在苏氨酸醛缩酶和脱羧酶的存在下由甘氨酸和醛出发制备对映异构富集的β-氨基醇的方法

专利名称：：在苏氨酸醛缩酶和脱羧酶的存在下由甘氨酸和醛出发制备对映异构富集的β-氨基醇的方法在苏氨酸醛縮酶和脱羧酶的存在下由甘氨酸和醛出发制备对映异构富集的^-氨基醇的方法
技术领域：
：本发明涉及酶促制备对映异构富集的i3-氨基醇的方法。对映异构富集的/3-氨基醇是重要的药品或其前体，例如为用于治疗心血管疾病、心力衰竭、哮喘和青光眼的药品或其前体。此外，对映异构富集的iS-氨基醇也可以作为不对称合成中使用的催化剂和手性拆分试剂的构成片段(buildingblock)。由EP-B1-0751224已知上述方法，所述专利文献中公开了采用L-选择性酪氨酸脱羧酶来转化DL-多產y-3-苯基丝氨酸或其卤素取代产物从而制备(R)-2-氨基-l-苯基乙醇或其卤素取代产物的方法，其中，酪氨酸脱羧酶优选源自肠道球菌(五"^ococow)、乳酸杆菌aacto&c/〃M)、普罗威登斯菌(尸raWfife腦'a)、链孢菌(Fwsan.騰)或赤霉菌(G^ere〃a)。这种方法的主要缺点在于，利用对映选择性酶转化外消旋原料，可能得到的对映异构纯最终产物的最高产率为50%。因此，本发明的目的在于提供一种最高产率可以更高的方法。该目的通过如下方法实现，所述方法中，甘氨酸或甘氨酸盐与醛在苏氨酸醛縮酶和脱羧酶的存在下进行反应，从而形成相应的对映异构富集的卩-氨基醇，并且至少所述苏氨酸醛縮酶或所述脱羧酶具有/3-选择性。如实施例中所示，采用本发明的方法可以制备产率高于50%且具有高对映异构体过量(e.e)的/5-氨基醇。由Kimum等(1997)的J.Am.Chem.Soc.Vol199，11734-11742页已知了在对映选择性苏氨酸醛縮酶的存在下甘氨酸与各种醛进行反应制备/3-羟基-ce-氨基酸的酶促方法。这种酶促方法具有如下缺点，用于制备界星域^^^-羟基-a-氨基酸的酶的优先选择性明显较低。这种方法的另一个缺陷在于，通常所得产率较低。，鉴于如Kimura等(1997)的J.Am.Chem.Soc.Vol199，11734-411742页所公开的，在对映选择性苏氨酸醛羧酶的存在下，甘氨酸与醛进行反应得到具有低产率的/3-羟基-o;-氨基酸，因此本发明的方法可以得到具有高产率的对映异构富集的P-氨基醇是令人惊讶的。而且，如上所述，在EP-B1-0751224的方法中，利用对映选择性酪氨酸脱羧酶对/3-羟基-o;-氨基酸进行脱羧仅能得到最高产率仅为50%的^-氨基醇。因此，组合上述两种方法得到的总产率高于上述两种方法相互独立进行时的产率是令人惊讶的。还令人惊讶的是，采用本发明的方法可以制备具有高e.e的/3-氨基醇。如上所述，在对映选择性苏氨酸醛羧酶的存在下，甘氨酸与各种醛进行反应制备/3-羟基-o;-氨基酸的方法中所制备的遂產^^^，物的比率接近1(Kimura等(1997)，J.Am.Chem.Soc.Vol199，11734-11742页)。因此，理论上，对形成的遂逸y3-羟基-a-氨基酸或对形成的^^^/3-羟基-G!-氨基酸进行非-/3选择性脱羧作用导致得到相应的/3-氨基醇的对映异构体的混合物，其中各对映异构体的比率也接近1。换句话说，可以预期到，通过组合Kimum等(1997)的酶催化制备/5-羟基-o;-氨基酸的方法与对&羟基-a-氨基酸进行脱羧的方法，将获得没有对映异构体过量或者对映异构体过量较低的]S-氨基醇。然而，正如在本实施例中所示，采用本发明的方法可以得到具有高e.e的/3氨基醇。而且，采用本发明的方法，可以获得高于50%的产率。本发明方法的其它优点例如原料易得且在商业上具有吸引力，不需化学步骤；可以在一锅中进行反应；不需分离/3-羟基-a-氨基酸中间体。从商业性和操作性的观点来看，这使得本发明的方法非常具有吸引力。在本发明的上下文中，"对映异构富集"意指，化合物的("-或CS)-对映异构体对映异构过量(e.e)。优选地，对映异构过量>60%，更优选>70%，甚至更优选>80%，具体>90%，更具体>95%，甚至更具体>98%，最具体>99%。在本发明的一个实施方式中，可以通过本领域已知的拆分过程进一步提高在本发明的方法中形成的对映异构富集的氨基醇的e.e。拆分过程是以获得对映异构富集的化合物为目标的分离对映异构体的过程。拆分过程的实例包括结晶诱导拆分、通过非对映异构盐的形成(经典拆分)或夹带(entminment)而进行的拆分、色谱分离方法(例如手性模拟移动床色谱)和酶促拆分。"甘氨酸盐"意指由氨基乙酸阴离子和阳离子组成的化合物。甘氨酸盐中，阳离子的实例包括碱金属盐，例如钠盐；四价N化合物，例如铵或四烷基铵，例如四丁基铵。优选地，所述醛具有式loR1^^^H(1)其中，R1代表可选被取代的(环)垸基、可选被取代的(环)烯基或可选被取代的炔基、可选被取代的芳基，或代表杂环，优选代表可选被取代的苯基。可选被取代的(环)垸基、可选被取代的(环)烯基或可选被取代的炔基优选具有1至20个C原子，更优选具有1至10个C原子(包括取代基的C原子)。烷基包括例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、辛基、癸基、异丙基、仲丁基、叔丁基、新戊基和异己基。环垸基包括例如环丙基、环丁基、环戊基和环己基。烯基包括例如乙烯基、烯丙基、异丙烯基。(环)烯基包括例如环己烯基和环戊二烯基。炔基包括例如乙炔基和丙炔基。可选被取代的芳基优选具有1至20个C原子，更优选具有1至10个C原子(包括取代基的C原子)。可选被取代的芳基例如包括苯基、萘基(naphtyl)和节基。可选被取代的杂环优选具有1至20个C原子，更优选具有1至10个C原子(包括取代基的C原子)。杂环包括例如可选被取代基的芳族杂环，例如吡啶-2-基、吡啶-3-基、嘧啶-2-基、呋喃-2-基、呋喃-3-基、噻吩-2_基、咪唑-2-基、咪唑-5-基；并且包括可选被取代的(部分)饱和杂环，例如吗啉-2-基、哌啶-2-基和哌啶-3-基。(环)垸基、(环)烯基、炔基、芳基和杂环可以未被取代或被取代，所述取代可以在一个或多个位置上进行取代。例如可以在邻位和/或间位和/或对位上对苯基进行取代。取代基例如包括垸基，例如具有1至4个C原子；芳基，例如具有3至10个C原子；卤素，例如F、Cl、Br、I;含硼基团，例如B(OH)2、B(CH3)2、B(OCH3)2;具有式Nl^ie的胺，其中W和ie各自独立地代表H、垸基、芳基、OH、烷氧基和代表已知的N-保护基团，例如甲酸基、乙酰基、苯甲酰基、苄基、苄氧基、羰基、烷氧基羰基(例如叔丁氧基羰基、芴-9-基-甲氧基羰基)、磺酰基(例如甲苯磺酰基)、或甲硅烷基(例如三甲基甲硅烷基或叔丁基二苯基甲硅烷基)；异氰酸酯；叠氮化物；异腈；氰基；OR4，其中W代表H、垸基、芳基或代表已知的O-保护基团，例如苄基、乙酰基、苯甲酰基、垸氧基羰基(fn^基屮基)、甲硅烷基、四氢吡喃-2-基、磺酰基(例如甲苯磺酰基)或代表磷酰基；(三取代)甲硅烷基，例如三甲基甲硅烷基或三苯基甲硅烷基；含磷基团，例如-P(R5)2、-P(R6)3+X、画P(O)(0R7)2、-P(=0)(R8)2，其中，R5、R6、R7和R8各自独立地代表垸基、芳基，其中X-代表阴离子，例如卤素；硝基；亚硝基；SR9，其中，W代表H、烷基或芳基；SSR1()，其中，R^代表H、烷基或芳基；磺酸(酯)或其盐，例如S02ONa、S02OCH3;SC^R11,其中，R"代表烷基、芳基或H;SOR12，其中，R^代表垸基、芳基或H;S02NR13R14，其中，R"和R"各自独立地代表烷基、芳基或H;SeR15，其中，R"代表烷基、芳基或H;S02C1;或杂环，例如哌啶-l-基、吗啉-4-基、苯并三唑-l-基、卩引哚-l-基、吡咯-l-基、咪唑-l-基。