专利名称：使哺乳动物的恶性细胞选择性地处于甲硫氯酸饥饿状态的方法
技术领域：
本发明涉及基于恶性细胞与非恶性细胞(即“正常”)细胞之间的代谢差异，选择性地破坏哺乳动物恶性细胞的方法。更具体地说，涉及通过将血浆甲硫氨酸和高半胱氨酸降解而使丧失了将5′-甲硫腺苷转化为甲硫氨酸所需酶的恶性细胞处于饥饿状态的方法。
甲硫氨酸(MET)是正常和恶性细胞生长所必需的。在某些恶性细胞中这种需求是纯对的，即，没有适当供应的MET，细胞就死亡。
在哺乳动物细胞中，MET可由三种来源获得，从食物中获得，或者通过从L-高半胱氨酸(高半胱氨酸)或5′-甲硫腺苷(MTA)(一种聚胺生物合成途径的产物)生化合成获得。在后一种情况下，由5′-甲硫腺苷磷酸化酶(MTA酶)将MTA转化为MET。
在过去的十年中，研究者已经鉴别了许多失去了MTA酶并因此不能将MTA转化为MET的恶性细胞系。例如，Katamari等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，781219-1223(1981)报道了3个人恶性肿瘤细胞系中23％缺乏可检测的MTA酶，而在所研究的16个非恶性细胞系中每一个都存在MTA酶活性。MTA酶阴性细胞主要通过转化高半胱氨酸满足对MET的需要。但是，当高半胱氨酸得不到时，通常细胞将会死亡。
已知L-甲硫氨酸-L-脱氨基-y-巯基甲烷裂解酶(1-methionine-L-deamino-y-mercaptomemane lyase)(ED 4.4.1.11；MET酶)不仅能降解MET，也能降解高半胱氨酸。因此，从理论上说，可通过用MET酶将血浆MET和高半胱氨酸降解而使丧失MTA酶的恶性细胞(即MTA酶阴性细胞)饥饿。正常MTA酶阳性细胞预期通过连续地将MTA转化为MET，可满足其对MET的需求。
首先由Kreis在Cancer Treat.Rprts.631069-1072(1972)中提出了所述方法的初步方案。利用在没有MET的培养基中培养的11个恶性细胞系，Kreis通过给所述培养物供应MET酶而能够使恶性细胞的生长受到一定程度的抑制。Kreis还观察到当向这些培养物中加入高半胱氨酸时，2个正常细胞系部分地避开了MET饥饿的作用。虽然体外研究令人鼓舞，但在体内使用MET酶成功地进行化疗的途径中Kreis描述了存在的几个障碍，包括无法获得使体内正常细胞存活的方法，纯化或部分纯化的酶的潜在免疫原性，以及该酶必须对体内蛋白水解酶的降解具抗性(Kries，Chemotherapy(Muggia，FM，ed.，The Hague，Boston，and LondonMartinus-Nijihoff，1983)，pp.219-248)。
研制使恶性细胞处于MET饥饿状态的成功方法的另一障碍是需要鉴别适用于作为治疗的靶目标的恶性疾病，即何种恶性细胞是MTA酶阴性。为此，研制了一种检测方法，通过确定细胞培养物中是否存在催化活性而预测恶性细胞是否MTA酶阴性(Seidenfeld，等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，951861-1866，1980)。但是，由于该活性检测方法需要的放射性化学物质从商业途径无法获得，因此将其用于常规评估目前还不是可行的。而且，通过检测细胞培养物中是否存在这种酶，而不管在进行检测时该酶是否有催化活性，因而该活性检测法没有考虑到MTA酶体外催化的不稳定性。
通过研制可足够灵敏地检测相当微量的酶的免疫检测法可以避免该活性检测法的局限性。但是，从天然来源纯化MTA酶用于研制在MTA酶的免疫检测中使用的抗体已经证明是一种费力的方法，效率很低(Rangione等人，J.Biol.Chem.，26112324-12329，1986)。
即使研制出了检测MTA酶阴性细胞的合适方法，则从天然来源生产足够量的MET酶与生产MTA酶同样困难。目前还没有获得除纯化天然酶的方法以外的生产MET酶的方法，部分原因是对编码MET酶的基因(至目前为止)仅进行了部分测序(Nakayama等人，Biochem.，271587-1591，1988)。
由于上述原因，使MTA酶恶性细胞体内处于MET饥饿状态的有效方法仍然难以成为现实。本发明满足了这种需要。
结合检测MTA酶阴性细胞的方法，本发明包括一种选择性地使MTA酶阴性细胞处于饥饿状态的改进方法。根据该方法，用治疗学上有效量的MET酶，优选的是重组MET酶，更优选的是用乙二醇或一种等效分子相结合的重组MET酶治疗已被确认为是MTA酶阴性的恶性细胞。更具体地说，给哺乳动物(优选的是人)施用一定剂量的MET酶，所述剂量的MET酶将使血浆MET含量降低至足以使MTA酶阴性细胞处于甲硫氨酸饥饿状态(通常是在≤治疗前甲硫氨酸水平的约10％时出现饥饿)。正常(MTA酶阳性)细胞通过基本上同时施用的MTA而获得MET的供应。
本发明还包括检测恶性肿瘤中MTA酶阴性细胞的方法。更具体地说，一方面包括抗-MTA酶抗体(包括单克降抗体)的制备，以及所述抗体在针对MTA酶的免疫检测中的应用。另一方面，包括通过使用基于核酸扩增技术的检测方法特别是聚合酶链反应(PCR)而检测编码MTA酶基因的存在。
本发明还包括从编码MET酶基因的分离和克隆而研制的重组MET酶，从而可以生产相当量的MET酶，以用于本发明的方法中。
附图简述
图1图解显示聚胺合成的代谢途径以及由MTA酶对MTA的还原。
图2将由免疫印迹分析法检测的MTA酶阳性和MTA酶阴性人和非人细胞系进行比较。
图3将由免疫印迹分析法检测到的MTA酶阳性和MTA酶阴性人细胞系与原发肿瘤进行比较。
