对肺炎克雷伯氏菌肺炎或臭鼻亚种特异的its序列及应用的制作方法

专利名称：：对肺炎克雷伯氏菌肺炎或臭鼻亚种特异的its序列及应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及克雷伯氏菌(K/eZwW/")中7个种和亚种的16srRNA-23srRNA之间的核苷酸全序列(16S-23SrRNAinternaltranscribedspacer,以下简称ITS),尤其涉及对肺炎克雷伯氏菌肺炎或臭鼻亚种特异的ITS核苷酸序列及应用。
背景技术：
：克雷伯氏菌属是条件致病菌，经常可从人类和动物的多种感染中分离得到。作为条件致病菌，克雷伯氏菌能够引起严重的败血症、肺炎、尿路感染和软组织感染(BagIey，1985;Grimont,1992;PodschunandUlhnann,1998;GordonandFitzGibbon,1999)。在美国和欧洲，由克雷伯氏菌引起的感染占医院感染的8%，成为医院感染中最重要的8个致病菌之一(Homn，1988;Schaberg,1991.)。同时，克雷伯氏菌属的耐药性问题日益严重，特别是产超光谱p-内酰胺酶(ESBLs)克雷伯菌属的出现，增加了临床治疗难度。因此研究克雷伯氏菌属具有重要的临床意义。医院中最常分离到的克雷伯氏菌是肺炎克雷伯氏菌(包括三亚种肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种)和产酸克雷伯氏菌，偶尔报道有土生克雷伯氏菌、植生克雷伯氏菌和解鸟氨酸克雷伯氏菌(DanielJonas，2004)。目前在医院中，常用基于生化反应的自动微生物鉴定仪器如VITEK检测和鉴定克雷伯氏菌属进行，整个过程需要大约24-48个小时(KumpatiP,2004)。此外在临床上检测和鉴定克雷伯氏菌十分困难，经常出现误检，因为克雷伯氏菌属的各个种之间经常有共同的生化反应。例如在临床上，植生克雷伯氏菌、土生克雷伯氏菌和解鸟氨酸克雷伯氏菌常被错检为肺炎克雷伯氏菌，植生克雷伯氏菌有时也被被错检为产酸克雷伯氏菌(MonnetD，1991;MoriM，1989)。甚至，在临床上，大多数克雷伯氏菌属都被鉴定为肺炎克雷伯氏菌和产酸克雷伯氏菌(HansenDS,1998;BrisseS，2001;LiuY,1997)，因此准确、快速的检测和鉴定克雷伯氏菌属具有重要的临床意义和应用价值。位于16SrRNA和23SrRNA之间的核苷酸序列(16S-23SrRNAinternaltranscribedspacer,ITS。以下均简称为ITS)用来作为致病菌检测的靶标分子具有明显的优势(TBany，1991;Rossau，1992;Gurtler，1996)。最明显的优势是ITS在进化过程中比16SrRNA和23SrRNA受到更多的选择压力，其进化速率速率相当于16SrRNA或者23SrRNA的十倍，有更多的集中超变区域(Leblond-bourgetN,1996)，同时两端是保守的16SrRNA和23SrRNA区域，既可在两端的保守区域设计细菌的通用引物，又可在ITS的超变区域设计特异探针。ITS的优势之二是其比较短(约200-1000bp)，在基因组上有一个或多个拷贝。如果多个拷贝，那么不同拷贝之间有的是相同的(如脸^m'"菌属)，也有的是不同的(如￡.这些不同有可能是几个核苷酸的变化，也有可能是大段序列的插入或缺失。正因为ITS具有以上两个明显的优势，因此越来越被广泛应用于细菌种或亚种的鉴定(TungSK,2007;XiongL，2006;VolokhovDV,2006)、分型(MaggiRG，2006;RegassaLB，2004)和进化分析(YukphanP，2006;SongJ,2004;XuD,2003)，尤其是用于亲缘关系较近的菌种的鉴定。
发明内容本发明的一个目的是提供一种对肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种特异的ITS核苷酸序列，其包括以下序列-a)SEQIDNO:1或SEQIDNO:2所示的核苷酸序列或其互补的DNA或RNA序列；b)不同于a)但编码的RNA序列与a)所编码的RNA序列相同的核苷酸序列或其互补的DNA或RNA序列；c)上述a)或b)中缺失、替换或插入一个或多个碱基、仍具有所述核苷酸功能的核苷酸序列或其互补的DNA或RNA序列。上述的对肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种特异的ITS核苷酸序列中，本发明的优选实施例中，对肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种高度特异的核苷酸序列为SEQIDNO:3或SEQIDNO:4所示的核苷酸序列或其互补的DNA序列。本发明的优选实施例中，SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的全长分别为427和429个碱基。其中SEQIDNO:3所示的核苷酸序列选自SEQIDNO:1的第152-170碱基的核苷酸序列或其互补的DNA序列。其中SEQIDNO:4所示的核苷酸序列选自SEQIDNO:2的第400-420碱基的核苷酸序列或其互补的DNA序列。