在本发明的方法中，甘氨酸与式1的醛进行反应将形成相应的对映异构富集的式2的/3-氨基醇其中，W如上所定义。推测该反应经由式(3)的iS-羟基-o;-氨基酸中间体<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>NH2(3)其中，W如上所定义进行，但不排除其它机理的可能性。优选地，所形成的对映异构富集的^-氨基醇为2-氨基-l-苯基乙醇、2-氨基-l-(4-羟基苯基)乙醇、2-氨基-l-(3-羟基苯基)乙醇、2-氨基-l-(3，4-二羟基苯基)乙醇、2-氨基-(4-氟苯基)乙醇、2-氨基-(3-氟苯基)乙醇、2-氨基-(2-氟苯基)乙醇、2-氨基-(3-氯苯基)乙醇。所形成的对映异构富集的^-氨基醇优选是其中W如上所定义的式(2)/3-氨基醇，更优选是其中Ri代表苯基、3-羟基苯基、4-羟基苯基、3,4-二羟基苯基、2,4-二羟基苯基、O,O，-亚甲基-3，4-二羟基苯基、3-(羟甲基)-4-羟苯基、2-氯苯基、3-氯苯基、4-氯苯基、2-氯-4-羟基苯基、4-甲氧基苯基、2-氟苯基、3-氟苯基、4-氟苯基、2-呋喃基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、环己基的式(2)3-氨基醇。在本发明的上下文中，"苏氨酸醛縮酶"意指具有苏氨酸醛羧酶活性的酶，其属于醛依赖性碳碳裂解酶(lyase)(EC4丄2)的组，优选属于EC4丄2.5或EC4丄2.25的酶分类。苏氨酸醛羧酶的活性被定义为催化P-羟基-Of-氨基酸可逆分裂成甘氨酸和相应醛的能力。苏氨酸醛縮酶有时也被称为苯基丝氨酸醛羧酶或/3-羟基天冬氨酸酯醛羧酶。苏氨酸醛羧酶实质上是普遍存在的酶，例如可以在如下细菌、古细菌、酵母和真菌，例如包括尸set/domowoy/wAV/a、尸.aen/giwosa、尸.ywor&scewce、jElsrAen.c/^aco//、Jerowowosyawdaez'、J^e厂mc^oga/wan力'ma、iSV/fcz'Zacterpo附ero少/、6rawc/^一z'ca、Co/潔〃z'a/w_yc//-e，/^eae禾口^cc/wram^ycascerev/w'ae中发现。优选地，使用来自假单孢菌(尸wt^omo"^)的物种(诸如P.j9W"Wa、尸.y7t/omsce"ce或尸.aen/gz'wwa)的苏氨酸醛縮酶。本领域技术人员知晓如何找到(最)适于将甘氨酸和特定醛相应地转化成所需/3-羟基-0;-氨基酸既而转化成所需/3-氨基醇的苏氨酸醛縮酶。更优选地，使用来自P.戶Wa的苏氨酸醛縮酶。最优选地，使用来自尸.；wg"NCIMB12565或尸.卢"&ATCC12633的苏氨酸醛縮酶。在本发明的上下文中，"脱羧酶"意指具有脱羧酶活性的酶。优选地，使用碳碳羰基裂解酶(lyase)(EC4丄1)作为脱羧酶。更优选地，脱羧酶是氨基酸脱羧酶，其属于芳族氨基酸脱羧酶(EC4丄1.28)或酪氨酸脱羧酶(EC4丄1.25)。在酪氨酸脱羧酶的生理反应中，诸如酪氨酸的芳族氨基酸被脱羧成芳族伯胺(诸如酪胺)和二氧化碳。酪氨酸脱羧酶例如可以在五"teracoccM、丄ac/o6acZ〃ws、尸ravW朋da、尸set^o附owos、_Fksw7'ww、Gz'Z6ere〃a、尸"nwe/z'wi/m或尸a/aver中找至廿。优选使用来自属于丄""o^"7/a/^目的细菌的酪氨酸脱羧酶。甚至更优选使用来自丄actoZac/〃wsZj尸ev&、五w/mcoccw51Az'rae、五她racoccws々ecafo或五wteracoccM/ae"'ww的酪氨酸脱羧酶。最优选使用来自五"teracoccw_/^ecafoV538、五她racoccws々ecafoJH2-2或五w&racoca/5々ecz'画DO的酪氨酸脱羧酶。本领域技术人员知晓如何找到(最)适于将/3-羟基-a-氨基酸转化成所需/3-氨基醇的酪氨酸脱羧酶。特别优选的是，具有序列[SEQIDNo.2]、[SEQIDNo.4]或[SEQIDNo.6]的脱羧酶及其同源物。编码脱羧酶[SEQIDNo.2]、[SEQIDNo.4]和[SEQIDNo.6]的核酸序列分别列在[SEQIDNo.l]、[SEQIDNo.3]或[SEQIDNo.5]中。同源物具体指与[SEQIDNo.2]、[SEQIDNo.4]和[SEQIDNo.6]的序列同源性为至少55%、优选至少65%、更优选至少70%、更优选至少75%、更优选至少80%、具体至少85%、更具体至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的脱羧酶。就本发明的目的而言，在序列比对研究中，利用ClustalW，版本1.82(http:〃www.ebi.ac.uk/clustalw)多序列比对，在默认设定下(矩阵Gonnet250;缺口开放10;末端缺口10;缺口延伸0.05;缺口距离8)来测定序列同源性。可以在谷氨酸酯脱羧酶(EC4丄1.15)和羟基谷氨酸酯脱羧酶(EC4丄1.16)的组中找到其它适宜将^-羟基-a-氨基酸转化成所需^-氨基醇的脱羧酶。这些脱羧酶例如可以在诸如Esc/^n'c/n'fl(Umbreit&Heneage，1953，J.Biol.Chem.201，15-20)的细菌中找到。本领域技术人员知晓如何找到(最)适于将i8-羟基-a-氨基酸转化成所需/3-氨基醇的酪氨酸脱羧酶。特别优选的是，具有序列[SEQIDNo.17]或[SEQIDNo.18]的脱羧酶及其同源物。同源物具体指与[SEQIDNo.17]或[SEQIDNo.18]的序列同源性为至少55%、优选至少65%、更优选至少70%、更优选至少75%、更优选至少80%、具体至少85%、更具体至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的脱羧酶。例如，苏氨酸醛縮酶和脱羧酶可以各自独立地以粗制酶、商购酶、由商购制品进一步纯化的酶、由酶源通过已知纯化方法的组合得到的酶的形式存在于天然或者通过基因修饰具有苏氨酸醛縮酶和/或脱羧酶活性的全细胞(可选被渗透和/或被固定的)中或者存在于具有上述活性的细胞的溶解产物中，其中所述苏氨酸醛縮酶和脱羧酶例如为分散液、乳液、溶液或固定形式。如果使用全细胞，那么该细胞优选具有苏氨酸醛縮酶和脱羧酶二者的活性。可以利用本领域技术人员已知的方法来增强全细胞中苏氨酸醛縮酶和/或脱羧酶的表达。本领域技术人员将清楚地认识到，在本发明的方法中还可以使用具有苏氨酸醛縮酶和/或脱羧酶活性的天然存在(野生型)酶的突变异种。野生型酶的突变异种例如可以通过如下制备采用本领域已知的诱变技术(随机诱变、定点诱变、定向进化、基因混排(shuffling)、融合蛋白，例如苏氨酸醛縮酶和脱羧酶的融合蛋白等)对编码野生型酶的DNA进行修饰，使得DNA编码至少一个氨基酸与所述野生型酶不同的酶；以及实现由此修饰的DNA在适当的(宿主)细胞中进行表达。苏氨酸醛縮酶和/或脱羧酶的突变异种可以具有改善的性质，例如具有改善的对底物的选择性和/或活性和/或稳定性禾P/或溶剂抗性和/或pH谱和/或温度谱。