专利名称：：生产辛伐他汀的方法
技术领域：
：'本发明涉及在宿主细胞中对HMG-CoA还原酶抑制剂辛伐他汀(simvastatin)的发酵生产。
背景技术：
：胆固醇和其它脂类通过低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)在体液中运输。能实现降低LDL-胆固醇的机制的物质可用作为有效的抗高胆固醇血试剂，因为LDL水平与冠心病的风险正相关。斯汀类的降胆固醇试剂是医药上非常重要的药品，因为它们能通过抑制HMG-CoA还原酶降低血中的胆固醇浓度。后一种酶催化胆固醇生物合成中的速率限制步骤，艮口，(3。-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)向甲羟戊酸的转化。如今，在降低胆固醇的应用中，辛伐他汀属于处方最常见的药物。辛伐他汀的合成并不直接，因为其涉及从天然产物洛伐他汀(lovastatin)(通过^s/ergz7/w5terreus合成)开始的半合成手段。洛伐他汀和辛伐他汀之间的分子区别在于C-8位上的侧链。其中，洛伐他汀携带2-甲基丁酸酯基元(moiety)，而辛伐他汀则在该位置具有2,2-二甲基丁酸酯基元。从1984年发现辛伐他汀以来，世界范围内已经报道了对辛伐他汀的多种化学合成方法。US4,444,784所述的一种途径涉及对洛伐他汀的2-甲基丁酸酯侧链的去酯化接着是数个不同的化学步骤，所述步骤涉及内酯化、羟基保护/去保护和用合适的2,2-二甲基丁酸盐/酯进行再酯化。该工艺的总产率很低。US4,582,915描述的另一种方法涉及使用金属烷基酰胺和甲基卤化物对洛伐他汀侧链直接甲基化。该方法会遇到与终产物浓度相关的问题，因为其会导致产生若干种副产物，必须将这些副产物与目标化合物分开。此外，使用的化学物质是有毒的和/或致癌的，这使得工业规模的实施困难且有害。类似地，US4，820，850中描述的另一种方法虽然解决了低产率和纯度的问题，但是其涉及了多达6个化学步骤，其中也利用了对于以工业规模的操作来说并不安全的试剂。US5，763，646中描述的方法涉及使用较少的化学步骤将洛伐他汀转化为辛伐他汀。但是，该方法使用了非常昂贵的化学试剂并且总产率也很低。名称R作为已有化学途径的替代，WO03/010324描述了对参与洛伐他汀生物合成的两种聚酮合酶(LovF)之一的代谢工程改造。但是，在宿主中直接发酵生产辛伐他汀的潜在问题是非天然侧链一一2,2-二甲基丁酸酯的引入。通过交换LovF聚酮合酶的模块与来自其它来源的模块不能解决该问题，因为，为了合成2,2-二甲基丁酸酯侧链，经修饰的LovF酶需要在洛伐他汀生产生物(例如X^ergZ〃wsfe〃ews)中并不存在的底物(甲基丙二酰-CoA)。在WO00/037629中提出，可以修饰/ovS基因，以生产其它的HMG-CoA还原酶抑制剂。因为/ov5基因参与对莫那可林(monacolin)J核心的生物合成，事实上其它的HMG-CoA还原酶抑制剂可通过对该基因的修饰获得，但是，并不能获得辛伐他汀，因为C-8位上的侧链形成并不归/ov^基因负责。
发明内容本发明的一个目的是提供用于辛伐他汀合成的发酵工艺，由此避免转化洛伐他汀所需的复杂的合成步骤，以及克服与WO03/010324相关的问题。本发明解决了上文列出的问题，这是通过提供下述宿主来实现的，所述宿主具有用于体内合成辛伐他汀上的2,2-二甲基丁酸酯侧链的必要构造单元(buildingblock)。如所显示的，只要甲基丙二酸盐/酯、甲基丙二酰-CoA或2，2-二甲基丁酸盐/酯被提供给宿主细胞，具有由一种或多种洛伐他汀生物合成基因构成的基因簇的任何物种都可生产辛伐他汀。除了2,2-二甲基丁酸盐/酯自身之外，也可使用它的衍生物，例如硫酯。这可以通过外界进料来实现，或者备选地，可通过用甲基丙二酰-CoA合成途径对宿主细胞进行工程改造来实现。其它的构造单元，莫那可林J，由含有一种或多种洛伐他汀生物合成基因的该细胞生产或被供应给该细胞。因此，本发明的上述目的和任何目的可通过本发明的方法来实现，其中，所述方法包括*提供能将2,2-二甲基丁酸酯侧链并入辛伐他汀的宿主，g卩，通过定制针对2,2-二甲基丁酸盐/酯的合成和/或并入优化过的聚酮合酶来实现-，.*发酵所述宿主，以获得辛伐他汀或其类似物或衍生物，即，通过以工业规模由补料分批工艺生产辛伐他汀来实现。本发明的实施方式涉及下述方法，该方法用于将所有形式的甲基丙二酸盐/酯或2,2-二甲基丁酸盐/酯或者这些化合物的衍生物(例如硫酯)供应给宿主，以在细胞内获得2，2-二甲基丁酸酯侧链和域用能体内合成甲基丙二酸-CoA的代谢途径工程改造宿主。