用于产生淀粉水解物的方法

专利名称：：用于产生淀粉水解物的方法
技术领域：
：本发明涉及用于产生淀粉水解物(例如用于发酵方法)的改进的方法。
背景技术：
：的含淀粉材料(如颗粒状淀粉)中产生发酵产物的方法。谷物、谷类或植物的块茎包含淀粉。淀粉以孩i观颗粒的形式存在，其在室温不溶于水。当将水性的淀粉浆料加热时，颗粒膨胀并最终胀破，将淀粉分子分散到所述溶液中。在此"凝胶化，，处理过程中，粘度有显著的提高。由于在通常的工业方法中固体水平为约30-40%，因此必须使淀粉变稀薄或"液化"以使其能被处理。此粘度的降低通常通过酶法降解在称为液化的方法中完成。在液化过程中，通过alpha-淀粉酶将长链淀粉降解为葡萄糖单元的较小的分枝的和线状的链(糊精)。常规的酶的液化方法可以作为三步热浆法(three-stephotslurry)进行。将浆料加热至80-85。C并添加热稳定的a-淀粉酶以开始液化。然后将浆料在105-125。C喷射蒸煮(jet-cooked)以完成浆料的凝胶化，冷却至60-95。C，并通常添加额外的a-淀粉酶以终结水解。液化方法通常在pH5-6进行。在糖化期间，将来自液化的糊精进一步水解以产生可以被发酵生物体(如酵母)代谢的低分子的糖DP,-3。水解通常使用葡糖淀粉酶完成，可选择地或者除葡糖淀粉酶外，可以使用a-葡萄糖苷酶和/或酸性a-淀粉酶。全部的糖化步骤通常持续多至72小时，然而，普遍的是仅在高于50。C的温度进行例如，40-90分钟的预糖化，然后是在称为同时糖化和发酵(SSF)的方法中在发酵期间完全糖化。使用加入醪(mash)的发酵生物(如酵母)进行发酵。然后回收发酵产物。对于乙醇，例如燃料乙醇、饮用乙醇或工业乙醇，发酵在通常约32。C的温度进行通常35-60小时。当发酵产物是哞酒时，发酵在通常约14。C的温度进行通常多至8天。发酵后，可以将醪例如用作啤酒，或蒸馏以回收乙醇。可将乙醇用作例如燃料乙醇、饮用乙醇和/或工业乙醇。从上述讨论显然的是，常规方法中的淀粉水解由于在各个步骤期间不同的温度要求，是非常消耗能量的。几个专利申请通过提供将颗粒状淀粉转化为乙醇而无消耗能量的凝胶化步骤的方法解决了该问题。乙醇的发酵方法。申请WO2005/003311和PCT/US05/46725提供了用于将颗粒状淀粉转化为可发酵糖(例如，用于乙醇生产)的真菌a-淀粉酶。申请PCT/DK2005/000819提供了用于将颗粒状淀粉转化为可发酵糖(例如，用于乙醇生产)的细菌a-淀粉酶。的方法。
发明内容本发明提供了用于从含淀粉材料产生淀粉水解物而不将所述含淀粉材料凝胶化的方法。可将淀粉水解物用作例如甜味剂或用于产生发酵产物，如乙醇。本发明人令人惊讶地发现，通过将包含碳水化合物结合模块的细菌a-淀粉酶的作用与包含碳水化合物结合模块的真菌a-淀粉酶的作用组合，与使用增加量的包含碳水化合物结合模块的细菌a-淀粉酶或增加量的包含碳水化合物结合模块的真菌a-淀粉酶相比，实现了产率(yield)的增加。因此在第一个方面，本发明提供了一种方法，其包括用如下物质糖化颗粒状淀粉a)葡糖淀粉酶，b)包含碳水化合物结合模块(CBM)的细菌a-淀粉酶和c)包含CBM的真菌a-淀粉酶，以产生淀粉水解物。在优选的实施方案中，将第一方面的淀粉水解物进一步与发酵生物体接触以产生发酵产物，优选乙醇。优选地，糖化和发酵同时进行。在另一方面，本发明提供了包含碳水化合物结合模块的细菌a-淀粉酶和包含碳水化合物结合模块的真菌a-淀粉酶的作用的组合物。在优选的实施方案中，组合物进一步包含葡糖淀粉酶。优选地，真菌酸性a-淀粉酶活性(AFAU)对葡糖淀粉酶活性(AGU)之间的比率(AFAU每AGU)是至少0.1,特别是至少0.16,如0.12-0.50或甚至更高的范围。发明详述在糖化含淀粉材料(如颗粒状淀粉)的浆料前，制备具有20-55wt.-。/。干固体，优选25-40wt,。/。干固体，更优选30-35%干固体的含淀粉材料。浆料可以包4舌7jc和/或工艺水(processwaters)，例如釜馏物(stillage)(倒流(backset))、洗涤水、蒸发器冷凝物或馏出液、来自蒸馏的侧流汽提器(sidestripper)水或其它发酵产品工厂的工艺水。由于本发明的方法在低于凝胶化温度的温度进行因而不发生明显的粘性增加，因此如果需要可以使用高水平的釜馏物。在一个实施方案中，含水的浆料包含约1至约70vol.-。/。釜馏物，优选15-60%vol.-。/。