图4将用MET酶处理的MTA酶阴性人细胞的生长情况与在富含甲硫氨酸的条件下生长的情况进行比较。
本发明详细描述1.检测MTA酶阴性细胞的方法附图1图解描述从MTA体内合成MET以及由MET酶降解MET的代谢途径。如上文中指出的，为了使甲硫氨酸饥饿癌治疗取得最好效果，必须检测靶恶性状态细胞中的MTA酶阴性细胞。为此，下文中描述了检测MTA酶的另一种方法，该方法适合用于本发明方法中。
A.MTA酶的免疫检测1.抗原MTA酶和MTA酶肽的制备通过用抗原MTA酶或MTA酶肽接种非人动物而制备特异于MTA酶的抗体。通常，根据由Ragnione等人，J.Biol.Chem.，2656241-6246(1990)描述的方法可从哺乳动物组织中分离和纯化抗原MTA酶肽。在下面实施例中描述了实施本发明方法的例子。作为参考，本文中包括了全长MTA的氨基酸序列，SEQ ID NO.1。
2.用抗原性MTA酶肽免疫接种以制备抗MTA酶抗体一旦获得了抗原MTA酶或MTA酶肽，通过将该肽导入到哺乳动物(例如兔，鼠或大鼠)而生产抗该免疫接种肽的抗体。为了说明起见，在附后的序列表中提供了两个抗原MTA肽的氨基酸序列，SEQ ID NO.2和3。用这些肽免疫接种兔而生产的抗体对分别以1∶1500和1∶4000稀释的纯化MTA产生50％最大应答。
在用抗原MTA酶肽免疫接种动物中优先使用多次注射接种方案(参见例如，Langone等人，eds.，“Production of Antisera with Small Doses ofImmunogenMultiple Intradermal Injection”，Methods of Enzymology(Acad.Press，1981))。例如，将1mg的抗原MTA酶肽(用完全佛氏佐剂乳化)皮下注射兔，几个星期之后注射相同抗原(于不完全佛氏佐剂)的一或多次加强剂量，可以获得良好的抗体应答。
如果需要，利用本领域内已知技术通过接合将免疫接种肽偶合到一个载体蛋白上。这种化学偶合到该肽上的常用的载体包括钉形贝血蓝蛋白(KLH)，甲状腺球蛋白，牛血清白蛋白(BSA)，以及破伤风类毒素。然后将该偶合的肽用于接种动物(例如小鼠或兔)。由于目前认为在哺乳动物种内MTA酶是保守的，因而使用一种载体蛋白加强MTA酶蛋白的免疫原性是优选的。
例如通过结合到一种基质上并从该基质上洗脱可进一步纯化通过接种动物产生的多克隆抗体，其中所述基质上结合了用于产生该抗体的肽。本领域内技术人员知道在免疫领域内普遍用于多克隆抗体以及单克隆抗体的纯化和/或浓缩的各种技术(参见，例如，Coligan等人，Unit 9，Current Protocals inImmunology，Wiley Interscience，1991)。
由于单克隆抗体的特异性高以及制备方便，优选将单克隆抗体用于检测MTA酶阴性细胞。为了制备单克隆抗体，优选的是免疫接种小鼠或大鼠。本发明中使用的术语“抗体”还包括整个分子和其片段，例如能够结合表位抗原决定基的Fab和F(ab′)2。在本文中，术语“本发明的mAb”指对MTA酶具特异性的单克隆抗体。
用于生产分泌单克隆抗体(“mAb”)的杂交瘤的一般方法是公众熟知的(Kohler和Milstein，Nature，256495，1975)。简单地说，正如Kohler和Milstein描述的，该技术包括从5位分别患有癌症的患者的局部排液淋巴结(regionaldraining lymph node)分离出淋巴细胞，这5名患者分别患有黑色素瘤，畸胎瘤或者子宫颈癌，神经胶质瘤或肺癌。通过外科手术获得淋巴细胞，收集在一起，然后与SHFP-1融合，筛选出可以产生与癌细胞系相结合的抗体的杂交瘤。可利用相同技术生产和鉴别与MTA酶具特异性的mAb。
利用最常规的筛选技术(例如酶免疫吸附分析法，即ELISA)检测mAb的基本反应模式即可完成对本发明mAb中MTA酶特异性的确认。
通过测定所检测的mAb是否能阻止本发明的mAb与MTA酶结合，不需经过过多实验即可确定该mAb是否具有类似于本发明mAb的特异性，从而对该mAb进行评估。如果所检测的mAb与本发明的mAb竞争，使本发明的mAb的结合能力降低，那么可能两种单克隆抗体可结合到相同或密切相关的表位决定簇上。
测定一种mAb是否具有本发明mAb的特异性的另一种方法是用通常与它能发生反应的一种抗原与本发明的mAb一起预培养，并确定所检测的mAb与该抗原的结合能力是否被抑制。如果所检测的mAb被抑制，那么可能它与本发明的mAb具有相同或密切相关的表位决定基特异性。
3.检测MTA酶阴性细胞的免疫检测方案一旦按如上所述获得了合适的抗体，可将它们用于检测恶性细胞中的MTA酶。下文实施例I中进一步描述了适用于该目的免疫检测法的实例(即，一种免疫印迹方法)。但是，免疫技术领域内技术人员将会认识到，在其他免疫检测方法中利用液相或固相(当结合到一种载体)的上文中描述的抗体也可以检测MTA酶。
利用正向、逆向或两者同时进行的模式操作的免疫检测，包括用生理样品进行的免疫组织化学检测法可以实现用抗-MTA酶抗体检测MTA酶。合适的免疫检测方案包括以直接或间接方式进行的竞争性和非竞争性方案。所述免疫检测的例子是放射性免疫检测(RIA)和夹心(免疫测量)检测法。本领域内技术人员将会知道或很容易认识到不需化费过多实验进行的其他免疫检测方法。
另外，可对免疫检测法中使用的抗体进行可检测的标记。标记物是可共价吸附到或牢固结合到一种核酸探针上的物质，从而使该探针可被检测。例如，一种标记物可以是放射性同位素，一种酶底物或抑制剂，一种酶，一种不透射线的物质(包括胶态金属)，一种荧光剂，一种化学发光分子，含有上述任何标记物的脂质体或一种特异性结合对(Specific binding pair)成员。一种合适的标记物在扩增期间不会丧失其可被检测这一特性。