本发明的另外一个目的是提供上述的对肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种特异的ITS核苷酸序列的应用，其可用于检测肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种。具体地，上述的对肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种特异的ITS核苷酸序列作为PCR引物或杂交反应的探针或基因芯片或微阵列用于检测肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种。本发明还提供一种扩增对克雷伯氏菌属特异的ITS核苷酸序列的引物，其为SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的核苷酸序列或其互补的DNA序列。本发明还提供一种获得对克雷伯氏菌特异的ITS核苷酸序列的方法，其包括下述步骤(1)提取基因组；(2)通过PCR扩增克雷伯氏菌的ITS基因簇；(3)构建ITS克隆；(4)对ITS克隆测序；(5)拼接及分析核苷酸序列；(6)筛选特异核苷酸序列；其中步骤(2)中使用的扩增引物是SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的核苷酸序列或其互补的DNA序列。本发明还提供一种PCR试剂盒，包括PCR引物、dNTP、缓冲液和DNA聚合酶，其中的PCR弓I物包括SEQIDNO:3或SEQIDNO:4所示的核苷酸序列或其互补的DNA序列。本发明的优选实施例中，所述PCR引物为SEQIDNO:3和SEQIDN0.4所示的核苷酸序列。上述的试剂盒可用于检测肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种。本发明配制的一种可检测肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种的可产业化生产的PCR试剂盒，将PCR检测方法需要使用的组分组合在一起，使用时，提取待检样品基因组，同时经过较为简单的操作程序就可以进行快速、灵敏、简便的检测、试剂盒中各组分的用量和浓度均为试验所得，用该试剂盒检测肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种所使用的试验设备简单，检测成本低。本发明还提供一种应用上述的试剂盒检测肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种的PCR检测方法，包括以下步骤(1)提取待检临床样品(血培养物、尿培养物、痰培养物等)中细菌的DNA作为模板；(2)在PCR薄壁管中加入dNTP、MgCl2、lOx酶特异性反应缓冲液、Taq聚合酶、引物、从待检样品中提取的模版DNA和ddH20，混匀；(3)将PCR薄壁管中混匀的混合物在PCR仪上扩增；(4)在电泳设备中电泳扩增产物，记录结果；(5)分析并进行结果判断。本发明针对不同的待检临床样品提供的一种通用的细菌基因组提取方法，具体如下(1)临床样品培养物1.0ml8000rpm离心5分钟，去上清。(2)500ulddH2O重悬沉淀，8000rpm离心5分钟，去上清，尽量控干。(3)100ulddH2O重悬沉淀，IO(TC沸水浴IO分钟。(4)置冰上10分钟后，12000rpm离心2分钟。(5)取3ul中层上清作为PCR反应的模板。阳性对照品为已确定是肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种的样品，阴性对照品则为经实验室确定不是肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种的样品，如大肠杆菌。待检样品模板可以是临床样品中的血培养物、痰培养物、尿培养物、脑脊液培养物等的粗提液，也可以是肺炎克雷伯氏菌(肺炎亚种或臭鼻亚种)的纯培养物的粗提液，或是纯DNA,或者是阳性对照品或阴性对照卯o本PCR试剂盒若用肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种的菌悬液煮沸粗提DNA进行PCR扩增，与酚氯仿或试剂盒提取得到的DNA作为模板扩增所得结果一致。敏感度和特异性无差别，这样，可省去模板DNA的提取步骤，使操作方法得以简化。同时，相比常规生化检测方法而言，本方法所采用的待检样品可以直接是临床样品培养液，或者对待检样品进行简单分离培养就可进行检测，因而节省了人力物力。其中检测使用剂量为PCR引物各0.5ul，10mMdNTP0.25ul，10x酶特异性反应缓冲液2.5ul，5U/ul耐热DNA聚合酶0.2ul，25mMMgCl22.5ul，3ul待检样品模板DNA，用ddH20补足总体积至25ul。其中上述的耐热DNA聚合酶可以为Taq聚合酶。上述的PCR扩增参数为95°C5分钟1个循环；94°C30秒，55°C30秒，72。C30秒，30个循环；72。C2分钟1个循环。