达的方式排列。例如，选择标志基因和感兴趣的基因定位于左右边界之间。通常，第二质粒载体含有反式作用因子，其介导从农杆菌向植物细胞的T-DNA转移。该质粒通常含有毒力(virulence)功能(Vir基因)，这允许通过农杆菌感染植物细胞，以及允许通过在边界序列进行的切割来转移DNA，以及Vir介导的DM转移，如本领域所理解的那样(HellensandMullineaux(2000)7^e油//7户/a/7fSc/e/7ce，5:446-451)。若干种类型的农杆菌菌林(例如LBA4404、GV3101、EHAIOI、EHA105等)可以用于植物转化。第二质粒载体对于通过其它方法(例如显孩吏操作、微注射、电穿孔、聚乙二醇等)转化植物来说并非必需的。植物转化本发明的方法涉及将核苷酸构建体引入植物。"引入"意指将核苷酸构建体以下述方式植入，所述方式使得该构建体能够进入植物细胞的内部。本发明的方法不需要使用将核苷酸构建体引入植物的特定方法，仅需要核苷酸构建体能进入植物的至少一个细胞的内部。用于将核苷酸构建体引入植物的方法是本领域已知的，其包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的方法。通常，植物转化方法涉及将异源DNA转移进靶植物细胞(例如，未成熟或成熟的胚、悬浮培养物、未分化的愈伤组织、原生质体等)，接着通过应用最大阈值水平的合适选择物(取决于选择标志基因，在本情况下是"草甘膦")，从一组未转化的细胞物质回收经转化的植物细胞。典型地，外植体被转移进新鲜提供的同样的培养基，进^f亍常规培养。随后，在放置到补充有最大阈值水平的选择试剂(例如"草甘膦")的寻生培养基上之后，经转化的细胞分化为芽。然后将芽转移至选择性生根培养基，用于得到生根的芽或小植林(plantlet)。然后转基因小植抹生长为成熟植物，产生能繁殖的种子(例如，HieiWa7.(1994)f力e户/s/^/oi/r/a/6:271—282;Ishidaefa/.(1996)iVa"re"/ofec/wo/o^r14:745-750)。典型地，将外植体转移至新鲜提供的同样的培养基，进行常规培养。关于用于产生转基因植物的技术和方法的一般性描述见AyresandPark(1994)6W〃ca"e".,//7尸/a/7f5We/7ce13:219-239和BommineniandJauhar(1997)#<27&'ca42:107-120。因为经转化的材料含有很多细胞；在经处理的任何耙愈伤组织或组织或细胞群中，经转化的和未经转化的细胞两者都存在。杀死未经转化的细胞以及允许细胞增殖的能力产生了经转化的植物培养物。通常，去除未经转化的细胞的能力是迅速回收经转化的植物细胞以及成功生产转基因植物的限制。可以使用分子及生物化学方法，以验证转基因植物基因组中整合进来的异源感兴趣的基因的存在。可以通过下述若干方法之一来进行对转基因植物的生产，所述方法包括但不限于通过农杆菌将异源DNA引入植物细胞(农杆菌介导的转化)、用附着到微粒上的异源外来DM轰击植物细胞，以及若千其它非颗粒式的直接介导方法(例如，HieiefaA(1994)r力e户/a/^/ou772a/6:271-282;Ishidaefa人(1996)5yotec力/zo7c^/14:745-750;AyresandPark(1994)Cr/〃c"^/ew//7/a/7f5We"ce13:219—239;BommineniandJauhar(1997)y^7力'cfl42:107-120)来转移DM。用于转化叶绿体的方法是本领域已知的。见，例如，Svabefa/.(1990)户roc.^a〃.Sc/.^^87:8526-8530;SvabandMaliga(1993)户roc.Jca^脱90:913-917;SvabandMaliga(1993)/.12:601-606。该方法依赖于对于含有选择性标志的DNA的微粒枪递送，以及通过同源重组将DM靶向到质体基因组。