甲基丙二酸-CoA生物合成途径可由两种酶加上丙酸盐/酯进料构成，所述两种酶即丙酰-CoA合成酶和丙酰-CoA羧化酶，其中，这两种酶途径从A^wgz7/wsmWw/a^(丙酰-CoA合成酶)和6Veptom少ceycoe/Zco/or(丙酰-CoA羧化酶)获得，以及其中，两种酶选自自然界中任何可获得的丙酰-CoA合成酶和丙酰-CoA羧化酶同源基因。或者，甲基丙二酸盐/酯生物合成途径由一种酶，即丙二酰-CoA合成酶构成，其中，所述一种酶途径从^^o&wn的物种获得，和/或所述一种酶选自自然界中任何可获得的丙二酰-CoA合成酶同源基因。高效的甲基丙二酰-CoA工程改造的一个例子由Reevesetal.(2007;Metabol.Engineer.9:293-303)所公开。宿主是具备编码洛伐他汀生物合成机制的一种或多种基因的任何宿主，其优选是选自真菌的组的真核生物，优选地，选自物种J^erg7'〃ws、尸em'c/〃/wm禾口5"accAarcw^yces。发明详述术语洛伐他汀生物合成基因包括来自的任何野生型基因，还包括经修饰的、失活的和截短的变体加上同源酶和具有相同功能的非同源酶(即，洛伐他汀酶系统)。术语2，2-二甲基丁酸盐/酯包括含有CH3CH2C(CH3)2C-R基元的所有生物可获得的分子，其中，R可以是0H、(TX+，其中X+代表阳离子，例如金属离子、氨或氮衍生的其它阳离子。特别合适的化合物是其中R代表活化基团的那些。本领域技术人员已知的任何活化基团都是合适的。特别合适的活化基团是例如S-辅酶A(SCoA)或其衍生物、S-N-乙酰半胱胺(SNAC)或其衍生物、S-甲基硫代乙醇酸盐/酉旨(SMTG)、硫代垸基等。本发明的第一个方面是向宿主提供2,2-二甲基丁酸酯侧链的稳定供应。使用LC-MS分析表明，该化合物在天然的洛伐他汀生产者(例如^w^^7/m中不合成或不存在。第二，在被培养于洛伐他汀生产条件下的野生型A;e^/〃w5te庁ew5中，2，2-二甲基丁酸盐/酯和辛伐他汀都不能被检测到，无论是细胞内还是细胞外的。第三，酶测量表明，甲基丙二酰-CoA——2,2-二甲基丁酸盐/酯合成的假定前体，在生产洛伐他汀的野生型乂^ergz7/1^中也不存在。这些综合在一起表明，wgz7/w^rew缺乏用以合成2，2-二甲基丁酸盐/酯的甲基丙二酰-CoA。本发明的一种实施方式描述了将甲基丙二酰-CoA供应给具有整套洛伐他汀生物合成基因簇或其中单个基因的生物(例如J^wgz7/^^re^)的无细胞提取物或者能通过遗传改造生产洛伐他汀的任何其它生物的无细胞提取物。合适的生物是选自Bac"/w5amo/;^we/a"'e似、5ad//usra^z'fo和^yc/zer/c/n'aco//构成的组的原核生物或选自爿印ergz'〃usmWw/a"s、pwr，mz、Sacc/^romjcescerevz/ae禾口《/w_yvenm_ycfcy/acto构成的组的真核生物。生物被培养于WO98/37179所述的洛伐他汀生产条件下。或者，可通过外界进料来增加洛伐他汀和/或中间产物的水平。存在其它必要的构造单元和辅助因子(例如，莫那卡林J、乙酰-CoA、NADPH、ATP和S-腺苷甲硫氨酸)时，洛伐他汀生物合成酶可出人意料地使用甲基丙二酰-CoA来合成辛伐他汀。因此证实，野生型^^^^7/mte厅e^不能合成甲基丙二酸盐/酯、甲基丙二酰-CoA和/或2，2-二甲基丁酸盐/酯。本发明的另一实施方式描述了将辛伐他汀前体2，2-二甲基丁酸盐/酯供应给具有整套洛伐他汀生物合成基因簇或其中单个基因的生物(例如A^e《///1^^t^m)的培养物或者通过遗传改造在洛伐他汀生产条件下培养时能生产洛伐他汀的任何其它生物(例如，尸em'd/"wmcAo^gem/m、Sacc/zaramyc&scereWsz'ae、5acz'〃ussw^'fo、五sc/zehc/n'aco/z')的培养物(见WO98/37179)。所述生物可具有洛伐他汀生物合成基因或经修饰的/失活的洛伐他汀生物合成基因以及与洛伐他汀生物合成基因同源的生物合成基因(在本文中氨基酸水平上30-40%相同被认为同源)的整套或一部分(如Xieaa/.在Chemistry&Biology13，1161(2006)和Appl.Environ.Microbiol.73，2054(2007)中所示)。具有与洛伐他汀生物合成基因"基本同源"的氨基酸序列的多肽被定义为具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与指定的氨基酸序列具有至少30%，优选至少40%，更优选至少50%,进一步更优选至少60%，进一步更优选至少70%，进一步更优选至少80%，进一步更优选至少90%，进一步更优选至少98%以及最优选至少99%的同一性程度，所述基本同源的肽展示出朝着洛伐他汀和/或辛伐他汀合成的方向的活性。