诊断领域内熟练技术人员对用于体外检测试验中的合适的可检测标记是熟悉的。例如，合适的放射性同位素包括3H，125I，131I，32，14C，35S。采用γ计数器或者采用放射自显影密度测定，采用与密度测定相结合的经扩增片段的Southern印迹分析法可直接检测被放射性同位素标记的扩增的片段。合适的化学发光分子的例子是吖啶或鲁米诺。通过插入可保护与吖啶酯衍生的探针进行杂交的靶序列免遭水解。合适的荧光剂的例子是荧光素，藻胆蛋白，稀土螯合剂，丹磺酰或若丹明。
合适的酶底物或抑制剂的例子是那些与辣根过氧化酶，葡萄糖氧化酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，β-半乳糖苷酶，丙酮酸激酶或碱性磷酸酶乙酰胆碱酯酶特异性结合的化合物。不透射线物质的例子是胶态金或磁粒。
一个特异性的结合对(Specific binding pair)包括两个不同的分子，其中分子之一在其表面或其腔内具有与另一分子的特定空间和极化结构特异性结合的区域。经常将特异性结合对的成员称作为配体和受体或配体和抗-配体。例如，如果受体是一种抗体，则配体是对应的抗原。其他特异性结合对包括激素-受体对，酶底物对，生物素-抗生物素蛋白对以及糖蛋白-受体对。还包括保留结合特异性的特异性结合对的片段和部分，如免疫球蛋白片段，包括Fab片段等等。抗体可以是单克隆或多克隆的。如果将特异性结合对的一个成员用作为标记物，优选的分离步骤包括亲和层析。
该抗体还可以结合到一种载体上。公知的载体的例子包括玻璃，聚苯乙烯，聚丙烯，聚乙烯，葡聚糖，尼龙，直链淀粉，天然的和经修饰的纤维素，聚丙烯酰胺，琼脂糖和磁铁矿。为了达到本发明目的，载体的特征可以是可溶性的或不溶性的。本领域内技术人员熟知其他结合抗体的合适载体，或者利用常规实验可确定这些载体。
B.利用基于PCR的检测法检测MTA酶阴性细胞由于利用本文中描述的MTA酶特异性抗体进行的免疫检测法提供的检测手段十分容易和快速，因而免疫检测法是检测MTA酶阴性细胞的优选手段。但是，本领域内技术人员会认识到可以使用用于检测恶性细胞中MTA酶阴性细胞存在的其他检测手段。例如，利用SEQ ID NO.1中描述的核酸序列，本领域技术人员可以构建与细胞样品中存在的MTA酶DNA进行杂交的寡核苷酸探针。相反，因为据认为MTA酶缺陷型是由于基因组缺失了编码MTA酶蛋白的基因引起的，可以假定如果在一个细胞中未检测到编码MTA酶的基因，则可认为该细胞是MTA酶阴性。
在审美国专利申请(流水号NO.08/176,855(1993年12月29日申请)中提供了扩增和检测MTA酶基因的详细方案。将在审专利申请NO.08/176,855中公开的所述方案引入本文作为参考。
C.用于MTA酶饥饿治疗的MTA酶阴性候选细胞用于作为本发明治疗法(即MET饥饿疗法)的候选者的恶性细胞是一种在其中未检测具催化活性或不具催化活性的MTA酶蛋白质。在至今研究的所有恶性细胞系中，MTA阴性状态(如果存在)是细胞群体具有的一致特性。换句话说，如果恶性状态的一些细胞是MTA酶阴性，可预期该恶性肿瘤的所有细胞是MTA酶阴性。这与本领域内认为MTA酶缺陷型是基因缺失而不是突变造成的观点相一致。与针对异质特征的治疗方法相比，当对处于MTA酶阴性均一的恶性细胞进行MET饥饿法的癌症治疗时，显著地提高了治疗效率，其中所述针对异质特征的治疗法是例如在单克隆抗体治疗法中靶击肿瘤抗原的方法。但是，在本发明的方法中，恶性细胞“基本上缺失”MTA酶(即它们不含有可检测量的MTA酶蛋白质)即可。
目前认为基本上缺失MTA酶的人恶性细胞包括表1恶性肿瘤由下列方法测出MTA酶缺失非小细胞肺癌 免疫检测法◆A-549(腺肉瘤)Sk-Lu-1(腺肉瘤)H 322(支气管肺泡癌)H 1334(大细胞癌)H 1437(腺肉瘤)H 1581(大细胞癌)*脑肿瘤细胞系 免疫检测法◆A 172U-87MGU-138MGHs 683初级脑肿瘤免疫检测法◆
星形细胞瘤多形性神经胶质瘤寡星形细胞瘤(Oligostrocytoma)淋巴瘤和白血病 免疫检测法◆CEM(急性淋巴白血病)K-T-1(急性淋巴白血病)NALL-1(急性淋巴白血病)K562(慢性骨髓性白血病)DHL-9(恶性淋巴瘤)HSB 2(急性淋巴白血病)其他Walker 256腺肉瘤临床证据**Jurkat 免疫检测法***K 562 免疫检测法***Capan-1(胰脏腺肉瘤) 免疫检测法****说明*得自美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD.**由Kries等人，Cancer Res.，331866-1869(1973)报道。***由Rangione等人，Biochem.J.281533-538(1992)报道****由Kries等人，Cancer Trmt.Rpts.，631069-1072(1979)报道◆由Nobori等人，在Cancer Res.531098-1101(1993)和在Cancer Res.513193-3197(1991)检测和报道的所有其他MTA酶缺陷型恶性细胞。
利用本文中描述的检测技术，本领域内熟练技术人员在不需过多实验的条件下能够检测到MTA酶缺陷的其他恶性细胞。