此成，这通过核编码的、质体介导的RM聚合酶的组织偏爱性表达来进行。此类体系报道于McBridea/.(1994)尸roc.W"/.Sc/.咖91:7301-7305中。可用传统方法将已^皮转化的细胞培养成植物。见，例如，McCormickera7.(1986)尸/a力fCe//Ae;or"5:81-84。然后可对这些植物力口以培养，以及用同样的经过转化的抹系或不同抹系对其进行授粉，鉴定出具有組成性表达的想要的表型特征的、得到的杂交体。可培养两代或更多代，以确保想要的表型特征的表达稳定保持并遗传，然后收获种子，以确保获得了想要的表型特征表达。以这种方式，本发明提供了下述经转化的种子(也被称为"转基因种子")，其具有稳定并入其基因组的本发明核苷酸构建体(例如，本发明的表达盒)。植物本发明可用于转化任何植物物种，其包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。感兴趣的植物的例子包括但不限于，玉米、高粱、小麦、向日葵、番茄、十.字花科植物、胡椒、土豆、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦和油菜籽(oilseedrape)、"raw/cfl、紫花苜蓿、罵麦、栗、红花、花生、甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠萝、柑橘树、可可、茶、香蕉、鳄梨、无花果、番石榴、芒果、橄榄、番木瓜、腰果、澳大利亚坚果(macadamia)、杏仁、燕麦、蔬菜、装饰用植物和针叶树。蔬菜包括但不限于番茄、莴苣、青豆(greenbean)、利马豆、豌豆和Curcumis属的成员，例如黄瓜、甜瓜(cantaloupe)和香瓜(muskmelon)。装饰用植物包括但不限于，杜鹃、八仙花(hydrangea)、芙蓉、玫瑰、郁金香、水仙、矮牵牛、康乃馨、猩猩木和菊花。优选地，本发明的植物是作物植物(例如，玉米、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、土豆、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦、油菜籽等)。本发明特别适合用于单子叶植物家族的任何成员，其包括但不限于玉米、水稻、大麦、燕麦、小麦、高粱、黑麦、蔗糖、菠萝、山药(yam)、洋葱、香蕉、椰子和枣。对植物转化的评估将异源外来DNA引入植物细胞之后，通过多种方法，例如，对与整合的基因相关的核酸、蛋白质和代谢产物的分析，来验证植物基因组中异源基因的转化或整合。PCR分析是针对在种植进土壤之前的早期阶段并入的基因的存在，筛选经转化细胞、组织或芽的快速方法(SambrookandRussel1(2001)#o/eci//arC/o/2//7f^Za6or"or/(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY))。使用特异于感兴趣的基因或农杆菌载体背景等的寡核苷酸引物来进行PCR。可以通过对基因组DM进行Southern印迹分析来验证植物转化(上文所述的SambrookandRussell(2001))。通常，从转化子提取总DNA，用合适的限制性酶消化，在琼脂糖凝胶中分级分离，并转移至硝酸纤维素膜或尼龙膜。然后可以按照标准方法(上文所述的SambrookandRussell,2001)，用，例如，经放射性标记的32P靶DM片段对膜或"印迹"加以探测，以验证引入的基因在植物基因组中的整合。在Northern分析中，按照本领域中常规使用的标准程序(如上文所述的SambrookandRussell(2001))，从转化子的特定组织分离RM，在甲醛琼脂糖凝胶上进行分级分离，然后印到尼龙滤膜上.然后按照本领域已知的方法(如上文所述的SambrookandRussell(2001)),通过用滤膜与从GDC获得的放射性探针杂交，对grg8编码的RNA的表达加以检测。