基本同源的多肽可包括多态性，这可存在于来自不同种群的细胞中或由于天然的等位或菌株内变化而存在于种群中。基本同源的多肽还可源自并非是指定的氨基酸和/或DNA序列所来自的真菌的其它物种，或者可被人工设计并合成的DNA序列所编码。与指定的DNA序列相关并且通过遗传密码简并获得的DNA序列也是本发明的一部分。同源体还可包括全长序列的生物活性片段。就本发明的目的而言，两条氨基酸序列间的同一性程度指两条序列间相同的氨基酸的百分比。同一性程度是用BLAST算法测定的，该算法被描述于Altschul,etal.，J.Mol,Biol.215:403-410(1990)中。用于进行BLAST分析的软件是可通过NationalCenterforBiotechnologyInformation(http:〃www.ncbi.nlm.nih.qov/)公开获f导的。BLAST算法参数W、T和X决定比对的敏感度和速度。BLAST程序默认使用11的字长(W)、BLOSUM62计分矩阵(见Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915(1989))、50的比对(B)、10的期望(E)、M=5、N二4和两条链比较。基本同源的多肽可含有指定的氨基酸序列的一个或多个氨基酸的仅保守取代或者非必要氨基酸的取代、插入或缺失。因此，非必要氨基酸是在这些序列之一可被改变而不会实质上改变生物学功能的残基。例如，关于如何进行表位沉默氨基酸取代的指导被提供于Bowie，J.U.etal.，Science247:1306-1310(1990)中，其中作者指出，研究氨基酸序列对改变的耐受性有两种主要手段。第一种方法依赖于进化过程，其中突变被自然选择接受或拒绝。第二种手段使用遗传工程改造，以在克隆的基因的特定位置引入氨基酸改变，并且进行选择或筛选以鉴定出保持了功能性的序列。如作者所指出的，这些研究已经揭示，蛋白对氨基酸取代有着令人吃惊的耐受性。作者还指出了在蛋白的某位置哪些改变可能是许可的。例如，埋在最里面的氨基酸残基需要非极性侧链，而表面侧链通常很少有特征是保守的。其它此类表型沉默取代被描述于Bowieetal和其中提到的参考文献中。术语"保守取代"意欲表示这样的取代，其中，氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基代替。这些家族是本领域已知的，其包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、无极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、带&支链的侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。此外，可以使用并不同源但是遵循用于合成斯汀类的相同生物合成构造原则的生物合成基因簇。当向具有一个或多个洛伐他汀生物合成基因(例如，完整的二酮合酶基因，例如/ovF基因)的生物供给2，2-二甲基丁酸盐/酯时，获得大致比例为50:1的洛伐他汀和辛伐他汀的混合物。来自As^erg///^tore^的洛伐他汀生物合成基因/ovF被描述为编码产生2-甲基丁酸盐/酯基元的酶的基因(Hutchinson,C.R.etal.，爿wtom'eva打Zeawe"/zo^:2000,M,pages287-295)。因此，令人吃惊地，洛伐他汀酶系统除了展示出对2-甲基丁酸盐/酯的天然偏好之外，还展示出对2,2-二甲基丁酸盐/酯的相当高的底物耐受性。通过加入由本领域已知的方法(例如定向进化、基因改组(shuffling)或定点诱变)优化过的、偏好于合成2，2-二甲基丁酸盐/酯的/wF基因和/或通过插入点突变(人工终止密码子)来失活Apergz7/uste^^的野生型/ov尸基因，可达成进一步的改善。向具有洛伐他汀生物合成基因的微生物供给2，2-二甲基丁酸盐/酯导致改善了辛伐他汀的生产。另一实施方式描述了用用于体内甲基丙二酰-CoA生产的途径对可能的宿主(例如^pergWwsterras)进行的工程改造。这可以以三种方式来进行。第一种途径起始于丙酸盐/酯。丙酸盐/指被转化为丙酰-CoA，随后羧化为甲基丙二酰-CoA。用于该途径的酶可从^"内om少c^coe//co/or(Diacovich，L.etal.,J.Biol.Chem.2002，H，pages31228-31236)或携带同源基因的任何其他物种获得。具备该途径的^y/7^^7/wfe厅ew宿主在发酵期间需要丙酸盐/酯进料，以实现甲基丙二酰-CoA的最优合成。在另一实施方式中，使用来自i/zfeo&wmsp.