本发明提供了一种对肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种特异的ITS核苷酸序列并利用上述序列设计引物，通过优化和设计，提供一种用于肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种检测的灵敏度高、速度快、简便、准确、检测周期短的PCR试剂盒及利用该试剂盒检测肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种的存在。该试剂盒可克服现有技术中操作烦琐、检测周期长、假阳性高等的不足，可广泛应用于食品和临床样品的监督和检测、食物中病原菌检测、细菌学分类及流行病学调査等领域，具有较高的使用价值。为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。图l是本发明的克雷伯氏菌属各种ITS核苷酸序列扩增后的电泳图，其中M是DL2000DNAmarker;图2是本发明的PCR试剂盒阳性对照品，阴性对照品和检测的肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种代表株的电泳图3A-3B是本发明的PCR试剂盒检测代表菌株的电泳图4是本发明的PCR试剂盒检测临床菌株的电泳图5是肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种含有tRNA-Ile和tRNA-Ala基因的ITS核苷酸序列截图，框区为引物位置；图6是肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种含有tRNA-Ile和tRNA-Ala基因的ITS核苷酸序列截图，框区为引物位置。具体实施方式实施例一引物的设计本发明对肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种以及其他克雷伯氏菌的ITS进行了核苷酸测序，通过比对，确定含tRNA-Ile和tRNA-Ala基因的ITS核苷酸为耙序列，如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的核苷酸，全长427和429个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQIDNO:l和SEQIDNO:2的核苷酸。弓I物对SEQIDNO:3(5，-GCGAAGCAAATTTGAAGAG-3，)和SEQIDNO:4(5，-CCGAAGATGTTTCACTTCTGA-3，)是根据肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种的最长ITS核苷酸类型(含有tRAN-Ile和tRNA-Ala的ITS)设计合成的寡核苷酸引物，分别位于基因序列上的152-170和400-420位置(详见图5和图6中的框区位置)。该引物可在试管中由DNA聚合酶选择性的复制合成介于两引物之间的DNA区段(针对肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种和肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种为269bp靶DNA片段)，因而可以将及其微量的(10pgDNA)目的基因在较短的时间内(1.5小时)扩增到电泳检测显而易见的水平。实施例二ITS核苷酸序列的获得及筛选(1)基因组的提取将搜集到的肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种菌株用LB培养基过夜培养，收集菌液，按照常规提取普通革兰氏阴性菌基因组的方法提取肺炎克雷伯氏菌肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种培养物的基因组DNA;(2)通过PCR扩增肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种中的ITS基因簇以肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种的基因组为模板通过PCR扩增其ITS;根据ITS两端保守的16SrRNA基因和23Sr脂A基因分别设计上游引物SEQIDNO:5(5'-TGTACACACCGCCCGTC-3，)和下游引物SEQIDNO:6(5，-GGTACTTAGATGTTTCAGTTC-3，)。PCR反应程序如下94。C预变性5分钟，94。C变性30秒，5(TC退火30秒，72t:延伸1分钟，进行30个循环；最后72t:继续延伸5分钟，得到PCR产物，用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性；PCR产物切胶回收，并用上海生工生物工程技术公司的UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收纯化PCR产物；(3)构建ITS克隆将PCR纯化产物与Promega公司的3x10—3的pGEM-T-Easy载体于4-C连接24小时，总体积为lOjil，其中有1^1的10x缓冲液和0.5U的T4DNA连接酶，得到连接产物。