II.MET饥饿疗法A.MET酶的生产为使用本发明方法，需要MTA和MET酶来源。获得MTA的方法如上文所述。为了用于本发明方法，从微生物包括阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis)(Lockwood等人，J.Biochem.279675-682，1991)，产孢梭菌(Clostridium sporogenes)(参见例如，Kries等人，见上文，1867；EC 4.4.1.11)，以及恶臭假单孢菌(Pseudomonas putida)(Nakayama等人，Biochem.，271587-1591，1988)中纯化MET酶。
利用从恶臭假单胞菌构建的cDNA文库，已经鉴别出了MET酶的全长核苷酸序列，并包含于序列表中的SEQ ID NO.4中；其氨其酸序列包含于SEQ ID NO.5中。
利用这些资料，利用上文中描述的有关MTA酶的已知技术，可以方便地合成MET酶或者从一个DNA克隆表达。在下文的实施例II和III中进一步提供了将MET酶克隆到大肠杆菌中并在其中表达的详细实施例。
当将纯化的，部分纯化的，合成的或重组MET酶用于本发明的治疗方法中时，由于后一生产方法比较容易并且免疫原性非常低因而是优选的。通过将其偶合到聚乙二醇(PEG)或者一种等效的生物相容分子上可进一步降低并且优选地降低该酶的免疫原性。预期与PEG结合后可降低MET酶结合物的体内半衰期。
按照有关对L-天冬酰胺的方法的描述(参见，例如，Benedich等人，Clin.Exp，Immunol.48273-278，1982)，通过将PEG共价联接到MET酶上可以形成PEG-MET酶结合物。将PEG与蛋白质结合的方法是本领域内熟知的。因此在此不再进一步详细描述。基于用结合到PEG的L-天冬酰胺酶对非何杰金氏(non-hodgkins)淋巴瘤进行治疗的人临床试验观察到的结果，MET酶与PEG结合后并不如预期的那样显著地降低其体内活性(参见，用PEG-L-天冬酰胺酶获得的体内结果，Muss等人，Invest.New Drugs，8125-130(1990))。但是，本领域技术人员将会认识到延长蛋白质的体内半衰期的其他方法是已知的，并且这些方法适用于MET酶，这些方法包括但不限于糖基化作用和琥珀酰作用。
B.治疗方法根据本发明使用MET酶作为治疗基本上缺失MTA酶的恶性肿瘤的一部分。优选地，这样的恶性肿瘤是那些可以通过局部化疗治疗的恶性肿瘤；即该恶性肿瘤定位并包含于身体的一个区域，通过动脉内输注或者通过局部、皮下或等同途径可将MET酶直接施用到恶性位点处。可进行局部化疗的恶性肿瘤的例子有黑素瘤，卵巢癌(借助于一个腹膜导管)和膀胱癌(借助于尿道导管)。肿瘤学领域内技术人员将知道根据本发明局部化疗方法治疗的MTA酶阴性的其他恶性肿瘤。
本领域内技术人员还会认识到本发明的治疗组合物也可以全身给药。但是，必须要对剂量进行调整，补偿该组合物的清除以及对正常细胞的潜在毒性。特别是，必须密切监视正常细胞的甲硫氨酸饥饿的临床证据，并且如果必要可通过以额外量的MTA给药进行补偿。
优选采用本发明方法按如下所述对基本上缺失MTA酶的恶性肿瘤进行治疗。
采用胃肠外途径将MET酶施用到哺乳动物(优选的是人)，优选的途径是通过动脉内输注给药。将MET酶与药物学上可接受载体一起给药，所述载体包括无菌水或非水溶液、悬液和乳液。非水溶剂的例子是丙二醇，聚乙二醇，植物油例如橄榄油和可注射的有机酯例如油酸乙酯。含水载体包括水，醇/水溶液，乳液或悬液，包括盐水和缓冲介质。如上文所述，优选地将MET酶结合到PEG上以降低其免疫原性。
胃肠外载体包括氯化钠溶液，林格氏葡萄糖，葡萄糖和氯化钠，乳酸林格氏溶液或固定油。静脉内用载体包括液体和营养补剂，电解质补充剂(例如基于林格氏葡萄糖的补充剂)等等。还可以加入防腐剂和其他添加剂例如抗微生物剂、抗氧化剂，螯合剂以及隋性气体等等。
MET酶的用药量从约10单位/m2-20,000单位m2，优选的是从约5000-6000单位/m2(或者当以动脉内输注给药时可以使用更低剂量)范围内变化，该用药量在一星期内分一至多次剂量给药，使用一或几天。一般认为，在用药24小时内哺乳动物可清除MET酶；使用延长该酶半衰期的方法例如PEG结合，该半衰期可延长几小时至几天时间。因此，应该监测哺乳动物血浆甲硫氨酸水平，如果必要，施用附加剂量的MET酶以使哺乳动物的血浆甲硫氨酸溶度达到治疗上的显著降低。这种降低作用足以诱导MTA酶阴性细胞的体积达到可检测量的降低即哺乳动物负载的恶性细胞或肿瘤的体积降低。达到这一效果所使用的药量被认为是一种“治疗有效”剂量。以使用部分纯化的MET酶在啮齿动物中进行的体内研究为基础，一般认为治疗有效量是将患者的血浆甲硫氨酸水平降低至约≤治疗前水平的10％所需的药剂量。
通过对在整个给药期间从接收MET酶的患者中抽取的血样品进行定期(并且优选是每日)体外检测可以监测血浆甲硫氨酸水平(以及其中的变化)。通常，基于在啮齿动物中进行的研究，预期在MET酶给药约1小时内血浆甲硫氨酸水平将降低至≤治疗前水平的10％。对血浆中甲硫氨酸进行检测的方法是本领域内熟知的；例如利用检测酯化氨基酸(正丁基酯)的气-液层析方法可以确定血样品中甲硫氨酸浓度，该方法描述于Roach等人，J.Chromotog.44269-278(1969)。本领域内普通技术人员将会知道或者容易鉴别检测血浆甲硫氨酸的其他等同的方案。
应该注意到MET酶不会降解细胞内甲硫氨酸。因此，在充足地供应MTA用于形成胞内甲硫氨酸时，通常MTA酶阳性细胞能够在MET酶降低外源甲硫氨酸情况下生存下来。但是，在没有外源甲硫氨酸(或者是也可由MET酶降解甲硫氨酸的底物高半胱氨酸)供应情况下，通常由于MTA酶阴性细胞对甲硫氨酸有绝对需求。因而在失去血浆甲硫氨酸时不能存活。