的丙二酰-CoA合成酶(Kim，Y.S.etal.,/1991,273，pages511-516)，其在正常情况下催化从丙二酸盐/酯形成丙二酰-CoA。如Pohl,N丄.etal.,C&m.Soc.2001,ill,pages5822-5823所描述的，丙二酰-CoA合成酶具有不寻常的高的底物耐受性，并且易于以与野生型反应相当的速率将甲基丙二酸盐/酯转化为相应的CoA酉旨。因此，丙二酰-CoA合成酶基因的整合以及甲基丙二酸盐/酯的外界供给导致产生了体内生产甲基丙二酰-CoA的替代性途径。在另一实施方式中，使用甲基丙二酰-CoA歧化酶-差向异构酶途径(Dayem，L.C.etal.，5ZocAew^^y2002,41,pages5193-5201)。这包括两种酶(甲基丙二酰-CoA歧化酶和甲基丙二酰-CoA差向异构酶)的顺序作用，其将琥珀酰-CoA转化为(2R)-甲基丙二酰-CoA然后转化为(2S)-甲基丙二酰-CoA。当将B12前体羟钴胺素和丙酸盐/酯供应给具有尸n9pz'om'Za"en'wws/ermaw'z'甲基丙二酰-CoA歧化酉每禾口《SVre/tom_ycescoe//co/or甲基丙二酰-CoA差向异构酶的细胞时，产生甲基丙二酰-CoA。本发明的第二方面是用聚酮合成酶和/或洛伐他汀酶系统的其它酶来装备宿主，所述酶是较之天然酶的低活性而言针对合成该2，2-二甲基丁酸盐/酯和/或将其连到莫那卡林J核心上优化过的。如上文所述，除了通常接受的侧链2-甲基丁酸盐/酯之外，经修饰的LovF蛋白还可合成辛伐他汀侧链2，2-二甲基丁酸盐/酯，虽然产率较低。经修饰的LovF属于真菌聚酮合酶的类。聚酮合成酶的一个显著特征是结构域的结构。在细菌的I型聚酮合酶(Khosla，C.etal.,C/^m.iev.1997,22,pages2577-2590)中，结构域被组织于模块中，每个模块仅催化一种縮合反应。在真菌系统中，情况较为复杂。真菌的聚酮合酶是较大的蛋白，它们具有多个结构域。此外，在描述过的很多情况下，结构域看似会多次使用，例如，仅具有一个酮-合酶结构域的酶却能产生九酮(见，例如，Hutchinson,C.R.etal"Jwtom'e丄ee詣ew/oeA:2000，3-4，pages287-295)。其中隐藏的机制尚未被完全理解。相反，A^wgz7/wte厅e^的LovF酶看起来是真菌聚酮合酶的最简单的情况。其由包含6个结构域的单条多肽构成。显而易见地，每个结构域仅用一次，产生2-甲基丁酸盐/酯。为优化使用能体内合成甲基丙二酰-CoA的宿主进行辛伐他汀发酵的产率，需要针对使用这种底物对LovF蛋白加以优化，并将其转化为2,2-二甲基丁酸盐/酯。在这方面，简单的结构是有用的，因为其以相当于I型PKS那样发挥作用。这是对酶进行朝向2，2-二甲基丁酸盐/酯聚酮合酶的方向进行工程改造的先决条件。在一种实施方式中，通过替换若干结构域对LovF酶进行工程改造，这导致从甲基丙二酸-CoA对2,2-二甲基丁酸盐/酯的生产增加，并且，当被整合进甲基丙二酰-CoA生产宿主的洛伐他汀生物合成基因簇(替代野生型Z^vF基因)时，辛伐他汀的生产增加。这些步骤的详细描述在实施例中给出。实施例一般材料和方法按照其它文献所述(Sambrook,J.etal.(1989),Mo/簡/arc/om'wg..aA360rato/^wawwa/，2ndEd.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor，NewYork)来进行标准流程。使用高保真聚合酶Turbo-Pfu-Polymerase或Herculase(Stratagene,TheNetherlands)，遵循厂商方案来扩增DNA，而对构建的菌株和质粒的验证则使用Taq聚合酶来实现。限制性酶来自Invitrogen或NewEnglandBiolabs。对于常规克隆而言，使用^c/^n'c/n'aco/z'菌株T叩10和DH10B(Invitrogen)。对构建的质粒的验证通过限制性分析和随后的测序(SeqiabGmbH，Goettingen，Germany)来进行。有丝真菌J印ergz7/uyter^w菌株ATCC20542在进料实验中被用作为洛伐他汀生产者，并被用作为遗传工程改造试验的基础(见下文描述)。提取和HPLC分析用1ml甲醇来提取冻干样品。为达到此目的，向冻干材料中加入1ml甲醇，接着以最高速度对每份样品进行至少1分钟的旋转震荡(vortexing)。小心确保Eppendorf管中的所有材料成为悬浮液，并且提取期间没有留下块状物。以13,000rpm对管进行5分钟的离心，然后将澄清的上清液转移到HPLC样品管中。