用Bio-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5a细胞，取2-3)al连接产物与60pl感受态大肠杆菌DH5a混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5kv，时间为5.0毫秒-6.0毫秒，电击后立即在杯中加入lml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37t:过夜培养，次日得到蓝白菌落，将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用E"iI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群即肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种的ITS克隆；(4)对ITS克隆测序挑选500bp-lkbp的插入片段，每种长度的片段挑选3个克隆用ABI3770型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段进行双向测序，测序引物为通用的引物SP6和T7，从而获得ITS的序列；克雷伯氏菌属各种和亚种的ITS核苷酸序列扩增后的电泳图如图1所示，其中1是肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种，2是肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种，3是肺炎克雷伯氏菌鼻硬结亚种，4是土生克雷伯氏菌，5是植生克雷伯氏菌，6是产酸克雷伯氏菌，7是解鸟氨酸克雷伯氏菌，M是DL2000DNAMarker,N为PCR反应的阴性对照。(5)核苷酸序列的拼接及分析用英国剑桥MRC(MedicalResearchCouncil)分子生物学实验室出版的Stadenpackage软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种的ITS的核苷酸全长序列，序列的质量主要由两个方面来保证1)对肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种的基因组作3个PCR反应，然后混合这些产物以建克隆。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率；在得到肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种的ITS的核苷酸序列后，用美国霍华德.休斯医学中心的tRNAscan-SEsearchserver(http://lowelab.ucsc.edu/tRNAscan曙SE/)确定tRNA基因的位置和类型，用ClustralW软件做DNA序列间的精确比对，最后确定含有tRNA-Ile和tRNA-Ala基因的ITS包含对肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种的特异核苷酸区；(6)特异核苷酸序列的筛选针对肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种的ITS的特异区设计引物；在特异区设计一条上游引物(SEQIDNO:3)和下游引物(SEQIDNO:4)，用这对引物以9株的肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种、3株肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种、2株肺炎克雷伯氏菌鼻硬结亚种、l株土生克雷伯氏菌、l株植生克雷伯氏菌、4株产酸克雷伯氏菌和2株解鸟氨酸克雷伯氏菌以及其他如产气肠杆菌、大肠杆菌等13株近缘菌株的基因组为模板进行PCR，所有引物都在肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种和臭鼻亚种中得到阳性结果，在其他组中都没有扩增出大小正确的带，也就是说，在其他组中没有得到任何PCR产物带，所以该寡核苷酸对肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种及其ITS都是高度特异的。实施例三试剂盒的制备本发明是针对肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种的PCR检测试剂盒，整个检测步骤包括样品预处理——扩增——电泳检测结果。引物和PCR反应体系所需要的试剂已预先加入扩增管中，使用者只需将预处理后的样本加入扩增管启动扩增反应即可，简单扩速的完成检测工作。1.试剂盒组成(1)MgCl2(25mM)50ul;(2)dNTP(10mM)30ul;(3)10xbuffer(10x酶特异性反应缓冲液)50ul;(4)Taq聚合酶(5U/uO5ul;(5)引物混合物(10uM)(引物间比例l:1)10ul;(6)阳性对照品(肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种的基因组DNA)10ul;(7)阴性对照品(ddH20)10ul;(8)ddH205ml。