根据显示恶性状态的细胞体积降低的临床证据(采用本领域内公知的方法测定)和/或利用本文描述的检测手段对恶性肿瘤的MTA酶阴性细胞体积进行定期检测可证实和监测治疗效果。基于利用L-天冬酰胺酶治疗人的有关临床资料，可认预期，MET酶治疗的毒性相当低，并且这些毒性主要是由过敏反应组成，可采用临床领域内熟练技术人员熟知的方法进行治疗，例如施用肾上腺素。
因此，基本上是将MTA和MET酶同时给哺乳动物施用。优选地，将MTA和MET酶同时施用。因为MTA并不作为MET酶的底物，因而将两物质与药物学上可接受的载体一起结合。换另一种方法，在以MET酶给药后24小时内(优选的是给药后立即)以MTA给药，以便“挽救”其内源性甲硫氨酸正在逐渐消耗的MTA酶阳性细胞。
挽救正常细胞所需的MTA的用药量将依据许多临床因素而变化，所述监床因素包括恶性肿瘤的位置，在恶性肿瘤中MTA酶阴性细胞的体积，MET酶治疗的时间长度以及患者在食物中获得的MET量。但是，通常MTA的给药剂量为足于保持血浆甲硫氨酸水平为约1-10μM所需的量。
已对本发明作了全面描述，下文中提出了描述本发明实施方式的最佳实施例。但是，不应将这些实施例认为是限制本发明范围。本发明范围由后附的权利要求进行限定。
在实施例中，缩写“min”是指分钟，“hrs”和“h”是指小时，量度单位(例如“ml”)与标准缩写的定义相同。
实施例I免疫检测法检测MTA酶A.MTA酶抗体的制备按照Rangione等人(见上文)描述的方法从牛肝中纯化MTA酶。利用常规技术对从分离到的酶的几个胰蛋白酶裂解的肽进行测序。以所获得的序列为基础，采用改良的公知的Merrfield固相方法(参见，例如，Chen，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，811784-1788，1984)合成肽40(18个氨基酸长；参见SEQ ID NO2)和肽51(14个氨基酸长；参见SEQ ID NO3)。所有肽含有位于羧基末端的半胱氨酸残基，以有利于用间-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯将该肽化学偶合到载体蛋白KLH上。
用肽-KLH结合物每隔二个月给新西兰白鼠(每种肽接种两只鼠)免疫接种。起始注射液含有在费氏完全佐剂中乳化的1mg的合成肽-KLH结合物。加强注射剂量是1mg的溶于佛氏不完全佐剂中的抗原。在注射3-4次之后，用50％饱和硫酸铵部分纯化血清，并采用ELISA方法筛选抗-肽和抗-MTA酶反应性。
更具体地说，用溶于BBS(0.2M硼酸钠-0.15M NaCl，pH 8.5)中的10μg/ml的肽或MTA酶在4℃将微滴平板预包埋过夜。将该平板在含有0.05％吐温20的BBS中洗涤一次，然后用含有1％牛血清白蛋白的BBS一起保温4小时以封闭非特异性结合位点。然后用对照血清或肽诱导的抗血清的几个稀释液的0.1ml试样加样，并保温过夜。用含0.05％吐温20的BBS将该平板洗两次，然后与碱性磷酸酶标记的山羊F(ab′)2抗兔免疫球蛋白(JacksonLaboratories，Inc.，West Grove，PA)(在BBS中经过1∶1000的稀释)接触1小时。将平板洗涤之后，向每个孔中加入0.2ml溶于0.1M NaHCO3，pH 9.0中的0.1M对-硝基苯磷酸二钠。在30分钟之后检测在405nm处的吸收率。
B.利用免疫印迹分析法对MTA酶的免疫反应性进行分析的方案估测几个人细胞系和肿瘤活检样品中MTA酶阴性细胞的存在(参见，表I中MTA酶阴性细胞，用“免疫检测”标注的条目)。检测为MTA酶阳性的其他样品是BV-173(一种慢性骨髓性白血病，“CML”)，Molt-16(一种急性淋巴细胞性白血病，“ALL”)，Molt-4(ALL)，U 397(组织细胞淋巴瘤)，SUP-T8(ALL)，U-373MG(成胶质细胞瘤)，以及T98G(成胶质细胞瘤)。
将从酶阳性细胞制备的细胞提取物与上面描述的方法从牛肝纯化的各种量的MTA酶一起在含有0.1％十二烷基硫酸钠的12.5％聚丙烯酰胺凝胶上电泳。
更具体地说，通过在含有0.1％十二烷基硫酸钠的12.5％聚丙烯酰胺凝胶上电泳可分离细胞粗提取物(10-150μg/泳道)。在电转移到硝酸纤维素膜(0.45mm；Bio-Rad，Richmond，CA)上之后，用溶于BBS中的3％奶粉将非特异性的结合位点封闭。然后在室温下用含有3％奶粉的BBS 1∶500稀释的抗血清对该蛋白质探查16小时。在用BBS对该蛋白质进行充分洗涤之后，作125I-蛋白质A(ICN Radiochemicals，Irvine，CA)结合1小时对反应的谱带进行检测。将该膜洗涤并吸印至纸巾上，在-70℃置于柯达XAR-5(tm)胶片上曝光。
用一个密度计(Bio-Rad)对放射自显影的谱带进行扫描，利用根据纯化酶的免疫反应谱带得到的校正曲线进行定量检测。
C.结果在非肺细胞系和活检样品(即在神经胶质瘤)中，67％(六中有四个)完全缺失免疫反应酶(图2)。来自人神经胶质瘤具有不同组织学特性的6个连续的活检样本(表I)，5个完全缺失该酶(图3)。对照试验显示，正常的人脑富含MTA酶活性(图3，泳溢7)。因此在人神经胶质瘤中完全缺失MTA酶是一种普遍的和特异的代谢异常。
在所检测的19个非小细胞肺癌细胞系中，6个细胞系中完全失出MTA酶(参见，表I和图4)。