HPLC分析如下所示洗脱液milliQ水中的60%乙腈梯度无梯度柱WatersXTerraRP18柱温室温流速1ml/分钟注射体积10Ad槽温至温设备WatersAlliance2695检测仪Waters996光二极管阵列波长238nm驻留时间洛伐他汀3.8分钟辛伐他汀4.7分钟实施例1野生型Aspergillusterreus不产生甲基丙二酸盐/酯和甲基丙二酰-CoA在洛伐他汀生产培养基中以10E5-10E6个分生孢子/ml接种分生孢子或v4^erg!7/"ste〃eus菌株ATCC20542(或通过突变以及针对更高的生产能力加以筛选从其获得的菌株，优选地，按照下文指出的方案之一进行突变和筛选)，所述培养基含有(g/1):右旋塘，40;CH3COONH4，2.2;Na2S04，4;KH2P04，3.6;K2HP04.3H20，35.1;微量元素溶液(柠檬酸.1120，150;FeS04.7H20，15;MgS04.7H20，150;H3B03，0.0075;CuS04.5H20，0.24;CoS04.7H20，0.375;ZnS04.7H20，1.5;MnS04.H20，2.28;CaCl2.2H20，0.99)，10(ml/1)(WO98/037179)。于28。C在轨道摇床上以220rpm对培养物进行144-168小时的培养。在发酵终点，通过离心或过滤除去菌丝体，用生理盐水洗菌丝体。针对形成的丙二酸盐/酯、丙二酸CoA、甲基丁酸盐/酯、洛伐他汀、甲基丙二酸盐/酯、甲基丙二酸-CoA、2,2-二甲基丁酸盐/酯和辛伐他汀，通过本领域公知的LC-MS方法来检验菌丝体和培养基。仅能检测到前四种化合物，这验证了Ater^^不能从头合成甲基丙二酸盐/酯。实施例2通过将2,2-二甲基丁酸盐/酯供应给ferreuATCC20542来形成辛伐他汀按照实施例1所述来培养v^;wgz7/uy^re^。在48-96小时的预培养后，在新鲜培养基中以1:10的比例对培养物加以稀释。此外，在培养基中加入0、0.1和1.0g/1的甲基丙二酸盐/酯或2,2-二甲基丁酸盐/酉旨、N-乙酰半胱胺。在水平摇床上对培养物进行96-168小时的培养。随后将培养基的上清液与细胞分开，针对洛伐他汀和辛伐他汀对细胞和培养基加以分析。除了洛伐他汀之后，还能检测到辛伐他汀，但是仅在加入了2，2-二甲基丁酸盐/酯前体的培养物中检测到。在这些中，辛伐他汀典型地以洛伐他汀水平的1/50存在。实施例3用丙二酸合酶对Aperg!7/Mte^e^ATCC20542进行代谢工程改造，以生产甲基丙二酸-CoA对来自i/^o&wmsp.(GenBank检录号H75771.1)的丙二酰-CoA合成酶基因进行PCR扩增，在」^ergz7/wmV/w/awg/w"启动子的控制下克隆，随后将其整合进Ate厅e^的基因组。用am^S共选择来进行标准的真菌转化技术，以筛选出阳性转化子(Ruiz-Diez，B.,^少/.Mz'cro&o/.2002,22，pages189-195)。用菌落PCR选出具有稳定整合进基因组的丙二酸合酶表达盒的转化子。按照实施例1和2所述对转化子加以培养，此外，向培养基中加入甲基丙二酸盐/酯。样品加工后可以检测到甲基丙二酰-CoA。实施例4用丙酰-CoA合成酶和丙酰-CoA羧化酶对七。^gz7/wferm^ATCC20542进行代谢工程改造，以产生甲基丙二酸-CoA对分另ll来自￡^c/2en.c/n.flco//禾口S&印tom3;c&scoe/ico/or的丙酉先-CoA合成酶(GenBank检录号R88078.1)和丙酰-CoA羧化酶(GenBank检录号AL939113)基因进行PCR扩增，在A^ergz'〃wsmWw/a朋砂W启动子(GenBank检录号M19694)的控制下克隆，随后将其整合进Aterm^的基因组。用am^S或潮梅素B共选择来进行标准的真菌转化技术，以筛选出阳性转化子。用菌落PCR选出两种表达盒均稳定整合进基因组的转化子。按照实施例1和2所述对转化子加以培养，此外，向培养基中加入丙酸盐/酯。样品加工后可以检测到甲基丙二酰-CoA。实施例5将丙二酰-CoA和甲基丙二酰-CoA体外转化为洛伐他汀和辛伐他汀按照实施例1所述，在28°C对^Tews进行2天的培养。对细胞进行洗涤、冻干，获得无细胞提取物。为评估两种菌株的合成能力，进行下述检验(在下表中概括)培养1-24小时后，对样品进行分析。在反应1(对照)中没有检测到产物。在反应2和3中可以容易地看到洛伐他汀和辛伐他汀的形成，虽然洛伐他汀的形成速率要高于辛伐他汀的形成速率。在样品4和5中，由于仍然存在于细胞中的细胞内水平的莫那卡林J，所以仅能检测到痕量。该结果表明，当可获得正确的底物时，^^^7/w的酶组能产生辛伐他汀。