此外或可供选择地，为了增强编码野生型酶的DNA的表达，可以对其进行修饰。在本发明的上下文中，"对映选择性苏氨酸醛縮酶或对映选择性脱羧酶"意指，对相应于所用醛的P-羟基-a-氨基酸中间体的对映异构体的其中之一具有偏好的酶，例如，对相对于羧酸基团a位上的碳(例如连接氨基的碳)的L-构型或D-构型具有对映选择性的苏氨酸醛縮酶或脱羧酶。例如，本领域技术人员知晓对相对于羧酸基团的a碳的L-构型具有对映选择性的苏氨酸醛縮酶，以及对其D-构型具有选择性的苏氨酸醛縮酶。优选地，所述酶中至少一种的对映选择性为至少90%，更优选为至少95%，甚至更优选为至少98%，最优选为至少99%。在本发明的上下文中，"具有90%对映选择性的苏氨酸醛縮酶"意指，甘氨酸和醛被转化成，相应于所用醛而言90%为^羟基-仏氨基酸中间体的一种对映异构体(例如/3-羟基-L-a-氨基酸)而10%为相应的/3-羟基-ce-氨基酸中间体的另一种对映异构体(例如0-羟基-D-a-氨基酸)，这相当于]8-羟基-a-氨基酸的一种对映异构体(例如/3-羟基-L-o;-氨基酸)的对映异构过量为80%。优选地，如果苏氨酸醛縮酶和脱羧酶二者都具有对映选择性，那么苏氨酸醛縮酶和脱羧酶二者对于/3-羟基-仏氨基酸的同种对映异构体都具有对映选择性。苏氨酸醛縮酶和/或脱羧酶的对映选择性越高，苏氨酸醛縮酶和脱羧酶对于/3-羟基-0!-氨基酸的同种对映异构体具有对映选择性就越优选。在本发明的上下文中，"]8-选择性"意指，苏氨酸醛縮酶或脱羧酶对/3-羟基-a-氨基酸的/3-碳原子的一个或另一个构型具有偏好(&选择)。换句或说，"/3-选择"被定义为"对^-羟基-a-氨基酸的/3-碳原子的构型具有选择性"。"^-碳"意指，相对于羧酸基团而言在/3-位上的碳原子，即连接羟基的碳。优选地，所述酶中至少一种的/3-选择性为至少50%，更优选为至少60%，甚至更优选为至少70%,具体为至少70%,具体为80%，更具体为至少90%，甚至更具体为至少95%，最具体为至少99%。"具有90%/5-选择性的苏氨基醛縮酶"意指，通过苏氨酸醛縮酶，甘氨酸和醛转化成，90%为^羟基-a-氨基酸的一种立体异构体(例如塾羟基-a-氨基酸)而10%为所述i3-羟基-of-氨基酸的另一种立体异构体ii(例如^^:星^羟基-D-o;-氨基酸)。因而，优选形成的立体异构体(例如3-遂逸义羟基-o;-氨基酸)的非对映异构体过量(d.e)为80%。"具有90%^选择性的脱羧酶"意指，如果^羟基-a-氨基酸的两种立体异构体以等量形式存在，那么在总转化率为50%时，脱羧作用使所述/3-羟基-a-氨基酸的一种立体异构体(例如/3-^^义羟基-ce-氨基酸)的90%发生了转化，而使另一种立体异构体(例如/3-多星义羟基-o;-氨基酸)的10%发生了转化。优选地，如果苏氨酸醛縮酶和脱羧酶二者都具有]S-选择性，那么苏氨酸醛縮酶和脱羧酶二者对于i3-羟基-o;-氨基酸的/3-碳的同种构型都具有卩-选择性。苏氨酸酸縮酶和/或脱羧酶的/3-选择性越高，苏氨酸醛縮酶和脱羧酶对于同种P-羟基-o;-氨基酸具有iS-选择性就越优选。在本发明的一种优选实施方式中，至少苏氨酸醛縮酶或脱羧酶具有对映选择性。依据选定的酶和选定的醛对反应条件进行选择。本领域技术人员知晓如何对诸如温度、pH、浓度、溶剂的使用等各种参数进行优化。温度和pH在本发明的方法中并不非常关键。然而，本方法优选在介于4和10之间的pH下实施。具体地，转化在4.5及以上的pH下和6.5及以下的pH下实施。温度优选选用为在0至80°C。温度优选高于5°C，更优选高于1(TC。温度优选低于5(TC，更优选低于39'C。适用于本发明方法的溶剂包括水；水以及与水可混溶的有机溶剂的单相混合物，所述与水可混溶的有机溶剂例如为与水可混溶的醇(例如甲醇)、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯垸酮、乙腈；或水以及不可混溶的有机溶剂的两相混合物，所述不可混溶的有机溶剂例如为烃、醚等；或所谓的离子液体，例如如六氟磷酸、四氟硼酸或三氟甲磺酸的酸的1,3-二烷基咪唑鑰盐或N-烷基吡啶鐵盐或采用(CF3S02)2N—作为阴离子配对物形成的上述鑰盐。在本发明的方法中，使用水和二甲基亚砜(DMSO)的单相混合物，例如DMSO的含量优选为1至50%v/v，更优选为5至30%v/v，最优选为10至20y。v/v的水。此外，可以在乳液体系中进行本发明的方法，诸如粗滴乳液(macro-emulsion)、或微乳液、以及含有有机相(具有醛底物)、水相(通常为甘氨酸或甘氨酸盐，具有苏氨酸醛縮酶和脱羧酶)和适当表面活性剂(非离子、阳离子或阴离子)的双连续体系等。就本发明的目的而言，乳液体系被定义为水、表面活性剂和油相组成的三元混合物，所述油相可以为脂族烷烃。可用在乳液中作为油相的脂族烷烃的实例包括环己垸、异辛烷、十四烷烃、十六烷烃、十八烷烃、角鲨烯。表面活性剂可以是任何非离子、阳离子或阴离子表面活性剂，例如TritonX-100、十二烷基硫酸钠、AOT、CTAB、Tween-80、Tween-20、Span-80等。水包油(0/W)乳液例如可以通过剧烈搅拌形成，剧烈搅拌导致内表面增大，因而有利于在各相之间传质。特别感兴趣的乳液是微乳液，其是热力学稳定的，且具有在纳米范围内的区域尺寸(domainsize)(参见例如Clap6s等的Chem.Eur.J.2005，11，1392-1401和Schwuger等的Chem.Rev.1995，95，849-864)。甘氨酸或其盐与醛的摩尔比原则上并不重要。优选地，甘氨酸或其盐与醛的摩尔比>1，例如可以为1000:1，优选为100:1，更优选为10:1。添加各种试剂(甘氨酸或其盐和醛)和酶(脱羧酶和苏氨酸醛縮酶)的次序原则上并不重要。例如，本方法可以分批进行(例如一次性添加各种试剂和酶)或者可以以补料分批模式(fed-batchmode)进行(通常加入一种或两种试剂，但也可以加入酶)。取出反应过程中形成的]8-氨基醇并且/或者重复使用苏氨酸醛縮酶和/或重复使用脱羧酶是有利的。这可以在批次间进行，当然也可以连续进行。优选地，将辅助因子(cofactor)加入反应中以提高苏氨酸醛縮酶和/或脱羧酶的酶催化活性。本领域技术人员已知辅助因子的实例，其包括吡哆醛-5-磷酸酯、辅酶B12、黄素腺嘌呤二核苷酸、磷酸泛酰巯基乙胺(phosphopantheine)、硫胺、S-腺苷甲硫氨酸、生物素、盐(例如Mg2+、Mn2+、Na+、K+和Cl—的盐)。例如，吡哆醛-5-磷酸酯可以例如以0.001至10mM的浓度，优选以0.01至1mM的浓度，更优选以0.1至0.5mM的浓度加入本方法中。根据所选定的酶对辅助因子进行选择，例如可以通过添加吡哆醛-5-磷酸酯来增强得自五Weracoc"'的酪氨酸脱羧酶和得自P.;^"^的苏氨酸醛縮酶的酶催化活性。苏氨酸醛縮酶和/或脱羧酶的用量原则上并不重要。苏氨酸醛縮酶和/或脱羧酶的最佳用量依赖于所用底物醛，本领域技术人员通过常规实验可以容易地确定。所用甘氨酸或其盐的浓度原则上并不重要。所用甘氨酸或其盐的浓度优选为0.1至4M，更优选为0.5至3M，最优选为1.0至2.5M。醛的浓度原则上并不重要。所用醛的浓度优选为1至1000mM，更优选为10至500mM，最优选为20至100mM。通过本发明的方法得到的产物可以是药品，例如去甲肾上腺素(Noradrenalin)或去甲苯福林(Norfenefrine)。