Western印迹和生物化学试验等可通过标准方法(如上文所述的SambrookandRussell(2001))在转基因植物上进行，以确定除草剂抗性基因编码的蛋白质的存在，其中使用与除草剂抗性蛋白上存在的一种或多种表位结合的抗体。下述实施例以阐述方式提供，而不作限制之用。实验实施例1:分离ATX4145通过将土壤样品分散到含有草甘膦作为唯一磷源的EnrichedMinimalMedia(EMM)上来分离ATX4145。因为EMM不含芳香族氨基酸，菌林为了在该培养基上生长必须对草甘膦有抗性。将两克土壤悬浮于大约30ml水中，在超声波水浴中超声波处理30秒。旋转震荡(vortex)样品5秒，令其静置60秒。该过程重复3次。取100W该悬浮液，加入到含有4mM草甘膦的3mlEMM(pH6.0)中。EMM含有(每900ml):10g蔗糖、2gNaN03、1.0ml0.8MMgSO"1.0ml0.1MCaCh、1.0ml痕量元素溶液(在100mllOOOx溶液中0.1gFeS047H20、0.5mgCuS045H20、1.0mgH萬、1.0mgMnS045H20、7.0mgZnS04.7H20、1.0mgMo03、4.0gKC1)。于21。C在组织培养辊筒(rollerdrum)上对培养物振荡16天，然后用100Ml接种3ml新鲜的E醒，其中含有作为唯一磷源的4mM草甘膦。5天后，用100Hi接种另外的新鲜的3ml培养物。足够的培养之后，通过用1W的环划线到琼脂平板(含有E醒琼脂，其中含有5mM草甘膦作为唯一的磷源)表面上，来将培养物涂布到固体培养基上，J^藏于-21。C。然后对培养物重复涂板，以进行分离。由于其在存在高浓度草甘膦的情况下生长的能力，选出被称为ATX"45的一种特定菌林，在LuriaBertani(LB)琼脂上，菌落是白色的、圆形的，大小(pinsize)为1mm，革兰氏染色阴性。实施例2.制备及筛选粘粒文库使用本领域公知的方法，从ATX4145的培养物提取总DNA。按照厂商说明书，用限制性酶i^w^7对DNA进行部分消化，与SuperCos(Stratagene)载体片段连接。使用GigaPackIIIXL包装提取物(Stratagene)将连接产物包装进噬菌体颗粒，转染进大肠杆菌细胞，涂布到含有50Pg/ml卡那霉素的LB琼脂上，筛选含有粘粒的菌落。捡出大约1100个菌落用于筛选。在含有50fxg/ml卡那霉素的丰富液体培养基上培养菌落，然后用针挑到M63琼脂培养基上，该培养基含有50Pg/迈1卡那霉素和7mM草甘膦。M63琼脂培养基含有100mMKH2P04、15mM(NH4)2S04、50MMCaCl2、1MMFeS04、50MMMgCh、55niM葡萄糖、25mg/升的L-脯氨酸、10mg/升的盐酸硫胺素、足够的NaOH以将pH调节为7.0，以及15g/升的琼脂。鉴定出在存在7mM草甘膦时生长的若干个菌落。从这些菌落中的每个制备粘粒，再次转化进大肠杆菌XL1BlueMRF细胞。在每种情况下，经过粘粒DNA再转化的细胞在存在5mM草甘膦时能在M63培养基上生长，而含有空的SuperCos载体的细胞则不长。被称为3-M5的一个粘粒被选用来进行进一步分析。该粘粒后来被重新命名为pAX298。实施例3.在粘粒pAX298中鉴定gr《《为鉴定出负责粘粒PAX298所显示出来的草甘膦抗性的基因，用可转座元件对来自该克隆的DNA进行诱变。用这种方法，鉴定出已经历转座子插入并且丢失了赋予草甘膦抗性的能力的克隆。转座子插入的定位鉴定出负责草甘膦抗性表型的开放读码框。使用EZ::TN插入试剂盒(Epicentre,Madison,WI)和厂商的方案，对粘粒pAX298进行体外转座子诱变。该方法向粘粒DNA中随机插入转座子片段，由此随机破坏粘粒中基因的功能。这种特别的转座子含有编码对三甲氧节二氨嘧啶抗性的基因，因此可以通过在存在该抗生素时生长的能力来选出转座子插入克隆。可以通过绘制限制性片段图谱或者通过用在转座子中退火的引物进行测序，来测定转座子插入的定位。