实施例II从恶臭假单胞菌克隆MET酶参照由Wakayama等人，Biochem.，271587-1591，1988公开的MET酶的部分氨酸序列，设计简并寡核苷酸引物并用于MTA酶基因的PCR分析中。
该PCR方法扩增了一个约300bp的片段。将该300bp的PCR产物亚克隆到质粒pBluescript II KS(Stratagene，San Diego)。利用该PCR产物的内部寡核苷酸探针，该亚克隆的PCR产物的Southern印迹分析证实了该片段为MET酶基因。进一步的Southern印迹分析证明了该PCR产生的该片段与恶臭假单胞菌DNA的一个5.0kb BglII片段进行杂交。
基于这些结果，构建含有恶臭假单胞菌基因组DNA的噬菌体基因组DNA文库。在0.8％低熔点琼脂糖凝胶上面将BglII消化的恶臭假单胞菌电泳。从凝胶上切下大小为4/kb到6/kb的BglII片段并进行纯化。利用Klenow片段，将这些BglII片段部分填平并亚克隆到噬菌体载体γ FixII中。用XhoI消化该载体并用Klenow部分填平。利用Stratagene的gigapack包装提取物，将该文库包装为噬菌体颗粒。包装之后将该文库扩增并测其效价。
为了分离整个MET酶基因，用该PCR扩增的片段筛查该文库。在筛查200000克隆之后分离到8个独立的原始文库。在这8个克隆中仅有2个克隆是真正的阳性并且是唯一的。一个克隆含有5.1kb的插入片段，另一个含有5.9kb的插入片段。将这些插入片段亚克隆到pBluescriptII KS，随后绘制其结构图并测序。我们确证MET酶基因的序列是1615bp(参见，SEQ IDNO.4)。
实施例III重组MET酶的表达在C5载体中表达重组MET酶基因。该载体与用于表达MTA酶的载体相同(参见，例如，实施例VII，在审美国申请NO.08-176，855，申请日1993年12月29日)。将C5重组克隆的大肠杆菌的单菌落用于接种50ml的培养物。两者都使用补充50μg/ml氨苄青霉素的标准LB培养基并且用于大规模细菌培养。在37℃将接种过的50ml培养液培养过夜。用新鲜的LB培养基将培养过夜的培养物稀释100倍。在37℃剧烈震荡条件下将细胞在大规模培养中培养1.5小时(11)。为了诱导MET酶表达，向该大规模培养物中加入终浓度为0.01，0.1和1mM的异丙基硫-β-D-半乳糖苷[IPTG]，将该培养物再培养4小时。发现该蛋白质表达的最适IPTG浓度是1mM浓度。
在IPTG加入4小时后，通过在4℃及19000Xg离心10分钟收集细胞。除去上清液，用冷的盐水悬浮沉淀并洗涤，然后再离心。有100-200ml含有15μM 2-疏基乙醇的20mM浓度磷酸钾缓冲液，pH7.5洗涤该重新悬浮的细胞沉淀。加入1mM EDTA和30μM吡哆醛5′-磷酸盐(缓冲液A)。然后将沉淀再一次离心。将该洗涤过的重悬的(于缓冲液中)细胞悬液置于细胞破碎容器中。利用2200PSI氮气压将细胞破碎20分钟。在4℃以13000Xg将该裂解的细胞离心20分钟。从该细胞提取物得到的上清液进一步用染料-配体亲和柱进行纯化。
将细胞提取物(10ml)置于“DYEMATRIX”gel[Orange A](Amicon Inc.，Beverly，MA)柱(12×2.6cm)。按照制造商的说明装填该柱并进行平衡。在将样品加到柱上之后，用5倍柱体积的缓冲液A洗脱该柱以除去未结合的物质。完成该步骤之后，用溶于缓冲液A中的0-1.5M氯化钾线性梯度溶液洗脱结合的产物。收集10ml馏分并进行Y-裂解酶检测。集合含有甲硫氨酸y-裂解酶活性的主峰的馏分，并且用“CENTRICON 30”(Amicon Inc.)浓缩到2-3ml。
将固体(NH4)2SO4加到浓缩的馏分(0.314克/ml)中，使终浓度为2.4M，并且将该样品以13000Xg离心10分钟。用0.45μacrodis滤纸(Amicon，Inc.)过滤上清液，然后注射到Alkyl“SUPEROSE”(琼脂糖)hr 5/5疏水作用-FPLC柱(pharmacia)，该柱已用溶于前面步骤中使用的缓冲液A中的2.4M(NH4)2SO4进行平衡。用线性降低的(NH4)2SO4浓度(流速为0.5ml/分钟)洗脱结合的蛋白质。收集含有MET酶活性的馏分，并按上文描述进行浓缩。按Bradford描述的方法检测蛋白质的浓度。
由SDS 10％甘氨酸-tris 1mm凝胶(Novex，San Diego，CA)检测该酶制剂的纯度。按照Esaki & Skoda描述的方法(Meth.Enzymol.143459465(1987)，引入本文作参考)，通过检测2-丁酮酸的产生而分析MET酶的活性。最终的酶具有300U/mg的比活，其中1U＝每分钟产生1μM产物。
实施例IV在非小肺癌细胞系中使MTA酶阴性细胞选择性地饥饿根据本发明的治疗方法在体外细胞培养物中用MET酶和MTA处理实施例I中鉴定的MTA酶阴性非小肺癌细胞系。具体地说，在(a)补充了10％透析过的马血清并含有甲硫氨酸的培养基中，(b)补充了10％透析过的马血清但不含甲硫氨酸的培养基中，以及(c)补充了10％透析过的马血清和16μMMeSAdo(5’-甲硫腺苷)的无甲硫氨酸培养基中将酶阳性(SK-MES-1)和阴性(A-549)细胞系培养4天。在缺乏甲硫氨酸的培养基中两种细胞系，尤其是酶阴性A-549细胞的增殖明显地迟缓(对于SK-MES-1和A-549细胞其生长分别为对照生长的27和3.3％)。当在同一个培养基中加入MTA时，提高了酶阳性SK-MES-1细胞的生长(对照的77％)。但是，在MTA存在下酶阴性A-549细胞的增殖没有增强(为对照生长的4.3％)(表II)。