蒼馏物，尤其约30至50vol.-。/。釜馏物。为了使粉碎的含淀粉材料暴露更多的表面。在一个实施方案中，粒度为0.05-3.0mm,或粉碎的含淀粉材料的至少30。/o适于通过(fitthrough)具有0.05至3.0mm筛网的筛子。在进行本发明的方法后，含淀粉材料的干固体或含淀粉材料的淀粉的至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或优选至少99%转化为可溶的淀粉水解物。本发明的方法在低于起始凝胶化温度的温度进行。在优选的实施方案中，本方法作为同时糖化和发酵方法来进行。在这样的优选实施方案中，方法通常在28。C-36。C，如29。C-35。C,如30。C-34。C,如大约32。C进行。根据本发明，可以在发酵过程中向上或向下调节温度。在一个实施方案中，进行同时糖化和发酵使糖水平(如葡萄糖水平)保持在低水平，如约3wt,。/。以下或低于(below)约3wt-。/。，优选低于约2wt,0/0，更优选低于约lwt,。/。，更优选低于约0.5%,或甚至更优选低于O.lwt,%。可通过简单采用调节量的酶和发酵生物体来实现这样低水平的糖。本领域的技术人员可以容易地确定使用多少量的酶和发酵生物体。也可以选择酶和发酵生物体的采用量以维持发酵培养物中低浓度的麦芽糖。例如，可控制麦芽糖水平低于约0.5wt,。/。或低于约0.2wt,%。本发明的方法可在3-7，优选3.5至6，或更优选4至5的范围的pH进行。于本发明方法的含淀粉起始材料的实例包括块茎、根、茎、全谷物(wholegrain)、玉米、穗轴(cobs)、小麦、大麦、黑麦、买罗高粱、西米、木薯(cassava)、木薯(tapioca)、高粱、稻豌豆、豆或谷类、含糖原料，如糖蜜、果实材料、糖、藤茎/甘蔗(cane)或糖甜菜、马铃薯，和含纤维素材料，如木材或植物残余物。包括蜡质和非蜡质(waxyandnon-waxy)型的玉米和大麦。术语"颗粒状淀粉"表示生的未烹制的淀粉，即，以其天然形式存在于谷类(cereal)、块茎或谷物(grain)中的淀粉。淀粉作为不溶于水的微小颗粒形成于植物细胞中。当置于冷水中时，淀粉颗粒可吸收少量的液体并膨胀。在多至50。C至75。C的温度该膨胀可为可逆的。然而，在更高的温度称为"凝胶化"的不可逆膨胀开始。将要处理的颗粒状淀粉可以是高度精炼的淀粉质量，优选至少90%，至少95%,至少97%或至少99.5°/。纯，或者其可为包含粉碎的全谷物的较粗制含淀粉材料，所述粉碎的全谷物包括非淀粉级分例如胚残余物(germresidue)和纤维。据本发明优选两种粉碎方法湿磨和干磨。在干磨中将全谷粒(wholekernel)磨碎并使用。湿磨提供胚和粗粉(淀粉颗粒和蛋白)的良好分离，并常常应用于将淀粉水解物用于产生糖浆的场合(location)。干磨和湿磨都是淀粉加工领域中所熟知的并且等同地预期用于本发明的方法。在一个实施方案中，粉碎后的粒度为0.05-3.0mm,或因而粉碎的含淀粉材料的至少30%，优选至少50%，更优选至少70%，甚至更优选至少90%适于通过具有0.05至3.0mm筛网，优选具有0.1-0.5mm筛网的篩子。术语"起始凝胶化温度，，表示淀粉凝胶化开始的最低温度。在水中加热的淀粉在50。C-75。C开始劍交化；确切的劍交化温度依赖于特定的淀粉，并且可以由技术人员容易地确定。因此，起始^l交化温度可以根据植物物种，植物物种的特定变种以及生长^f牛而变化。在本发明的上下文中，给出的含淀粉材料的起始凝胶化温度是使用由Gorinstein.S.和Lii.C.，Starch/StMrke,Vol.44(12)pp.461-466(1992)所描述的方法，5%的淀粉颗粒的双折射丧失时的温度。将术语"淀粉水解物"理解为本发明的水解方法的可溶性降解产物。淀粉水解可包含单-、二-和寡糖，如葡萄糖、麦芽糖、麦芽糊精、环糊精和这些物质的任意混合物。优选地，颗粒淀粉干固体的至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%,至少95%,至少96%，至少97%或至少98%转化为可溶性淀粉水解物。术语"发酵产物"表示使用发酵生物体通过包括发酵步骤的方法所产生的产物。