将PAX298的转座子插入克隆涂布到含有草甘膦的M63培养基上。发现有三个克隆丢失了在存在草甘膦时生长的能力，这表明转座子已破坏了负责抗性的基因。使用本领域公知的测序方法，对含有转座子插入的pAX298区域测定DNA序列，其如下文所示。鉴定出了开放读码框(0RF，SEQIDN0:1的从第296至第1555碱基)。对来自丟失了对草甘膦的抗性的四个转座子插入检出菌落的序列信息的分析揭示所有四个插入都在0RF中。这表明ORF编码了粘粒赋予的抗性。实施例4.GRG8与其它蛋白的同源性该0RF的推断氨基酸序列与EPSP合酶具有同源性，这表明该0RF编码EPSP合酶。将粘粒pAX298转化进大肠杆菌ar"-，这是其中天然ard基因(编码EPSP合酶)已缺失的菌抹。该菌林不能在M63培养基上生长，因为其需要外源提供的芳香族氨基酸。粘粒pAX298的存在补全wW-表型，即，其允许该菌株在M63培养基上生长，而无须外源提供的芳香族氨基酸。这是粘粒含有EPSP合酶基因的进一步证据。该基因被称为grg《。对推断出的氨基酸序列(SEQIDN0:3)的检查揭示其不含II类EPSP合酶所典型的四个结构域。因此，这是新颖的、非II类、草甘膦抗性EPSP合酶。实施例5.对gr^y进行工程改造，用于在大肠杆菌中表达GRG8蛋白通过PCR扩增grg《开放读码框(0RF)，将其克隆进质粒栽体pCR-Blunt-II(来自Invitrogen)，转化进大肠杆菌菌抹DH5oc,制备质粒DNA，通过限制性消化来测定插入物的存在和定向。一个克隆含有相对于载体中的lac启动子而言正向的0RF。该质粒被称为pAX299。对该插入物进行测序，针对赋予对草甘膦的抗性的能力对该质粒加以测试。于2004年12月21日将含有fW0RF的质粒pAX299保藏于AgriculturalResearchServiceCultureCollection(證U，分配的编号为No.NRRLB-30804。实施例6.gi^《赋予对高水平草甘膦的抗性使用含有空载体的细胞作为对照，针对在存在草甘膦时在M63培养基上生长的能力，对pAX299加以测试。将宿主菌林DH5ot中的质粒pAX296用作阴性对照。该质粒含有克隆进载体pCR-Blunt-II的烟草基因组DM的片段。结果概括于表l中。两种菌林的起始培养物生长于含有50Hg/ml卡那霉素的M63培养液中，以维持质粒。将起始培养物稀释至大约相等的细胞密度(通过测量0D600测定的)，然后按照1至200稀释进3mlM63培养液(含有0至200mM草甘膦)。每种浓度的每种菌林取重复的三份3ml培养物进行培养。在恒定振荡下于37。C对培养物加以培养。大约46小时后，回收0.3ml的小份，测量OD,。结果示于表1中。数值代表平均值+标准偏差。这些结果显示，GRG8赋予对高水平的草甘膦的抗性。表l.含有grg8的pAX299的草甘膦抗性<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>实施例7.纯化在大肠杆菌中作为6xHis标签化蛋白质表达的GRG8使用PfuUltra脇polymerase(Stratagene),通过PCR扩增g7^编码区域。设计用于引导PCR的寡核苷酸，以在得到的PCR产物的5，和3，末端附近引入限制性酶识别位点。用消化得到的PCR产物。将经消化的产物克隆进通过用5WI消化制备的6xHis标签表达载体pRSFlb(Novagen)。得到的克隆含有处于与6xHis标签同一翻译读码框中的GRG8，并且在该标签的恰好C-末端。用于产生此类克隆，以及用于表达含有6xHis标签的蛋白的一般性策略是本领域已知的。通过将细胞涂布到含有5mM草甘膦的M63培养基上来验证该克隆赋予草甘膦抗性的能力。确定含有grg《的克隆在该浓度的草甘膦上生长的能力。可在SDS-PAGE蛋白质凝胶上测定GRG8蛋白的表达水平。可以按照厂商说明书，通过色谱(例如，在Ni-NTASuperflowResin(Qiagen)上进行的)，对谦导的GRG8蛋白进行纯化，来分离GRG8蛋白。