13每个试剂盒可用于检测IO个样品，每次反应所用各组分的用量如下:(1)MgCl2(25mM)2.5ul;(2)dNTP(10mM)0.25ul;(3)10xbuffer(10x酶特异性反应缓冲液)2.5ul;(4)Taq聚合酶(5U/ul)0.25ul;(5)引物混合物(10uM)lul;(6)待检样品模板DNA3ul;(7)ddH2015.5ul。其中MgCl2、10xbuffer、dNTP、Taq聚合酶由上海生工提供；引物混合物为自行设计的序列提供给上海英骏生物技术公司合成；阳性对照品、阴性对照品和ddH20由我们自行制备。检测所使用的引物的上游引物是SEQIDNO:3(5，-GCGAAGCAAATTTGAAGAG-3，)下游引物是SEQIDNO:4(5，-CCGAAGATGTTTCACTTCTGA-3，)。2.仪器设备PCR仪(又名DNA热循环扩增仪)、电泳设备(包括电泳仪及电泳槽)、凝胶成像仪、-2(TC冰箱、高速离心机、微量移液器和0.2mlPCR薄壁管。实施例四待检样品的提供申请人从国内外各菌种保藏机构收集了11株肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种和肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种的代表菌株、10株克雷伯属其他菌株以及13株近缘菌株的代表菌株验证引物的特异性，菌株编号和来源见下表1。表l:用于验证引物特异性的菌株细菌名称实验室编号原始编号来源总计14G1743ACCC10084中国医学微8株G1744G1745G2119G2551CMCC46112CMCC46109CMCC46102CMCC46108生物菌种保藏管理中心G2349NCTC204捷克微生物G2313NCTC5056保藏所G2311ATCC10031美国典型微生物菌种保藏中心G2543CMCC46110中国医学微3株G2545CMCC46115生物菌种保藏管理中心G2566CCM5792捷克微生物保藏所G2544CMCC46111中国医学微2株G2546CMCC46116生物菌种保藏管理中心《/err扭""G2488CCM3568捷克微生物保藏所l株《.//a油'co/"G2489CCM4428捷克微生物保藏所l株G2562CCM1900捷克微生物保藏所4株G2605ATCC柳34美国典型微G2606ATCC49473生物菌种保G2607G2680G2702ATCC700324CCM4873ATCC31898G1660M1343G1669M1361G1191M1365G1192M1371G1481M387G1329CB9777G2277AS1.181藏中心捷克微生物2株保藏所美国典型微生物菌种保藏中心澳大利亚医l株学和兽医学研究中心澳大利亚医l株学和兽医学研究中心澳大利亚医l株学和兽医学研究中心澳大利亚医l株学和兽医学研究中心澳大利亚医l株学和兽医学研究中心德国Robertl株Koch研究所中国科学院l株微生物研究所16G2284CMCC45103中国医学微生物菌种保藏管理中心l株G1495M1561澳大利亚医学和兽医学研究中心l株G2539ATCC29544美国典型微生物菌种保藏中心l株G1757AS1.1476中国科学院微生物研究所l株G2290CCUG-14635瑞典歌德堡大学培养物保藏中心l株G1318CB18德国RobertKoch研究所l株注尤w^p./wewmom'ae:肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种尤月市炎克雷伯氏菌臭鼻亚禾中Kwfep.WwVzosc/eramato:月市炎克雷伯氏菌鼻硬结亚禾中尺fem'ge加土生克雷伯氏菌^.//a油'co/a:植生克雷伯氏菌ox少toca:产酸克雷伯氏菌iT.or"她/"o/,'c":解鸟氣酸克雷伯氏菌*S.w"""':宋氏志贺氏菌弗氏志贺氏菌S.6ojW"鲍氏志贺氏菌51.痢疾志贺氏菌5""/wo"e〃"e她r/ca:肠炎沙门氏菌大肠杆菌5她ra6ac妙c/oflcae:阴沟肠杆菌￡>2tera6"c/e,产气肠杆菌mhoc/70/erae:霍舌L弧菌五"fera6"cferra&azaA7Y:阪崎肠杆菌S啤/iy/oCOCCUS金黄色葡萄球菌尸,o/缀yw/伊r&:普通变形杆菌CzYra6acter戶ew打d":弗氏校樣酸杆菌同时申请人搜集了102株2005年以来的天津7家医院从病人身上分离得到的病原菌，所有的临床菌株都经医院的细菌鉴定系统一一VITEK系统进行了生化鉴定，其生化鉴定结果和PCR鉴定结果见表2，对两者结果不一致的，申请人进行了16srRNA基因测序进一步验证，结果见下表2。表2:用于验证引物的临床菌株<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>C4981+/C7573+/C5009+/C7527尺,+/C5021—C7617+/注.A7eZw'e//a/wewmom'ae(月市炎克雷伯氏菌)；(肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种)；(肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种)；r/efo/e〃"om//zz'wo/j;"ca(解鸟氨酸克雷伯氏菌);A7e細W/"(产酸克雷伯氏菌)；五.CO〃；Esc/2m'c/2/"C。