这些数据表明，在缺失甲硫氨酸，补充了MeSAdo培养基中选择性地抑制MeSAdo磷酸化酶阴性细胞的生长。
表II生长(占对照的％)b无甲硫氨酸细胞系 酶的状态a无MeSAdo 有MeSAdoSK-MES-1 + 27±2.677±4.7A-549 - 3.3±0.6 4.3±1.1a+，存在；-，不存在b相对对照生长的百分数＝100×(在有或没有MTA的缺乏甲硫氨酸培养基中细胞生长情况)/(在含有甲硫氨酸培养基中细胞的生长)。
实施例V具有重组MET酶的人恶性细胞的甲硫氨酸饥饿为了研究实施例II和III中描述的方法产生的重组MET酶的抗增殖效果，在补充了0.06U/ml重组MET酶并含有10％透析过的胎牛血清的DMEM培养基中培养人SK-MES-1和A-549细胞。三天之后，测定细胞增殖。MET酶的作用是用相对于缺乏加入的酶的培养基中细胞生长的百分数表示的。
如图4所示，在补充了MET酶的培养基中酶阳性(SK-MES-1)和酶阴性(A-549)细胞的生长分别增加了26.6和2.96％。但是，如果加入20μMTA以作为细胞甲硫氨酸的另一种来源，在酶阳性细胞中细胞生长恢复到对照值的61.4％，而酶阴性细胞的生长降至2.0％。
序列概述SEQ ID NO1是全长MTA酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO2是抗原性MTA酶肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO3是抗原性MTA酶肽的氨基酸序列，该序列不同于SEQ IDNO.2的肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO.4是编码MET酶的多核苷酸的核苷酸序列。
SEQ ID NO.5是从SEQ ID NO.4的核苷酸序列推导的MET酶的氨基酸序列。
序列表(1)一般资料(i)申请人THE REGENTS OF THE UNIVERSITYOF CALIFORNIA(ii)发明名称使哺乳动物的恶性细胞处于甲硫氨酸饥饿的方法(iii)序列数 5(iv)通信地址(A)收件人Robbins，Berliner & Carson(B)街道201N.Figueroa Street，5th Floor(C)城市Los Angeles(D)州California(E)国家USA(F)邮编90012(v)计算机可读形式(A)媒体类型软盘(B)计算机IBM PC兼容(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件Patentln Release #1.0，Version #1.25(vi)目前申请资料(A)申请号US(B)申请日(C)分类号(viii)代理人/律师资料(A)姓名Berliner，Robert(B)登记号20,121(C)案号5555-286(ix)电信资料(A)电话213-977-1001(B)传真213-977-1003(2)SEQ ID NO1的资料(i)序列特征(A)长度2763个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(vii)直接来源(B)克隆甲基腺苷磷酸酶(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1..2763(xi)序列描述SEQ ID NO1TTTATACAGA GCATGACAGT GGGGTCCTCA CTAGGGTCTG TCTGCCACTC TACATATTTG 60AAACAGGAGT GGCTTCTCAG AATCCAGTGA ACCTAAATTT TAGTTTTAGT TGCTCACTGG 120ACTGGGTTCT AGGAGACCCC CTGTGTTAGT CTGTGGTCAT TGCTAGSAGA ATCACTTAAT 180TTTTTCTAGA CTCTAGGAGA AAACAGTTGG TGGTGTACTC ATCACGGGTT AACAATTTCT 240TCTCTCCTTC CATAGGCATG GAAGGCAGCA CACCATCATG CCTTCAAAGG TCAACTACCA 300GGCGAACATC TGGGCTTTGA AGGAAGAGGG CTGTACACAT GTCATAGTGA CCACAGCTTG 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IDNO3的资料(i)序列特征(A)长度13个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(vii)直接来源(B)克隆5′-甲硫腺苷磷酸酶肽(ix)特征(A)名称/关键词肽(B)位置1..3(xi)序列描述SEQ ID NO3Leu Leu Leu Thr Thr Ile Pro Gln Ile Gly Ser Met Glu15 10(2)SEQ ID NO4的资料(i)序列特征(A)长度1615个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(vii)直接来源(B)克隆甲硫氨酸-γ-裂解酶(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置304..1497(xi) SEQUENCE DESCRIPTIONSEQ ID NO4ATAGGATGGC CTGGTAGCCA GTGATATAGC