另一方面，本发明涉及一种将在权利要求1至12任意一项所述方法中形成的]8-氨基醇进一步转化成活性药物成分的方法。例如，根据本发明的方法可以进一步包括，将通过本发明的方法得到的产物的氨基转化成被叔丁基保护的氨基。例如，以这种方式得到levabuterol。根据本发明的方法还可以进一步包括，将通过本发明的方法得到的产物的氨基转化成被异丙基保护的氨基。例如，以这种方法得到索他洛尔(Sotalol)。现在通过以下实施例对本发明进行进一步阐述，但本发明并不局限于此。实施例OHOH,COOH,COOHTANH2TDCNH2NH2(1)(2)(3)示意图(I)示意图(I)意欲说明实施例。示意图(O并非意欲以任何方式限制本发明。在示意图(I)中，在苏氨酸醛縮酶(TA)的存在下，其中Rl如上所述的式(1)醛与甘氨酸进行反应，从而形成了相应的式(2)P-羟基-a-氨基酸中间体，然后该中间体在脱羧酶(TDC)的存在下进一步转化成相应的式(3)/3-氨基醇。通过使用/3-选择性苏氨酸醛縮酶或/3-选择性脱羧酶，式(3)的/5-氨基醇是对映异构富集的。L-酪氨酸脱羧酶基因的克隆利用Gateway克隆系统(Invitrogen)，对得自两种五"teracocow物种的可能编码三种L-酪氨酸脱羧酶(TyrDC)的三条开放读码框(ORF，openreadingframe)进行克隆编码具有[SEQIDNo.2]所示的氨基酸序列的酪氨酸脱羧酶(EfaTyrDC)的五Wmcocct^/aecafoV583TyrD基因[SEQIDNo.1]以及与五./aecafoV583tyrD基因具有高同源性的另外两条ORF，上述三条开放读码框在五"/eracocc^/aec/wnDO的基因组序列中被鉴定出来。E/aec/wmDOtyrDl基因[SEQIDNo.3]与来自五./aecatoV583的tryD的DNA序列[SEQIDNo.1]78%相同，相应的EfiTyrDC-1的氨基酸序列[SEQIDNo.4]与EfaTyrDC的氨基酸序列[SEQIDNo.2]83%相同。五./ae"'wmDOtyrD2基因[SEQIDNo.5]与得自五./aecafoV583的tyrD的DNA序列[SEQIDNo.1]62%相同，相应的EfiTyrDC-2的氨基酸序列[SEQIDNo.6]与EfaTyrDC的氨基酸序列[SEQIDNo.2]59%相同。来自五./^c^mDO的两种L-酪氨酸脱羧酶基因共享在DNA水平[SEQIDNo.3+5]上的63。/。同一性和相应的氨基酸序列[SEQIDNo.4+6]的59%同一性。针对三种L-酪氨酸脱羧酶基因[SEQIDNo.1，3+5]，开发了含有attB位点、适于通过同源重组进行Gateway克隆(Invitrogen)的六条基因特异性引物[SEQIDNo.7-12]被用于发展，并在Invitrogen(UV)对其加以合成。这些引物分别在至少3个独立的PCR反应中用于各个基因，其中先前分离的五.々ecatoV583和/aedtmzDO的基因组DNA分别作为模板。ProofreadingSupermixHiFiDNA聚合酶(Invitrogen)被用于根据供应商的程序来扩增tyrD和tyrDl，其中来自五./aecafoV583的tyrD的退火温度为48°C，得自五./aec&mDO的tyrDl的退火温度为44°C。为了扩增得自五./aec^wDO的tyrD2，在54。C的退火温度下使用ProofreadingPlatinumPfeDNA聚合酶(Invitrogen)。对于所有的PCR而言，仅得到预期尺寸为约1900个碱基对(bp)的特异性扩增产物。分别将tyrD、tyrDl和tyrD2扩增产物合并并纯化(QiaQuickPCR纯化试剂盒，Qiagen)。在GatewayBP克隆反应中，使用经纯化的PCR产物，以将目标基因插入中间克隆载体pDONR201(Invitrogen)，从而产生各进入载体(entryvector)pENTR-tyrD、pENTR-tyrDl禾QpENTR-tyrD2。在感受态EscAen'c/n'aco//DH5o;细胞转化后，将所得转化体合并，并分离总质粒DNA(质粒DNA提取微型试剂盒，Qiagen)。通过用对各种基因具有特异性的限制性酶进行限制性分析，来分析pENTR-tyrD、pENTR-tyrDl和pENTR-tyrD2的合并质粒制剂。由限制性模式，可以推断出^9%的汇合质粒制剂包含预计的片段。然后，将质粒pENTR-tyrD、pENTR-tyrDl和pENTR-tyrD2分别用于具有质粒pDEST14(Invitrogen)的GatewayLR克隆反应中，从而获得表达载体pDEST14-tyrD—Efa、pDEST14-tyrD1—Efi和pDEST14-tyrD2—Efi。采用LR反应对五.TOP10进行转化分别产生数百个单个菌落。通过限制性分析来测试每种基因的三种克隆体，发现它们分别具有预期的限制性模式。L-酪氨酸脱羧酶基因在^c/m'c/n'aco/Z中的异源表达经分离的pDEST14表达质粒被用于转化化学感受态的EBL21(DE)pLysS细胞，随后将其置于选择性Luria-Bertani培养基(LB加上100pg/ml羧苄青霉素和35|ag/ml氯霉素)上。对于来自两种^Vzferacoccw物种的三种L-酪氨酸脱羧酶基因中的每一个而言，使用三至四个单一的菌落接种50ml预培养液(LB加上100pg/ml羧苄青霉素和35ILig/ml氯霉素)。将预培养液在28'C下、以每分钟180转(rpm)在转动摇床中培养过夜。在这些预培养液中，接种三种11LB培养液(补充100pg/ml羧苄青霉素和35pg/ml氯霉素)，以使细胞密度约为OD62Q=0.05。然后，将这些表达培养液在180rpm、在28。C下在转动摇床中进行培养。通过将1mM异丙基^-D-硫代-半乳糖苷(IPTG)加入各种培养液中，从而在对数增长期的中部(OD62o约为0.6)诱导三种目标tyrD基因的表达。在同样的条件下继续培养4小时。随后，通过离心(在5000Xg，4"下IO分钟)收获细胞，并将其分别重新悬浮于pH为6.0、含有100pM的吡哆醛5'-磷酸酯(PLP)和lmM二硫苏糖醇(DTT)的50mL柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液(0.0371^柠檬酸+0.126MNa2HP04)中。在-85。C下冷冻细胞悬浮液。为了裂解细胞以及得到无细胞提取物，将悬浮液在3(TC的水浴中解冻，随后在冰上孵育l个小时并离心(在39000Xg，4。C下30分钟)，以除去细胞残骸。将上层清液转移到新的烧瓶中(无细胞提取物)。采用DL-苏逸y-苯基丝氨酸进行酪氨酸脱羧酶活性试验采用DL-;產y-苯基丝氨酸作为底物对含有过表达的来自五./^c"fo的V583TryDC、来自五./^c/wmDO的TyrDC-l或TyrDC-2的无细胞提取物中的酪氨酸脱羧酶的活性进行测定。将0.9ml的100mM的DL-i^^苯基丝氨酸(Sigma-Aldrich)溶液(处于pH为5.5、含有100PLP禾口1mMDTT的柠檬酸/磷酸盐缓冲液(0.043M柠檬酸+0.114MNa2HP04)中)与0.1ml无细胞提取物在室温(25°C)下一起孵育。以不变的时间间隔，取出50inl样品并用950pl的O.lMHC104(水溶液，pH1)终止。