根据本发明预期的发酵产物包括醇类(例如，乙醇、曱醇、丁醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸)；酮类(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H2和C02);抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶类；维生素(例如，核黄素、B12、P-胡萝卜素)；和激素。在优选的实施方案中，发酵产物是乙醇，例如，燃料乙醇；饮用乙醇(即，可饮用中性酒精(potableneutralspirit));或工业乙醇或用于可消耗醇工业(例如，啤酒和酒(wine))、乳品工业(例如，发酵奶产品)、皮革工业和烟草工业的产物。优选的啤酒种类包含淡色啤酒(ale)、烈啤酒(stout)、钵尔透黑啤酒(porter)、陈贮啤酒(lager)、苦啤酒(bitter)、麦芽酒(maltliquor)、happoushu、高醇啤酒、低醇啤酒、低卡路里啤酒或清淡啤酒(lightbeer)。所使用的优选发酵方法包括醇发酵方法，如本领域所熟知的。优选的发酵方法是厌氧发酵方法，如本领域所熟知的。术语"发酵生物体"指任何生物体，包括细菌和真菌生物体，其适用于发酵方法且能够产生期望的发酵产物。特别合适的发酵生物体是能够使糖类(如葡萄糖或麦芽糖)直接或间接发酵(即，转化)为期望的发酵产物。发酵生物体的实例包括真菌生物体，如酵母。优选的酵母包括酵母属的菌种(&cc/2aramyc^spp.)，且特别是酿酒酵母。商业可获得的酵母包括，例如，RedStarTM/LesaffreEthanolRed(可从RedStar/Lesaffre，USA获得)、FALI(可从Fleischmann，sYeast，BurnsPhilpFoodInc.分部，USA获得)、SUPERSTART(可从Alltech获得)、GERTSTRAND(可从GertStrandAB，Sweden获得)和FERMIOL(可从DSMSpecialties获得)。包含CBM的真菌和细菌a-淀粉酶根据本发明，将包含CBM的真菌a-淀粉酶和包含CBM的细菌a-淀粉酶应用于本发明的方法中。在优选的实施方案中，a-淀粉酶是酸性a-淀粉酶，例如，真菌酸性a-淀粉酶或细菌酸性a-淀粉酶。术语"酸性a-淀粉酶"表示以有效剂量添加的a-淀粉酶(E.C.3.2丄1)在3至7，优选3.5至6，或更优选4-5范围的pH具有最佳活性。9包含CBM的细菌a-淀粉酶将术语"包含CBM的细菌a-淀粉酶"理解为包含催化域和CBM的酶，所述催化域和所述CBM都源自细菌来源。包含CBM的细菌a-淀粉酶可以是野生型细菌酶、这样的野生型细菌酶的变体或杂合酶，其包含细菌a-淀粉酶催化域和细菌CBM。在本发明的优选实施方案中细菌a-淀粉酶催化域和/或细菌CBM源自芽孢杆菌属CSa"7/w力或无氧芽孢4干菌属G4"ox;^a"'〃w力优选用于本发明的是任何包含CBM的细菌a-淀粉酶，包括杂合体和野生型，其中CBM具有如本文SEQIDNO:l中氨基酸521-619所示的序列或者CBM具有与所述序列同源的序列。还优选用于本发明的是任何包含CBM的细菌a-淀粉酶，包括杂合体和野生型，其中催化域具有如本文SEQIDNO:1的氨基酸32-520所示的序列或者催化域具有与所述序列同源的序列。.在其它优选的实施方案中，包含CBM的细菌a-淀粉酶包含源自地衣芽孢4干菌(及//c/zem》r附/力、解;定4分芽孑包沖干菌(及am_y/o//《wey^c/e/w)、斗古草芽孑包斥干菌(5.sw^7^)或嗜热脂肪芽孢杆菌0S.WearaAwmo//zz7w"的菌抹的催化域，但是还可以源自其它芽孢杆菌菌种。预期的a-淀粉酶催化域的具体实例包括，与专利申请PCT/DK2005/000819(通过引用并入本文)中SEQIDNO:35中所示来自地衣芽孢杆菌的淀粉酶(BLA),SEQIDNO:41中所示来自地衣芽孢杆菌变体LE429的淀粉酶，SEQIDNO:36中所示来自嗜热脂肪芽孢杆菌的淀粉酶(BSG)，SEQIDNO:37中所示来自解淀粉芽孢杆菌的淀粉酶(BAN),SEQIDNO:38中所示来自5./za/o^ra"ceSP722的淀粉酶，SEQIDNO:39中所示的淀粉酶SP690，SEQID:40中所示的淀粉酶AA560具有至少60。/。，至少70%,至少80%或甚至至少90%同一性的淀粉酶催化域。催化域还可以源自嗜糖假单胞菌(尸"w^mowassacc/wra/^7fa)的淀粉酶，如来自WO04/111217(通过引用并入本文)中作为SEQIDNO:l公开的淀粉酶。