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>实施例6使用LovF聚酮合酶体外生产2-甲基丁酸盐/酯和2,2-二甲基丁酸盐/酯构建pSIMVAl(pENTR/SD/D-Topo-LDi^)禾QPSIMVA2(pET-DEST42陽H幻使用开放读码框(ORF)周围紧邻的寡核苷酸，使用来自在洛伐他汀生产条件下培养的fe/reusATCC20542的cDNA，通过PCR扩增能编码来自A/wgz'〃1^的LDKS蛋白的/ovF基因(GenBank号码AAD34559.1)。从琼脂糖凝胶纯化得到的5kb的DNA片段，随后用于克隆进pENTR/SD/D-Topo(Invitrogen试剂盒)，这都按照厂商方案来进行，产生了pSIMVAl。按照厂商方案，将由此获得的GatewayEntry载体(Gatewaytechnology,Invitrogen,TheNetherlands)与目标载体pET-DEST42重组，产生E.coli表达载体pET-DEST42-LDi^S，或pSIMVA2。通过DNA测序验证了pSIMVAl和pSIMVA2的序列。在五.co//BL21Star(Invitrogen,TheNetherlands)中重组生产聚酮合酶LovF质粒pSIMVA2和pREP4-gsp质粒(其编码能修饰ACP基元的P-Pant-转移酶，Mootz,H.D.etal.,尸rac.扁.爿cad2000,￡2,pages5848-5853)被转化进Aco//BL21Star细胞中。两种质粒可被共转化，因为它们具有不同的抗性标记(分别针对氨苄青霉素和卡纳霉素)。得到的菌株被用于重组生产聚酮合酶LovF。典型地，1升富含2YT(0.1mg/mL氨节青霉素)的培养基被10mL在相同培养基中培养的过夜培养物BL21Star/pSIMVA2接种。培养物被培养于37。C,直到OD600达到0.5-0.7。用0.5mMIPTG诱导蛋白生产，细胞在30°C培养4小时。由此获得的LovF蛋白被用于体外实验。在大多数情况下，通过在50mM磷酸盐缓冲液pH6.8、0.3mMNaCl、20%甘油、5mMDTT、+/-1mMETDA、1*完全蛋白酶抑制剂混合物(RocheDiagnostics,Germany)中对细胞悬浮液进行超声处理来裂解五.co"'细胞。通过离心除去细胞残骸后，获得的CFE被用于实验。或者，我们通过将CFE(在没有EDTA的缓冲液中裂解的)应用到Ni-NTA柱上来富集LovF蛋白。由于存在的C-末端HisTag，酶在基质上结合，并可用200mM咪唑洗脱下来。可以使用超滤将酶浓縮至毫摩尔的浓度，随后将其用于酶检验。对聚酮合酶LovF的体外2-甲基丁酸盐/酯和2,2-二甲基丁酸盐/酯形成检验通过在体外反应中针对2-甲基丁酸盐/酯进行筛选来验证LovF聚酮合酶的活性。在总体积为1mL的50mM磷酸盐缓冲液pH6.8中，将10-100微摩尔LovF(或者，100微升含有LovF的CFE)与1mM丙二酰-CoA、1mMS-腺苷甲硫氨酸、5mMNAPDH、5mMDTT、1mM乙酰-CoA—起孵育。反应在25。C进行1小时。完成后，用乙酸乙酯(5%乙酸)萃取聚酮。收集有机相，在真空下除去溶剂(SpeedVac)。最后，将产物重新溶解于小体积(10-50微升甲醇或乙腈)中。对产物2-甲基丁酸盐/酯和2,2-二甲基丁酸盐/酯的分析用LC-MS/MS和NMR来进行。典型地，2,2-二甲基丁酸盐/酯以2-甲基丁酸盐/酯水平的1%存在。实施例7使用经工程改造的LovF聚酮合酶进行的改善的对2,2-二甲基丁酸盐/酯的体外生产质粒构建真菌聚酮合酶LovF由以下顺序的下述结构域构成KS-AT—DH_MT—KR-ER-ACP(KS-酮合酶；AT二酰基转移酶；DH-脱水酶；MT-甲基转移酶；101=酮还原酶；EI^烯酰基转移酶；ACP二酰基载体蛋白)基于该蛋白，我们对两种新的杂交体蛋白进行了工程改造，这两种蛋白都显示出(增加的)形成2,2-二甲基丁酸盐/酯的活性。第一种杂交体PKS被称为杂交体1，其是通过用来自5"acc/zara;o/;;;yporaeo^"ae的脱氧红霉内酯B合酶模块6的酰基转移酶(AT)结构域(GenBank检录号AAA26495.1)替换来自LovF的酰基转移酶结构域(AT)来构建的。第二种杂交体PKS被称为杂交体2，其是通过用来自！^^Wa;^幼's的耶尔森菌素(Yersiniabactin)合成酶的//M『尸7基因的同源片段MT(GenBank号码AAC69588.1)替换LovF的MT片段来构建的。//MW尸/基因的MT结构域能产生产生偕二甲基，并因此能实现2,2-二甲基丁酸盐/酯合成。对杂交体1的遗传工程改造。