/《大肠埃希氏菌)；￡■c/o".'五她ra6(3cferc/oacae(阴沟肠杆菌)；jB.c/z.附5;^VM"(iz.mo"as<i/mi>n^a(缺P刍矢豆、波单胞菌)；.'五"feracoccws力ec/訓(屎肠球菌)；五如"五wfera6ac妙/zor顧ec/ze/(霍氏肠杆菌)A6m^,'y4"'weto6ac妙6a簡朋w'!'(鲍氏不动杆菌)P附r7Vo/ews附/>06///>$1(奇异变形丰千菌)爿/c"/z;ge"asv(产碱杆菌)^c/zromo6(3c&r:(无色t干菌)"+":代表PCR检测是阳性结果；"一"代表PCR检测是阴性结果；="/":代表生化鉴定和PCR检测结果一致，所以未做16srRNA基因测序试验；实施例五PCR检测试剂盒检测将上述34株收集的代表菌株和经VITEK检测的102株克雷伯属临床菌株在同样条件下采用本发明所提供的PCR检测试剂盒进行PCR方法的检测。1.待检样品模板DNA的提取A.针对购买的代表菌株(1)1%接菌量无菌操作，接种于3mlLB培养基中，200rpm，37°C过夜培养；(2)收集l.Oml过夜培养物，8000rpm离心5分钟，去上清。(3)500ulddH20重悬沉淀，8000rpm离心5分钟，去上清，尽量控干。(4)100ulddH2O重悬沉淀，混匀，IO(TC沸水浴IO分钟，(5)置冰上1分钟后，12000rpm离心2分钟。(6)取3ul中层上清作为PCR反应的模板。B.针对临床培养物(血培养物、痰培养物、尿培养物等)(1)收集阳性培养物l.Oml，8000rpm离心5分钟，去上清。(2)500ulddH2O重悬沉淀，8000rpm离心5分钟，去上清，尽量控干。(3)100ulddH2O重悬沉淀，混匀，IO(TC沸水浴IO分钟，(4)置冰上10分钟后，12000rpm离心2分钟。(5)取3ul中层上清作为PCR反应的模板。2.用微量移液器分别吸取PCR试剂盒中10uM引物lul、25mMMgCl22.5ul、10xbuffer2,5ul、10mMdNTP0.25ul、5U/ulTaq聚合酶0.25ul及3ul的待检样品模板DNA到0.2ml的薄壁PCR管中，最后用ddH20补足至总体积25ul，充分混匀；3.将混合物高速离心数秒后在PCR仪上按下列温度和时间进行扩增.-95。C5分钟l个循环；94。C30秒，55。C30秒，72""C30秒，30个循环；72。C2分钟l个循环。4.在电泳设备中电泳PCR扩增产物，记录结果。(1)取3ul扩增产物与0.5ul6x溴酚蓝上样缓冲液混合；(2)将混合液上样于1.5%的琼脂糖凝胶上；(3)将琼脂糖凝胶经120v电压稳压电泳约IO分钟，用DL2000Marker进行对照；(4)观察前沿溴酚蓝指示剂迁移至距加样孔至少3cm停止电泳，在凝胶成像仪上观察并并记录试验结果。5.依据如下条件进行结果判断肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种和/或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种应在269bp处有一条带。阳性对照和阴性对照试验只要将待检样品模板换成阳性对照品和阴性对照品模板即可，含有阳性对照品的模板检测结果在269bp处有一条带，阴性对照品的模板检测结果无条带显示。肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种的ITS核苷酸序列扩增后的电泳图如图2所示，其中1阳性对照品，2是阴性对照品，3是检测的肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种代表菌株，M是DL2000DNAMarker。普通菌株电泳结果记录见图3A-3B所示图3A中，l为肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种，2为肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种，3为肺炎克雷伯氏菌鼻硬结亚种，4为土生克雷伯氏菌，5为植生克雷伯氏菌，6为产酸克雷伯氏菌，7为解鸟氨酸克雷伯氏菌，8为产气肠杆菌，M为DL2000DNAmarker。所有购买的保藏菌株除肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种和臭鼻亚种菌株外，其他菌株均无扩增产物。图3B中，1为阳性对照品，2为宋氏志贺氏菌，3为弗氏志贺氏菌，4为鲍氏志贺氏菌，5为痢疾志贺氏菌，6为肠炎沙门氏菌，7为大肠杆菌，8为阳性对照品，9为阴沟肠杆菌，IO为霍乱弧菌，11为阪崎肠杆菌，12为金黄色葡萄球菌，D为普通变形杆菌，14为弗氏柠檬酸杆菌，M为DL2000DNAmarker。临床菌株部分电泳结果记录见图4所示其中，1为C1253，2为C1657，3为C2191，4为C2241，5为C2507，6为C2551，7为C3561，8为C3817，9为C4705，10为C1014，11为C1057，12为C1141，13为C1143，14为C1223，15为C1319，16为C1369，M为DL2000DNAmarker。