CGTTGTCTTC CAGCAGCTTG ACCCGGCGCC 60AGCAGGGGCG AGGTGGTCAA TGCCACCTGG TCGGCAAGTT CGGCGACGGT TAGGCGGGCG 120TTGTCCTGCA AGGCGGCGAG CAGGGCGCGG TCGGTGCGGT CGAGGCTTGA AGGCATGTTT 180TGCCCTCCTG GTCCGTTAAT TATTGTTTTT GTTCCAGCAA GCACGCAGAT GCGTGGGCAA 240TTTTGGAAAA AATCGGGCAG CTCGGTGGCA TAAGCTTATA ACAAACCACA AGAGGCTGTT 300GCC ATG CGC GAC TCC CAT AAC AAC ACC GGT TTT TCC ACA CGG GCC ATT 348Met Arg Asp Ser His Asn Asn Thr Gly Phe Ser Thr Arg Ala Ile15 10 15CAC CAC GGC TAC GAC CCG CTT TCC CAC GGT GGT GCC TTG GTG CCA CCG 396His His Gly Tyr Asp Pro Leu Ser His Gly Gly Ala Leu Val Pro Pro20 25 30GTG TAC CAG ACC GCG ACC TAT GCC TTC 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1.一种使被怀疑是MTA酶阴性的哺乳动物的细胞选择性地甲硫氨酸饥饿的方法，该方法包括利用检测细胞样品中存在或不存在具催化活性和不具催化活性的MTA酶的手段而确定该细胞是否基本上MTA酶阴性，给哺乳动物施用治疗有效量的MET酶，并且基本上与此同时，将治疗有效量的MTA施用给该哺乳动物，其中MET酶和MTA都是以存在于治疗学上可接受的载体中的形式施用。
2.根据权利要求1所述方法，其中该MET酶是一种重组微生物蛋白，它在体内可特异性地降解哺乳动物甲硫氨酸。
3.根据权利要求2所述方法，其中该MET酶具有其本上与SEQ ID NO.5所示的相同的氨基酸序列。
4.根据权利要求2的方法，其中该MET酶由具有基本上与SEQ ID NO.4所示的相同的核苷酸序列的多核苷酸表达。
5.根据权利要求1的方法，其中该MET酶偶合到聚乙二醇上。
6.根据权利要求1所述方法，其中将该MET酶和MTA同时施用给哺乳动物。
7.根据权利要求6所述方法，其中将MET酶和MTA一起混合在相同的药物学上可接受载体中。
8.根据权利要求1的方法，其中用于检测存在或不存在具催化活性和不具催化活性的MTA酶的方法包括免疫检测法。
9.根据权利要求1所述方法，其中用于检测具催化活性的和不具催化活性的MTA酶是否存在的方法包括一种包括下列步骤的检测法(a)获得被怀疑是MTA酶阴性的细胞的可检测样本(b)向该样品中加入与编码MTA酶的核酸特异性杂交的寡核苷酸探针，该加入过程是在允许该探针与样品中存在的这样的核酸进行可检测杂交的条件下进行的，以及(c)检测该样品中是否存在该核酸。
10.根据权利要求9所述方法，其中进一步将该样品置于有助于样品中存在的编码MTA酶的核酸选择性地扩增的条件下。
11.根据权利要求1所述方法，进一步包括在以MET酶给哺乳动物给药之前和之后，测定哺乳动物的血浆甲硫氨酸水平的步骤。
12.根据权利要求11所述方法，其中MET酶的治疗有效量为10单位/m2和20,000单位/m2之间并且至少施用一次，其总量应足以降低哺乳动物中检测到的MTA酶阴性细胞的数量。
13.根据权利要求12所述方法，其中MET酶的治疗有效量是将哺乳动物血浆甲硫氨酸水平降低至约≤MET酶给药前的水平的10％所需的MET酶的量。
14.根据权利要求1所述方法，其中MTA的治疗有效量是足以将哺乳动物的血浆MTA浓度保持在约1-10μM所需的量。
15.具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的DNA分子。
16.一种具催化活性的重组MET酶多肽。
17.根据权利要求16所述的多肽，其中该多肽具有基本上与SEQ IDNO.5所示序列相同的氨基酸序列。
18.一种多核苷酸，包编码具催化活性的MET酶多肽。
19.一种具催化活性的MET酶多肽，它是由权利要求18的多核苷酸表达的。
20.根据权利要求19所述的具催化活性的MET酶多肽，其中该多核苷酸的表达是在原核细胞中进行的。
21.根据权利要求18所述多核苷酸，它具有基本上与SEQ ID NO.4所示序列相同的核苷酸序列。
22.由权利要求21所述多核苷酸表达的具催化活性的MET酶多肽。
23.根据权利要求22所述的具催化活性的MET酶，其中该多核苷酸的表达是在原核细胞中进行的。
全文摘要
一种对哺乳动物恶性细胞进行化疗的改进方法，所述恶性细胞对甲硫氨酸有绝对需求但失去了5′-甲硫腺苷磷酸化酸(MTA酶)。该方法包括检测哺乳动物中的MTA酶阴性细胞，以足以降低哺乳动物中MTA酶阴性细胞的体积的量施用甲硫氨酸γ-裂解酸，并且同时施用足以使哺乳动物非恶性细胞继续获得甲硫氨酸的量的5′-甲硫腺苷。也提供了检测MTA酶阴性细胞的方法。还提供了生产和使用重组化疗药剂的方法。
文档编号C12N9/88GK1143325SQ94195042
公开日1997年2月19日 申请日期1994年12月22日 优先权日1993年12月29日
发明者楚特穆·诺伯里, 丹尼斯·A·卡森 申请人:加利福尼亚大学董事会