通过HPLC在CrownetherCr(+)柱子(Daicel)上对L-;至义苯基丝氨酸的减少和(R)-2-氨基-l-苯基-乙醇的形成进行定量，其中使用商购DL-遂逸义苯基丝氨酸、(R)-2-氨基-l-苯基-乙醇和(S)-2-氨基-l-苯基-乙醇(Sigma-Aldrich)作为参照物，使用206nm的波长以探测底物和产物。1U的酪氨酸脱羧酶活性被定义为25。C下，在pH为5.5、含有100PLP禾n1mMDTT的柠檬酸/磷酸盐缓冲液(0.043M柠檬酸+0.114MNa2HP04)中，1|imol的DL-;產义苯基丝氨酸在1分钟内脱羧成2-氨基-l-苯基-乙醇所需酶的对于含有过表达的来自五"/eracoccws々ecafo的V583TryDC、来自五./aec/wmDO的TyrDC-l的^cAenW^co/Z无细胞提取物，在无细胞提取物中得到150-160U/g全蛋白的比活度。得自五./aec&mDO的TyrDC-2具有约10U/g全蛋白的比活度。HPLC分析进一步表明，所有三种TyrDc排他性地对^產力苯基丝氨酸的L型进行脱羧，仅对映选择性地形成")-2-氨基-1-苯基-乙醇。17由尸扁fitomo薦赠油NCIMB12565克隆苏氨酸醛縮酶由尸w^fomo"as/M^/aNCIMB12565菌株的基因组DNA出发，利用基因特异性引物，通过PCR扩增，得到编码低特异性L-苏氨酸醛縮酶(L-TA)(如[SEQIDNo.14]所示)的Ita基因[SEQIDNo.13]。PCR反应在50ml的Pfx扩链缓冲液(Invitrogen)、0.3mM的dNTP、1mM的MgS04、15pmol的各种引物、1的基因组DNA和1.25单位的保真铂尸ADNA聚合酶(Invitrogen)中实施。温度循环如下(1)96°C5分钟；(2)96°C30秒、46.7°C30秒、68°C1.5分钟，共5个循环；(3)96。C30秒、51.7。C30秒、68'C1.5分钟，共25个循环。正向引物包含ARG起始密码子，反向引物包含TCA终止密码子。引入&m5/限制位点，以获得具有Wco/和^o/相容突出端的PCR片段。采用^fomS/消化扩增的片段，并将其连接到pBAD/Myc-HisC载体上，接着采用7Vco/和Wo/消化。所得到的构建体pBAD/Myc-HisC—LTA_ppl2565被用于转化五.co//TOP10细胞。Ita基因在Escherichiacoli中的异源表达在28"C下，在含有100mg/ml羧苄青霉素的50mlLuria-Bertani培养基中，对含有pBAD/Myc-HisC—LTA_ppl2565的重组co/z'细胞进行过夜预培养。预培养物被用于接种11含有100mg/ml羧苄青霉素的同种培养基，并在200rpm下摇动的同时在28'C下生长。在OD,为0.5-1时，通过添加0.002%(w/v)L-树胶醛糖诱导细胞。在200rpm下摇动的同时，在室温(20-22°C)下对细胞培养整夜。通过在12500Xg下离心15分钟来收获细胞，并采用含有10mMPLP和10mMDTT的50mMTrisHCl缓冲液(pH7.5)洗涤两次。将细胞重新悬浮于40ml的同种缓冲液中后，在4。C下通过在MSESoniprep中超声破碎细胞12分钟(最大振幅10秒开/10秒关)。在4'C下，通过在20000Xg下离心20分钟除去细胞残骸。将无细胞提取物的小份试样储存于-2(TC下以备用。采用L-苏氨酸进行苏氨酸醛縮酶试验在室温下通过NADH消耗以分光光度法(spectrophotometrical)测定具有过表达的苏氨酸醛縮酶的无细胞提取物的活性。将50^L的CFE(或其适当稀释液)在3ml玻璃比色杯中(光程长度lcm)稀释成2950pL含有100mMHEPES缓冲液(pH8)、50吡眵醛5-磷酸酯、200|uMNADH、30U的酵母醇脱氢酶(Sigma-Aldrich)和50mML-苏氨酸的缓冲液。在这个试验中，通过L-苏氨酸醛縮酶的作用，使L-苏氨酸转化成乙醛和甘氨酸。接着通过酵母醇脱氢酶将乙醛还原成乙醇，这与等摩尔量的NADH消耗的氧化作用相关联。NADH消耗作为Perkin-ElmerLambda20分光光度计中吸光度在340rmi下的降低被测定。1U的苏氨酸醛縮酶活性被定义为室温下，在pH为8、含有50pM吡哆醛5'-磷酸酯、200pMNADH、30U的酵母醇脱氢酶(Sigma-Aldrich)和50mML-苏氨酸的100mMHEPES缓冲液中，1pmol的L-苏氨酸在1分钟内分裂成甘氨酸和乙醛所必需的酶的用量。对于含有得自尸化wt/omo"w;w^flNCIMB12565的过表达苏氨酸醛縮酶的&c/^hc/^co/Z无细胞提取物而言，采用L-苏氨酸作为底物时，在无细胞提取物中得到18U/g全蛋白的比活度。采用D-苏氨酸(Sigma-Aldrich)时，未获得转化。采用DL-苏《f苯基丝氨酸进行苏氨酸醛縮酶试验为了比较在双酶/一锅反应中所用苏氨酸醛縮酶和酪氨酸脱羧酶的用量，使用另一个采用DL-多產〃-苯基丝氨酸进行的苏氨酸醛縮酶的活度试验。于室温下在Perkin-ElmerLambda20分光光度计中的1ml石英比色杯中，将990inl的100mMDL-^1义苯基丝氨酸(Sigma-Aldrich)溶液(在pH为5.5、含有100PLP禾n1mMDTT的柠檬酸/磷酸盐缓冲液中)与10pi含有得自尸.NCIMB12565的过表达苏氨酸醛縮酶的无细胞提取物一起孵育。通过苏氨酸醛縮酶使DL-苏型-苯基丝氨酸转化成甘氨酸和苯甲醛的量被定量为使用苯甲醛的摩尔吸光系数6279=1.4cmV^imol吸光度在279nm下的增加。采用底物DL-;1义苯基丝氨酸，1单位苏氨酸醛縮酶的活性被定义为在上述条件下，1pmol的这种底物在l分钟内转化成苯甲醛和甘氨酸所必需的酶的用量。对于含有得自i^eMJomowM戶^/aNCIMB12565的过表达苏氨酸醛縮酶的五^Aen'cA^co/z'无细胞提取物而言，采用DL-苏型-苯基丝氨酸作为底物，pH5.5下，在无细胞提取物中得到10U/mg全蛋白的比活度。测定溶液中的蛋白质浓度如Bradford在^"a/.所oc/^附.72，248-254(1976)中所述，利用改进的蛋白质-染料结合方法测定溶液(例如无细胞提取物)中的蛋白质浓度。实施例l-W)-2-氨基-l-苯基-乙醇的酶催化合成为了合成对映异构富集的CR)-2-氨基-l-苯基-乙醇(R-APE)，将0.106g苯甲醛溶于2.3ml二甲基亚砜(DMSO)中，并与3.75g甘氨酸以及175U得自尸.，ri^zNCIMB12565的苏氨酸醛縮酶(对DL-苏型-苯基丝氨酸进行活性试验)禾B22.5U得自￡>2teracoca^/aeczY/mDO的TyrDC-l(酪氨酸脱羧酶-l)(对DL-遂產义苯基丝氨酸进行活性试验)在pH为6.0的柠檬酸/磷酸盐缓冲液(0.037]^1柠檬酸+0.126MNa2HP04)中进行混合。在室温下搅拌的同时，将混合物在50ml圆底烧瓶中进行培养。在不同的时间点，取出50nl样品，通过添加950n10.1MHC104(水溶液，pHl)进行淬灭，并在DaicelCrownetherCr(+)柱子上对对映异构富集的苯基丝氨酸和2-氨基-l-苯基-乙醇(APE)的形成进行分析，其中采用DL-茶塾苯基丝氨酸、DL-恭舉苯基丝氨酸、的-2-氨基-l-苯基-乙醇和0S)-2-氨基-l-苯基-乙醇作为参照物，采用UV探测仪在206nm下分析。