实施例8.对gM《的诱变以及对功能性变体的分离使用本领域已知的基于PCR的诱变，对g/^开放读码框进行诱变。使用变化的量的输入DNA，使用Genemorph诱变试剂盒(Stratagene),对含有grg《的质粒pAX700进行扩增。纯化得到的PCR产物，用5a威I和治'/k/HI进行消化，重新纯化，并连接进经修饰pRSFlb载体(Novagen)。将得到的文库转化进大肠杆菌，挑进384孔板，在37。C培养至饱和。将得到的384贮板(stockplate)印到最小培养基(M63plus)上，该培养基补充有卡那霉素并且具有不同浓度的草甘膦。选出赋予对50mM草甘膦的抗性的经诱变克隆(如表2所示)。对于这些克隆的亚组，制备DNA，测定wg《变体的DM序列。表2.表达gr^变体的大肠杆菌在存在草甘膦时的生长<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>实施例9.对ffr^P进行功能改造，用于植物转化通过聚合酶链式反应，从全长cDNA模板扩增^rg《开放读码框(0RF)。PCR期间向0RF的每个末端都加上#//7cnn限制性位点。此外，在基因的起始密码子的恰好5，处加入核苷酸序列ACC,以增加翻译效率(Kozak(1987)15:8125-8148;Joshi(1987)^f/c7e/ciesearc力15:6643-6653)。使用本领域公知的技术，对PCR产物克隆并测序，以确保PCR期间没有引入突变。用例如iW/^in消化含有^rg《PCR产物的质粒，分离含有完整0RF的片段。在该实施例中，将片段克隆进质粒(例如pAX200，这是含有7jc稻肌动蛋白启动子(McElroyets厶(1991)#o/ec.Ce仏Ce/7e"231:150-160)和PinII终止子(Anefa/(1989)r力e户7a/^Ce/71:115-122)的植物表达载体)的W/2cfni位点。然后将来自该中间质粒的启动子-基因-终止子片段亚克隆进质粒，例如pSBll(JapanTobacco,Inc.)，以形成最终的质粒，其在本文中被称为pSBllGRG8。对pSBllGRG8加以组织，使得含有启动子-^^《-终止子构建体的DNA片段可通过合适的限制性酶进行的双消化被切割，并还用于通过例如气溶胶胶束注射转化进植物。通过限制性消化和凝胶电泳，以及通过跨越多个克隆连接处的测序，来验证pSBllGRG8的结构。使用本领域公知的三亲林交配方案，并涂布到含有壮观霉素的培养基上，将质粒移入根癌农杆菌菌林LBA4404，其还含有质粒pSBl(JapanTobacco,Inc.)。质粒pSBllGRG8携带有抗生素抗性，但是其是窄宿主范围的质粒，并且不能在农杆菌中复制。当pSBllGRG8通过同源重组整合进广宿主范围的质粒，例如pSBl中时，产生抗生素抗性菌落。通过Southern杂交验证得到的共整合产物。携带有共整合物的农杆菌菌抹然后可用于转化玉米，例如，通过Purelntro方法(JapanTobacco)进行。实施例10.将《r^转化进植物细胞在授粉后8-12天的最好时机收集玉米穗。从穗上分离胚，大小为0.8-1.5mm的胚优选用于转化。以盾片侧朝上的方式将胚分布到合适的孵育培养基上，例如DN62A5S培养基(3.98g/LN6盐；1mL/L(的1000xHi液)N6维生素；800mg/LL-天冬酰胺；100mg/LMyo-肌醇；1.4g/LL-脯氨酸；100mg/L酪蛋白氨基酸；50g/L蔗糖；1mL/L(的1mg/mL贮液)2，4-D)。但是，非DN62A5S的培养基和盐也是合适的，并且是本领域已知的。在黑暗中于25。C对胚进行过夜培养。但是，对胚进行过夜培养本身并非必须。将得到的外植体转入方形筛网(每板30-40)，转到渗透培养基上，大约30-45分钟，然后转入胶束处理(beaming)板(见，例如PCT发明者P·E·哈默,T·K·欣森申请人:阿则耐克斯公司