以上16株临床菌生化鉴定均为肺炎克雷伯氏菌，且未指明为哪种亚种，而PCR试剂盒检测结果显示C2507和C4705为阴性，经16sRNA基因测序表明两株菌分别为K.v"n'/co/a和c/o"cae,说明采用PCR方法同普通生化检测方法相比，检测准确度提高了，避免了因检测失误而导致的不必要损失。试验表明使用本发明所提供的PCR检测试剂盒检测肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种，从临床样品只需要3-4个小时就可得到检测结果，检测周期縮短，检测速度加快，同时，PCR检测方法只需要待检样品中含有1-10个左右的菌体就可检测到。这样，克服了常规生化检测周期太长、不适应市场需要等特点。并且采用PCR检测方法比普通生化检测方法更准确，避免了因检测的失误而导致的不必要的损失。虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属
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的技术人员，在不脱离本发明之精神和范围内，当可作些许之更动与改进，因此本发明之保护范围当视权利要求所界定者为准。序列表〈110>天津生物芯片技术有限责任公司<120>对肺炎克雷伯氏菌肺炎或臭鼻亚种特异的ITS序列及应用<130>7P13016-CN<160>6〈170>Patentlnversion3.2<210〉1〈211〉427<212>腿〈213〉肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种含有tRNA-lie和tRNA-Ala基因的ITS核苷酸序列〈400〉1ccttaaagaacctgcctttgcagtgctcacacagattgtctgatgaa幼acagcagtaaa60aacctctacaggcttgtagctcaggtggttagagcgcacccctgataagggtgaggtcgg120tggttcaagtccactcaggcctaccaaatttgcgsagcaaatttgaagaggttgtaaacg180atggggctatagctcagctgggagagcgcctgctttgcacgcaggaggtctgcggttcga240tcccgcatagctccaccatctttactgcgeiacacaagaaaacttcagagtgaacctgaaa300aggtgcactgcgaagttttgctctttaa幼atctggatcaagctgaaaattgaaacgaca360cactgtttaagtgtgttcgagtctctc肌attttcgcaatcagaagtgaaacatcttcgg420gttgtga427<210〉2〈211〉427<212〉廳<213〉肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种含有tRNA-lie和tRNA-Ala基因的ITS核苷酸序列<400>2ccttaaagaacctgtctttgtagtgctcacacagattgtctgatgaa助acagcagtaaa60犯cctctacaggcttgtagctcaggtggtt3gagcgcacccctgataagggtgaggtcgg120tggttcaagtccEictcaggcctaccaaatttgcgaagc犯atttgaag3ggttgca肪cg180atggggctatagctcagctgggagagcgcctgctttgcacgcaggaggtctgcggttcga240tcccgcatagctccaccatctttactgcgaacacaagaaaacttcagagtgaacctgaaa300aggtgcsctgcgaagttttgctctttaaaaatctggatca3gctgaaaattg肪acga,c3360cacagttaatgtgtgttcgagtctctcaaattttcgcaatcagaagtgaaacatcttcgg420gUgtga427<210>3<211>19<212>DNA<213〉PCR检测引物上游序列〈400>3gcgaagcaaatttg肌gag19<210>4<211>21<212〉DNA<213〉PCR检测引物下游序列<400>4ccgaagatgtttcacttctga21〈210>5<211>17〈212>腿<213>扩增对克雷伯氏菌属特异的ITS核苷酸序列的上游引物<400>5tgtacacaccgcccgtc17<210〉6<211>21<212>DNA〈213〉扩增对克雷伯氏菌属特异的ITS核苷酸序列的下游引物<400>6ggtacttagatgtttcagttc2权利要求1.一种对肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种特异的ITS核苷酸序列，其特征在于包括以下序列a)SEQIDNO1或SEQIDNO2所示的核苷酸序列或其互补的DNA或RNA序列；b)不同于a)但编码的RNA序列与a)所编码的RNA序列相同的核苷酸序列或其互补的DNA或RNA序列；c)上述a)或b)中缺失、替换或插入一个或多个碱基、仍具有所述核苷酸功能的核苷酸序列或其互补的DNA或RNA序列。