这个时间过程实验的HPLC分析的结果列在表1中。这些结果表明，尽管苏氨酸醛縮酶反应的最大非对映异构过量(d.e.)仅为25%，但是与TyrDC反应联合导致产物(巧-APE的对映异构过量(e.e.)超过60%。而且，明显超过了经典动力学拆分的最高产率50%。表1:苯甲醛和甘氨酸通过苏氨酸醛縮酶和酪氨酸脱羧酶向苯基丝氨酸中间体和2-氨基-l-苯基-乙醇产物的转化。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>[h]基-丝氨酸基丝氨酸[mM][mM](R)-APE[%]苏型/赤型[mM][%][%]000.20.2000.58.65.10.20025116.010.70.50.174120178.98.215.03.761374217.06.716.94.062422255.75.718.54.4624608900.324.66.161619700.324.56.16061实施例2D-去甲肾上腺素的酶促合成为了合成对映异构富集的D-去甲肾上腺素(=(S)-2-氨基-l-(3,4-二羟基-)苯基-乙醇)，将0.138g苯甲醛溶于2.3ml二甲基亚砜(DMSO)中，并与3.75g甘氨酸以及175U得自尸.NCIMB12565的苏氨酸醛縮酶(对DL-#—星义苯基丝氨酸进行活性试验)和43.8U得自五wterococc^/aecz'wmDO的TyrDC-l(对DL-^星"-苯基丝氨酸进行活性试验)在pH为6.0的柠檬酸/磷酸盐缓冲液(0.037M柠檬酸+0.126MNa2HP04)中进行混合。在室温下搅拌的同时，将混合物在50ml圆底烧瓶中进行孵育。在不同的时间点，取出50)il样品，通过添加950plO.lMHC104(水溶液，pH1)进行淬火，并在DaicelCrownetherCr(+)柱子上对3,4-二羟基-苯甲醛的减少和对映异构富集的去甲肾上腺素的形成进行分析，其中采用UV探测仪在206nm下分析。采用商购DL-去甲肾上腺素和L-去甲肾上腺素(Sigma-Aldrich)作为参照物，测定所制成的去甲肾上腺素的构型。这个时间过程实验的HPLC分析的结果列在表2中。表2:3，4-二羟基-苯甲醛和甘氨酸通过苏氨酸醛縮酶和酪氨酸脱羧酶向去甲肾上腺素的转化。c.e.时间(7)-去甲肾上CS)-去甲肾(5)-去甲肾上3,4-二羟基-转化率腺素[mM]上腺素[mM]腺素[%]苯甲醛[mM][%]00.010.17141.400.50.010.18240.1310.250.88138.57171.3111.88027.234211.6715.38024.541251,9217.68021.349894.0433.9793.691<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>实施例3(5V章胺的酶促合成为了合成对映异构富集的(S)-章胺(=(S)-2-氨基-l-(4-羟基-)苯基-乙醇)，将0.977g4-羟基-苯甲醛溶于16ml二甲基亚砜(DMSO)中，并与30g甘氨酸以及1400U得自尸.NCIMB12565的苏氨酸醛縮酶(对DL-界塞义苯基丝氨酸进行活性试验)和40U得自五wteracoccus/ae"'t/mDO的TyrDC-l(对DL-多逸义苯基丝氨酸进行活性试验)在pH为6.0的柠檬酸/磷酸盐缓冲液(0.037厘柠檬酸+0.126MNa2HP04)中进行混合。在室温下搅拌的同时，将混合物在250ml圆底烧瓶中进行培养。在不同的时间点，取出50jiil样品，通过添加950julO.lMHC104(水溶液，pHl)进行淬灭，并在DaicelCrownetherCr(+)柱子上对对映异构富集的章胺的形成进行分析，其中采用(^S)-章胺(Sigma-Aldrich)作为参照物，采用UV探测仪在206nm下分析。这个时间过程实验的HPLC分析的结果列在表3中。表3:4-羟基-苯甲醛和甘氨酸通过苏氨酸醛縮酶和酪氨酸脱羧酶向章胺的转化。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>将反应混合物酸化至pH为1-2，并将沉淀的蛋白质通过离心除去。在滴定至pH3时，应用超滤(Amicon8050stirredcell,YM-10隔膜，Millipore)。超滤液在真空下被浓缩至0.11，加入丙酮，并将混合物在-20'C下储存1小时。除去沉淀的甘氨酸，并将滤液浓縮至体积为40ml。采用水性NaOH(30%)将pH调节至10.5后，将溶液在真空、60。C下蒸发，留下的液体残余物采用乙酸乙酯进行处理。滤出沉淀的固体，并将滤液再次在真空下蒸发。剩余的液体通过柱色谱在采用比率为75/20/5(v/v/v)的二氯甲垸/甲醇/25M水性NH3作为洗脱液的50g硅土上进行纯化。汇合含有纯产物的级分，并蒸发以得到574mg(47%)固体(6)-章胺，通过NMR和HPLC分析证实为与可靠样品相同。在Perkin-Elmer241偏光计上测定的产物的旋光度为[a]D20=+27.7(c=0.55，水)。报道的(A)-章胺的旋光度为[a]D20=+37.4(c=0.1，水)(7WraAW/w2^s少wm^7，2002，Vol.13，1209-1217页)。这相当于此处合成的(5)-章胺的e.e.为74%，其与通过手性HPLC分析测定的e.e.值81%一致。以下列出了(5)-章胺的NMR数据力-NMR(300MHz,D20/DC1，1，4-二氧杂环己烷作为内标(3.75ppm)):57.3(m，2H),6.95(m,2H),4.96(dd,1H),3.20-3.33(m,2H)。13C-NMR(75MHz，D20/DC1，1,4-二氧杂环己烷作为内标(67.2ppm)):5156.4,132.0，128.4,116.3,69.9,45.9。实施例4DL-^:星"-苯基丝氨酸的转化根据EP0220923中所述的过程合成外消旋DL-^^义苯基丝氨酸。DL-^^义苯基丝氨酸分别以9mM和5mM的浓度下与0.06U得自五./aec&mDO的TyrDC-l或0.18U得自五./aeozfcV583的TyrDC—起孵育，总体积为1ml。该反应在25"C下孵育。在反应过程中取出50pl样品，通过添加950fxl0.1MHC104(水溶液，pH1)进行淬火，并在DaicelCrownetherCr(+)柱子上对对映异构富集的苯基丝氨酸和2-氨基-l-苯基乙醇(APE)的形成进行分析，其中采用DL-^差y-苯基丝氨酸、DL-赤星义苯基丝氨酸、("-2-氨基-1-苯基-乙醇和(5>2-氨基-1-苯基-乙醇作为参照物，采用UV探测仪在206nm下分析。HPLC分析的结果列在表4中。在任何样品中未能探测到(R)-2-氨基-l-苯基-乙醇或D-或L-遂產^苯基丝氨酸(探测极限《0.004mM)。D-^^义苯基丝氨酸的浓度保持恒定，而L-^逸义苯基丝氨酸随着时间减少，这表明TyrDC对于a-位氨基具有对映选择性。表4:通过EfaTyrDC和EfiTyrDC-l转化DL-赤型-苯基丝氨酸转化率DL-赤型-苯基丝EfaTyrDC氨酸[%]EfiTyrDC-1d.e.D-^逸^苯基丝EfaTyrDC氨酸[%]EfiTyrDC陽15mM，24h后47.644.990.881.65mM，42h后49.749.598.898.09mM，24h后45.441.883.271.69mM，42h后49.748.798.795.0实施例5采用TvrDC和未采用TyrDC的3,4-二经基-苯甲醛的转化将20pl的0.5-1.0M3,4-二羟基苯甲醛(3,4-OH-BA)在DMSO中的溶液加入80pl的pH为6.0、含有O.lmMPLP和2.5M甘氨酸的0.25M磷酸钠缓冲液中。