用携带As^^7/wte厅ew的/ovF基因的质粒pSIMVAl作为模板，以插入AT结构域侧翼的限制性位点。通过DNA序列比对(BLAST搜索，NCBI)来选择AT边界定义。合成分别含有^el禾n位点的正向和反向DNA寡核苷酸，用QuickchangeMutagenesis试剂盒(Stratagene)将限制性位点插入/ovF基因。实验流程按照厂商方案来进行。随后，对构建体进行完全测序，以排除寡核苷酸和聚合酶的误差。平行地，还用携带^el和Pad位点的寡核苷酸，通过PCR扩增来自Sflcc/^ropo/;^;wraeo^m7e的脱氧红霉内酯B合酶AT6结构域基因，并将其克隆进pCR-Blunt载体(Invitrogen,TheNetherlands)。寡核苷酸和限制性位点被制造为能确保将EryAT6结构域以同框方式(inframe)克隆进/ovF基因。对pSIMVA3(pCR-Blunt-EryAT6)的DNA序列加以验证后，通过首先使用SpelAPGcI除去洛伐他汀AT接着将经S;el/尸flcl处理的EryAT6连接进洛伐他汀构建体，来构建pSIMVA4(pENTR画SD-D墨Topo-LovF(EryAT6))。使用厂商方案，用Gateway反应来构建表达质粒pSIMVA5(pET-DEST42-LovF(EryA6))。对杂交体2的遗传工程改造。按照与杂交体1的设置相似的方式来实现杂交体2的构建。使用Quickchange诱变试剂盒，通过携带下述限制性酶位点的寡核苷酸，插入MTLovF片段的^el/户"cl侧翼序列。此外，用相同的侧翼限制性酶来扩增来自r^^'m'flp^fe的耶尔森菌素合成酶/zmw;^基因的MT片段。交换两条片段，产生质粒pSIMVA6(pENTR-SD-D-Topo-LovF(MTHMWP1))。使用厂商方案，用Gateway反应来构建表达质粒pSIMVA7(pET-DEST42-LovF(MTHMWP1))。在五.co/z'B121Star中重组生产杂交体1和杂交体2以及体外检测2,2-二甲基丁酸盐/酯质粒pSIMVA5或pSIMVA7(分别地)和质粒pREP4-gsp(其编码能修饰ACP基元的P-Pant-转移酶，Mootz,H.D.etal.,Prac.扁.2000，22,pages5848-5853)被转化进五sc/zm'c/^co//BL21细胞中。得到的菌株被用于重组生产聚酮合酶LovF。典型地，1升富含2YT(0.1mg/mL氨苄青霉素)的培养基被10mL在相同培养基中培养的过夜培养物接种。培养物被培养于37。C，直到ODs。。达到0.5-0.7。用0.5mMIPTG诱导蛋白生产，细胞在22。C培养12-16小时。由此获得的LcwF蛋白被用于体外实验。在大多数情况下，我们通过在50mM磷酸盐缓冲液pH6.8、0.3mMNaCl、20%甘油、5mMDTT、+/-1mMETDA、1*完全蛋白酶抑制剂混合物(RocheDiagnostics,Germany)中对细胞悬浮液进行超声处理来裂解五.co/Z细胞。通过离心除去细胞残骸后，由此获得的CFE被用于实验。或者，我们通过将CFE(在没有EDTA的缓冲液中裂解的)应用到Ni-NTA柱上来富集LovF蛋白。由于存在的C-末端HisTag，酶在基质上结合，并可用200mM咪唑洗脱下来。与野生性蛋白不同，杂交体蛋白不应被浓度超过5mM的咪唑洗脱。这是由于杂交体酶与Ni-NTA树脂的亲和性较低导致的。最可能地，蛋白构象的改变导致六组氨酸亲和标签较难接近。可以使用超滤将酶浓縮至0.1-0.5mM的浓度，随后用于酶检验。用于杂交体酶的酶检验以与WT聚酮合酶LovF检验(见实施例6)相似的方式进行。使用LC-MS/MS和NMR来分析产物2，2-二甲基丁酸盐/酯。实施例8使用Aspergillusterreus体内生产辛伐他汀构建表达盒PgpdA-LovF/杂交体PKS-TpenDE为构建带有PgpdA-LovF/杂交体PKS-T，DE盒的载体，使用多位点Gateway技术(Invitrogen,TheNetherlands)。用于这三种PKS(LovFWT和两种杂交体PKS)的方法是等同的。因此，使用具有并入的5'-attB4和3'-attBl位点的寡核苷酸来对^per^7/wmV/w/a^的gpdj基因(GenBank检录号M19694)的启动子进行PCR扩增。与质粒pDONRP4-PlR的重组导致产生了具有attL4和attRl侧翼位点的ENTRY载体。已经将LovF/杂交体PKS基因克隆进具有侧翼attLl和attL2位点的ENTR载体，其可直接用于多位点gateway反应。