2.根据权利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于所述核苷酸序列为SEQIDNO:3或SEQIDNO:4所示的核苷酸序列或其互补的DNA序列。3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于SEQIDNO:3所示的核苷酸序列选自SEQIDNO:1的第152-170碱基的DNA序列或其互补的DNA序列。4.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于SEQIDNO:4所示的核苷酸序列选自SEQIDNO:2的第400-420碱基的核苷酸序列或其互补的DNA序列。5.—种权利要求1或2所述的核苷酸序列的应用，其特征在于所述核苷酸序列用于检测肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述核苷酸序列作为PCR引物或杂交反应的探针或基因芯片或微阵列用于检测肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种。7.—种扩增对肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种特异的ITS核苷酸序列的引物为SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的核苷酸序列或其互补的DNA序列。8.—种获得对克雷伯氏菌特异的ITS核苷酸序列的方法，其特征在于包括下述步骤(1)提取基因组；(2)通过PCR扩增肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种中的ITS基因簇；(3)构建ITS克隆；(4)对ITS克隆测序；(5)拼接及分析核苷酸序列；(6)筛选特异核苷酸序列；其中步骤(2)中使用的扩增引物是SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的核苷酸序列或其互补的DNA序列。9.一种PCR试剂盒，包括PCR引物、dNTP、缓冲液和DNA聚合酶，其特征在于所述PCR弓I物包括SEQIDNO:3或SEQIDNO:4所示的核苷酸序列或其互补的DNA序列。10.权利要求9所述的试剂盒在检测肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种中的应用。11.一种应用权利要求9所述的试剂盒检测肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种的PCR检测方法，其特征在于包括以下步骤(1)提取待检临床样品模板；(2)在PCR薄壁管中加入dNTP、MgCl2、lOx酶特异性反应缓冲液、耐热DNA聚合酶、PCR引物、待测样品模板和ddH20，混匀；(4)在电泳设备中电泳扩增产物，记录结果；(5)分析并进行结果判断。12.根据权利要求11所述的PCR检测方法，其特征在于各种成分的使用剂量为PCR引物各0.5ul，10mMdNTP0.25ul，10X酶特异性反应缓冲液2.5ul，5U/ul耐热DNA聚合酶0.2111，25mMMgCl22.5ul，3ul待检样品的模板DNA，用ddH20补足总体积至25ul。13.根据权利要求11所述的PCR检测方法，其特征在于所述的耐热DNA聚合酶为Taq聚合酶。14.根据权利要求11所述的PCR检测方法，其特征在于PCR扩增参数为95°C5分钟，l个循环；94°C30秒，55。C30秒，72°C30秒，回到第二步，计30个循环；72°C2分钟，1个循环。全文摘要本发明涉及对肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种或臭鼻亚种特异的ITS，包括a)SEQIDNO1或SEQIDNO2、或b)不同于a)但编码的RNA序列与a)所编码的RNA序列相同的核苷酸序列，或上述a)或b)中缺失、替换或插入一或多个碱基、仍具有所述核苷酸功能的DNA序列或其互补DNA或RNA序列。上述ITS序列用于检测肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种或臭鼻亚种。扩增上述ITS序列的引物为SEQIDNO5-6或其互补的DNA序列。本发明还涉及检测肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种或臭鼻亚种的PCR试剂盒。本发明的ITS序列及试剂盒实现了对肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种或臭鼻亚种快速、准确、简便的检测和鉴定。文档编号C12N15/11GK101469327SQ20071030136公开日2009年7月1日申请日期2007年12月25日优先权日2007年12月25日发明者露冯,曹勃阳,敏王,磊王申请人:天津生物芯片技术有限责任公司