通过分别添加0.6U得自尸.jw/WaNCIMB12565的苏氨酸醛縮酶(在DL-多3t-苯基丝氨酸上进行试验)和0.4U得自五./aecatoV583的酪氨酸脱羧酶或0.65U得自E/^dwmDO的酪氨酸脱羧酶(在DL-多^e-苯基丝氨酸上进行试验)引发反应。平行地，不具有酪氨酸脱羧酶的反应被设定为对照。所有反应混合物(总体积0.2ml)在室温下搅拌48小时。在反应过程中取出25pl样品，通过添加425p10.1MHC104(水溶液，pH1)进行淬灭，并在DaicelCrownetherCr(+)柱子上对3，4-二羟基-苯甲醛的减少以及3,4-二羟基-苯基丝氨酸G,4-OH-PS)和对映异构富集的去甲肾上腺素的形成进行分析，其中采用UV探测仪在206nm下分析。采用商购DL-去甲肾上腺素和L-去甲肾上腺素(Sigma-Aldrich)作为参照物，来测定所制成去甲肾上腺素的构型。这个时间过程实验的HPLC分析的结果列在表5中。结果表明，不具有酪氨酸脱羧酶的反应中，原料3,4-二羟基-苯甲醛的转化率非常低，且形成低^-选择性的3,4-二羟基-苯基丝氨酸，这导致L-^^/_3,4-二羟基-苯基丝氨酸的d.e.低于20%。与此相反，在具有酪氨酸脱羧酶活性的反应中，原料3，4-二羟基-苯甲醛的转化率明显更高。当添加酪24氨酸脱羧酶时，获得的几乎定量的转化率大于50%，甚至高达92%。而且，^-选择性明显由低于20%改善至约80%，这通过在含有酪氨酸脱羧酶的反应中D-去甲肾上腺素的e.e.值为78至84%所反映出来。表5:通过苏氨酸醛縮酶(添加和未添加TyrDC)转化3,4-二羟基-苯甲醛。n.d.:不可领!j;n.a.:不适用<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>以上结果表明，本发明的方法的优点在于，具体地，当在本发明的方法中使用酪氨酸脱羧酶转化芳族醛时，可以得到的对映异构纯产物的产率高于50%。实施例6-备选的底物(被取代的式(1)芳族醛)将20pi的0.25-0.5M醛在DMSO中的溶液加入0.15ml的pH为6.0、含有0.13mMPLP和1.27M甘氨酸的0.27M磷酸钠缓冲液中。通过添加10pl得自尸.戸WaNCIMB12565的苏氨酸醛縮酶(无细胞提取物；59U/ml，在DL-^^C-苯基丝氨酸上进行试验)和20|ul得自五./aecafoV583的酪氨酸脱羧酶(无细胞提取物；1.8U/ml，在^C-苯基丝氨酸上进行试验)引发反应。将该溶液在室温下搅拌1-3天，通过薄层色谱在硅石涂布的玻璃板上监测相应的取代苯基丝氨酸(式(3))和/3-氨基醇(式(2))的形成。Rf值j8-氨基醇的Rf=0.6-0.7，取代苯基丝氨酸的Rf=0.2-0.3，甘氨酸的Rf:0(洗脱液二氯甲垸/甲醇/25%水性氨75/20/5(v/v/v);茚三酮染色)。2-氟苯甲醛、3-氟苯甲醛、4-氟苯甲醛、2-氯苯甲醛、3-氯苯甲醛、4-氯苯甲醛、3-溴苯甲醛、4-溴苯甲醛、3-甲基苯甲醛、4-甲基苯甲醛、3-羟基苯甲醛、3-甲氧基苯甲醛、3-硝基苯甲醛、3,4-(亚甲基二氧)苯甲醛、2-糠醛、吡啶-2-甲醛、吡啶-3-甲醛、吡啶-4-甲醛和六氢苯甲醛通过丝氨酸醛縮酶和酪氨酸脱羧酶转化成相应的^-羟基-o;-氨基酸中间体和相应的/3-氨基醇。实施例7L-去甲苯福林的酶催化合成为了合成对映异构富集的L-去甲苯福林(=(i)-2-氨基-l-(3-羟基-)苯基-甲醇)，将O.lM3-羟基-苯甲醛与lM甘氨酸连同38U得自尸.；M^/aNCIMB12565(在DL-;產、苯基丝氨酸上进行活性试验)的苏氨酸醛縮酶和0.4U得自E"&racoccws/aecflfoV583(在DL-苏型-苯基丝氨酸进行活性试验)的TyrDC在pH为5.5、含有50pM吡哆醛5'-磷酸酯的50mMKH2P04缓冲液中进行反应，总体积为1ml。在搅拌的同时在室温下(25°C)对该混合物进行赋育。在DaicelCrownetherCr(+)柱子上对对映异构富集的去甲苯福林形成的反应进行分析，其中采用商品DL-去甲苯福林(Sigma)作为参照物，采用UV探测仪在210nm下分析。24小时后，所提供的3-羟基苯甲醛中的76%被转化成对映异构富集的L-去甲苯福林，其中e.e.为56%。在Perkin-Elmer341偏光计上测定旋光度:[a]20D-11.1(浓度1.0，EtOH溶液);文献值[ce]20D-1.7(浓度5.8，MeOH溶液)。而且NMR数据也与Lundell等(r"ra/^&ow..^symme^y2004，15，3723)报道的数据一致。实施例8对映异构富集的卤化2-氨基-l-苯基-乙醇的酶催化合成将38U得自尸.卢^aNCIMB12565的苏氨酸醛縮酶(在DL-遂^C-苯基丝氨酸上进行活性试验)和0.4U得自五"teracoccM/aecafoV583的酪氨酸脱羧酶或得自￡>"eracoca/aedw/wDO的TyrDC-l(在^C-苯基丝氨酸上进行活性试验)加入卤代苯甲醛衍生物(0.1mmol)、甘氨酸(1.0mmol)和吡卩多醛5，-磷酸酯(50nmol)在1.0ml缓冲液(KH2P04，50mM，pH5.5)中的溶液中。将反应混合物在25"C下进行搅拌。在24小时和57小时后通过HPLC测定e.e.。在VarianINOVA500(!H499.82MHz，13C125.69MHz)上或在VarianGEMINI200(111199.98MHz，13C50.29MHz)上得到！H和13CNMR光谱，其中CDC13。H:S7.26，13CS77.0)，D20。H:54.79)和DMS0*d6(!H:52.50，13C540.2)的残留峰作为参照。H20/D20-NMR样品直接由水溶液测定，其中采用020进行稀释(l:l)并利用仏0预饱和进行记录。采用HewlettPackardSeries1100HPLC利用G1315A二极管探测器来实施分析HPLC。在Crow叩ack⑧Cr(-)(150mm，5pm)柱子上，在标准条件下(HC104-溶液pH1.0，114mM，1.0ml/min，15°。)对2-氨基-1-苯基乙醇及其衍生物进行分析。在Perkin-Elmer341偏光计上测定旋光度表6:对映异构富集的卤代2-氨基-l-苯基-乙醇的合成。[a]通过HPLC测定；[b]通过^-NMR测定；n.d:未测定。如果未声明，那么反应时间为24小时。<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>NMR-数据:的-2-氨基-l-(3-氟苯萄乙醇iH-NMR(500MHz，DSMO)S2.56(dd，1H，CH隱N,J=8.0Hz，J=13.0Hz),2.69(dd，1H,CH-N,J=4.0Hz,12.5Hz),4.48(dd,1H,CH-O,J=7.5Hz,J=4.0Hz),7.02(dt,IH,ArH，J=2.0Hz,J=8.5Hz)，7.13(m,2H,ArH)，7.33(dd，1H，ArH，J=8.0Hz,J=14.5Hz);13C-NMR(500MHz,DMSO*d6)S50.5,74.3，113.2(d,J=21.5Hz),114.0(d,J=21.0Hz)，122.6(d,J=2.4Hz),130.5(d，J=8.1Hz)，148.3(d，J=6.8Hz)，162.9(d,J=241Hz);20D-29.3(c1,0，EtOH溶液)。