用携带5'-attB2和3'-attB3位点的寡核苷酸，通过PCR扩增来自尸e"/c/肌wmc/zo^oge肌m的青霉素生物合成途径的酰基转移酶(pe"A&)基因(GenBank检录号4379346)的终止子。与载体pDONRP2R-P3的重组导致产生具有侧翼attR2禾口attR3位点的ENTR载体。然后在LR-Clonase反应中将这三种ENTR载体与目标载体pDEST-R4R3—起孵育，产生表达载体pSIMVA8(对于LovFWT而言)、pSIMVA9(对于杂交体l而言)和pSIMVA10(对于杂交体2而言)。最后对表达盒进行测序，以排除由于PCR聚合酶或Gateway重组反应造成的序列错误。将。SIMVA8-10的表达盒随机整合进j犯erg/〃wfe〃eM菌株将质粒pSIMVA8-10转化进^c/^;7'c/^co/z'ToplO细胞(Invitrogen,TheNetherlands)，进行大规模的质粒与100mL富集培养基(2YT+100吗/mL氨苄青霉素)中过夜培养物的分离，从每种质粒产生了200昭DNA。通过使用合适的限制性酶，例如J^oIM化I或^el，从质粒主链上切下PgpdA-L0VF/杂交体PKS-TpenDE盒。对所述的盒进行凝胶纯化。每次转化使用5-10pgDNA盒，并且使用处于g;^4启动子控制下的腐草霉素抗性基因(Punt,P丄etal.M"AoAo/Ewzj^o/ogy1992,2J^，p.447-457)作为选择标记，并按照Ruiz-Diez,B.,乂J;//.M/croZn'o/.2002，22,p.189-195所述，将其共转化进/ovF缺陷型A;ergz7/1^^Tews菌株ATCC20542。或者，可使用其中不存在竞争途径(例如洛伐他汀生产)的/ovF缺陷型爿5pergz7/Mte〃eus菌株。这可单独进行，或者与实施例3和4所述的甲基丙二酰-CoA合成途径组合进行。培养经转4七的^wen"/1^tewet^菌株选择腐草霉素抗性Aperg77/wbrew菌落，通过PCR和Southern杂交印迹技术，针对稳定整合进基因组的杂交体PKS基因或LovF来进行进一步筛选。然后按照实施例1所述，用0.5mM甲基丙二酸盐/酉旨(在丙二酰-CoA合成酶整合的情况下)或1mM丙酸盐/酉旨(在丙酰-CoA合成酶、羧化酶整合的情况下)，培养携带腐草霉素抗性基因和整合的PKS二者的阳性候选者。结果，我们鉴定发现*其中整合了WT/ov尸基因的Ay/^g/〃Mte/rew菌株导致洛伐他汀生产的完全恢复；以及*整合的杂交体PKS1和2两者均可导致辛伐他汀的产生。当杂交体PKS基因在整合的LovF缺陷型菌株中时，发现的洛伐他汀较少。通过LC-MS/MS和NMR技术的组合对这些结果进行了验证和证实。权利要求1.使用具有Lov-生物合成基因簇或其一部分或与所述Lov-生物合成基因簇同源的基因的微生物来发酵生产辛伐他汀的方法。2.根据权利要求1的方法，其中所述微生物是原核生物或真核生物。3.根据权利要求2的方法，其中所述原核生物选自5"7/^awo/3^w咖cz.e"51、J5ac/〃W5swZ^z.fc禾口^&c/zen'c/z.aco//构成的组4.根据权利要求2的方法，其中所述真核生物选自J^e^7/wM0wa5cws/wpwrecK<Sacc/^omyc&scem^z'ae禾口幻w"e;-omyces1构成的组。5.根据前述任意一项权利要求所述的方法，其中，添加2，2-二甲基丁酸或其盐或酯。6.根据前述任意一项权利要求所述的方法，其中，添加甲基丙二酸或其盐或酯。7.—种微生物，该微生物具有Lov-生物合成基因簇或其一部分或与所述Lov-生物合成基因簇同源的基因，该微生物具备甲基丙二酰-CoA生物合成途径。8.—种DNA序列，其与用于2,2-二甲基丁酸盐/酯或辛伐他汀生产的洛伐他汀生物合成基因簇具有〉30%的同一性。9.一种蛋白序列，其与用于2,2-二甲基丁酸盐/酯或辛伐他汀生产的洛伐他汀生物合成蛋白具有>30%的同一性。全文摘要本发明提供了合成辛伐他汀的发酵工艺，这通过下述过程来实现提供能将2，2-二甲基丁酸酯侧链并入辛伐他汀的宿主，即，通过定制针对2，2-二甲基丁酸盐/酯的合成和/或并入优化过的聚酮合酶来实现；任选地，将针对2，2-二甲基丁酸盐/酯合成的合适底物供应给所述宿主；发酵所述宿主，以获得辛伐他汀或其类似物或衍生物，即，通过以工业规模由补料分批工艺生产辛伐他汀来实现。文档编号C12P17/02GK101473040SQ200780023350公开日2009年7月1日申请日期2007年6月18日优先权日2006年6月20日发明者胡戈·斯特里科斯特罗,马可·亚历山大·伯格·范德,马库斯·汉斯申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司