("-2-氨基-l-(4-氟苯基)乙醇20D-12.5(c1.0EtOH溶液)；(S)-2-氨基-l-(4-氟苯基)乙醇的文献值为[a]20D+40.9(c0.48EtOH溶液)；HPLC:ts=28.8min,tR=32.2min;而且NMR数据也与Cho等(TWraAec/raw:j^wwe^y2002，13，1209)报道的一致。(i)-2-氨基-l-(2-氯苯基)乙醇20D-59(c1.0EtOH溶液)；(S)-2-氨基-l-(2-氯苯基)乙醇的文献值为[a]20D+92.5(c1.02012(:12溶液)；HPLC:ts=21.0min,tR=24.6min;而且NMR数据也与Noe等(Mowate/LCAem.1995，126,481)报道的一致。(/)-2-氨基-1-(3-氯苯基)乙醇20D-28.7(c1.0EtOH溶液)；(S)-2-氨基-l-(3-氯苯基)乙醇的文献值为[a]20D+78.9(c0.21EtOH溶液)；HPLC:ts=20.5min,tR=23.9min;而且，NMR数据也与Cho等(r"raA^/ra",A^mme/^y2002,13,1209)报道的一致。("-2-氨基-l-(4-氯苯基)乙醇20D-34.4(c1.0EtOH溶液)；(S)-2-氨基-l-(4-氯苯基)乙醇的文献值为[ce]20D+40.5(c0.53EtOH溶液)；HPLC:ts=20.5min,tR=23.7min;而且NMR数据也与Cho等(7WraAe^w2.'爿^mm"o^2002,13，1209)报道的一致。实施例9采用苏氨酸醛縮酶和酪氨酸脱羧酶转化脂族化合物为了将环己基-甲醛和甘氨酸通过苏氨酸醛縮酶和酪氨酸脱羧酶同时并在一锅内转化为2-氨基-l-环己基乙醇，将40U得自尸.jto^/flNCIMB12565的苏氨酸醛縮酶和2.5得自五w&racocct^/aecafoV583的TyrDC或2.5U得自五"/eracoca^/aedt/mDO的TryDC-l与0.1M环己基-甲醛和1.0M甘氨酸在总体积为1ml的磷酸盐缓冲液(50mM，pH5.5，含有50PLP)中进行反应。作为对比反应，仅将40U得自P.putidaNCIMB12565的苏氨酸醛縮酶与0.1M环己基-甲醛和1.0M甘氨酸在总体积为1ml的磷酸盐缓冲液(50mM，pH5.5，含有50|liMPLP)中进行反应。该反应在磁力搅拌的同时在25'C下进行培养。48小时后，将该反应采用0.5%的甲磺酸(水溶液，pH1.3)稀释7.5倍，并通过LC-MS利用PrevailC18柱子(250X4.0mm，5洗脱液A:0.5%甲磺酸的水溶液pH1.3;洗脱液B:0.5%甲磺酸乙腈溶液；流速1ml/min;梯度95%洗脱液A+5%洗脱液B至5%洗脱液A至95%洗脱液B，15分钟内)进行分析，该柱子与在正极模式(全扫描)下运行、具有大气压离子-电子喷射时间的fight-MS探测仪联用。仅在含有苏氨酸醛縮酶和酪氨酸脱羧酶二者的反应中，与Mecca等(7^ra/e^o".'A^附me—2001,72,1225-1233)化学合成的参照物相比较，可以根据分子质量m+l=144来确认2-氨基-l-环己基乙醇(反应时间5.65min)。仅采用苏氨酸醛縮酶的对照反应未形成可探测量的2-氨基-1-环己基乙醇，这证明了通过苏氨酸醛縮酶和酪氨酸脱羧酶的联合反应才能制成这种脂族/3-氨基醇。29权利要求1.一种用于制备对映异构富集的β-氨基醇的方法，其中，甘氨酸或甘氨酸盐与醛在苏氨酸醛缩酶和脱羧酶的存在下进行反应，从而形成相应的对映异构富集的β-氨基醇，并且其中，至少所述苏氨酸醛缩酶或所述脱羧酶具有β-选择性。2.如权利要求1所述的方法，其中，所述脱羧酶是酪氨酸脱羧酶。3.如权利要求l或2所述的方法，其中，至少所述苏氨酸醛縮酶或所述脱羧酶具有对映选择性。4.如权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，所述醛具有式l其中，R1代表可选被取代的(环)垸基、可选被取代的(环)烯基或可选被取代的炔基、可选被取代的芳基或代表杂环。5.如权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，所述^-氨基醇是具有式2的^-氨基醇其中，R1代表可选被取代的(环)烷基、可选被取代的(环)烯基或可选被取代的炔基、可选被取代的芳基或代表杂环。6.如权利要求5所述的方法，其中，W代表苯基、3-羟基苯基、4-羟基苯基、3，4-二羟基苯基、2,4-二羟基苯基、0,0，-亚甲基-3，4-二羟基苯基、3-(羟甲基)-4-羟苯基、2-氯苯基、3-氯苯基、4-氯苯基、2-氯-4-羟基苯基、4-甲氧基苯基、2-氟苯基、3-氟苯基、4-氟苯基、2-呋喃基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、环己基。7.如权利要求1-6中任意一项所述的方法，其中，所述苏氨酸醛縮酶属于EC4丄2.5或EC4丄2.25的酶分类。8.如权利要求1-7中任意一项所述的方法，其中，所述脱羧酶属于EC4丄1.25或EC4.U.28的酶分类。9.如权利要求1-8中任意一项所述的方法，其中，所述苏氨酸醛縮酶和/或所述脱羧酶的3-选择性为至少50%。10.如权利要求3-7中任意一项所述的方法，其中，所述苏氨酸醛縮酶和/或所述脱羧酶的对映选择性为至少90%。11.如权利要求1-10中任意一项所述的方法，其中，如果所述苏氨酸醛縮酶和所述脱羧酶二者都具有/-选择性，那么所述苏氨酸醛縮酶和所述脱羧酶二者对同种0-羟基-o;-氨基酸都具有/3-选择性。12.如权利要求3-10中任意一项所述的方法，其中，如果所述苏氨酸醛縮酶和所述脱羧酶二者都具有对映选择性，那么所述苏氨酸醛縮酶和所述脱羧酶二者对/5-羟基-of-氨基酸的同种对映异构体都具有对映选择性。13.如权利要求1-12中任意一项所述的方法，其中，所述温度被选定为介于10-39t:之间。14.如权利要求1-13中任意一项所述的方法，还包括，将在所述方法中形成的/3-氨基醇中的氨基转化成经叔丁基保护的氨基。15.如权利要求1-13中任意一项所述的方法，还包括，将在所述方法中形成的/3-氨基醇中的氨基转化成经异丙基保护的氨基。16.—种将权利要求1-13中任意一项所述方法中形成的^-氨基醇进一步转化成活性药物成分的方法。全文摘要本发明涉及一种用于制备对映异构富集的β-氨基醇的方法，其中，甘氨酸或甘氨酸盐与醛在苏氨酸醛缩酶和脱羧酶的存在下进行反应，从而形成相应的对映异构富集的β-氨基醇，并且，其中，至少所述苏氨酸醛缩酶或所述脱羧酶具有β-选择性。在本发明的优选实施方式中，至少所述苏氨酸醛缩酶或所述脱羧酶具有对映选择性。文档编号C12P13/00GK101473039SQ200780022419公开日2009年7月1日申请日期2007年4月12日优先权日2006年4月13日发明者丹尼尔·米恩科,马丁·斯库尔曼,麦克尔·沃尔波吉申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司