在本发明的实施方案中，包含CBM的细菌a-淀粉酶是包含催化域的酶，所述催化域与WO99/19467(通过引用并入本文)中的SEQIDNO:1、2或3中所示序列中任一个具有至少70%，优选至少80°/。，更优选至少85%，还更优选至少90%，如至少95%,至少96%,至少97%，至少98%或至少99%同一性。芽孢杆菌属a-淀粉酶催化域还可以是变体和/或杂合体序列，特别是WO96/23873、WO96/23874、WO97/41213、WO99/19467、WO00/60059和WO1002/10355(全部通过引用并入本文)中任一篇所述的。特别预期的a-淀粉酶变体公开于美国专利Nos.6,093,562,6，187,576和6，297，038(全部通过引用并入本文)并包括在WO96/23873中公开的-参见例如，第20页，第1-10行(通过引用并入本文)-具有双缺失的嗜热脂肪芽孢杆菌a-淀粉酶(BSGa-淀粉酶)变体，优选与WO"/19467(通过引用并入本文)中公开的SEQIDNO:7所列的野生型BSGa-淀粉酶氨基酸序列相比，对应于5(181-182)。甚至更优选的是芽孢杆菌属a-淀粉酶催化域，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌a-淀粉酶，其具有对应于S(181-182)的双缺失并与WO99/19467中公开的SEQIDNO:3所列的野生型BSGa-淀粉酶氨基酸序列相比进一步包含N193F取代(也表示为I181*+G182*+N193F)。在特别优选的实施方案中，包含CBM的细菌a-淀粉酶是源自爿"o砂6"c说wco"to/w'""m的菌才朱的野生型细菌a-淀粉酶。优选地，包含CBM的细菌a-淀粉酶具有本文SEQIDNO:l所示的序列。还优选的是与本文SEQIDNO:l具有至少70。/。同一性，例如至少80%或甚至至少90%的同一性，如至少95%，至少96%,至少97%,至少98%，或至少99%同一性的多肽。在其它的实施方案中，包含CBM的细菌a-淀粉酶是在PCT/DK2005/000819中作为SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14(通过引用并入本文)公开的杂合酶之一或者与这些序列之一同源的MSt亭列。可以以O.OOl至l.Omg/gDS，优选以0.01至0.5mg/gDS的量，更优选以0.02至0.2mg/gDS的量使用细菌a-淀粉酶。以AFAU测量，可以以O.Ol-lOAFAU/gDS的量，以0.05-2.5AFAU/gDS的量，或更优选以0.1-1AFAU/gDS，如大约0.5AFAU/gDS的量4吏用细菌a-淀粉酶。以KNU测量，可以以0.001-10KNU/gDS的量，以0.005-2KNU/gDS的量，或更优选以0.01-0.2KNU/gDS,如大约0.035KNU/gDS的量使用细菌a-淀粉酶。包含CBM的真菌a-淀粉酶将术语"包含CBM的真菌a-淀粉酶"理解为包含催化域和CBM的酶，所述催化域和所述CBM都源自真菌来源。包含CBM的真菌a-淀粉酶可以是野生型真菌酶、这样的野生型真菌酶的变体或杂合酶，其包含真菌a-淀粉酶催化域和真菌CBM。在一个实施方案中，野生型酸性a-淀粉酶源自川地曲霉(X^wg/〃wAavrac/7/)的菌抹，特别是在WO2005/003311的SEQIDNO:41中所示的多肽或同源序列，例如包含以下一个或多个取代的所述多肽的变体G33A、L36K、S74A、D75Y、E77D、P120A、1153D、D154N、W155Y、D156E、N157D、L158Q、Q162E、E166L、T169N、1170T、E199K、E199L、D232L、N233D、N235D、L238Y、D239T、W256Y、Q257P、E331Q、S336A、D339K、D339N、V340D和Y342A。最优选的变体包含下列一个或多个取代S74A、E166L、E199L、D339K和D156E。然而更优选的是具有多个取代S74A/E166L/E199L的变体。在优选的实施方案中，包含CBM的真菌a-淀粉酶是杂合a-淀粉酶。真菌杂合酶，如本文所指，包括含有连接(即，共价连结)于包含碳水化合物结合模块(CBM)的氨基酸序列的真菌来源的a-淀粉酶(EC3.2丄1)的氨基酸序列的种类，优选真菌来源的。适用于本发明方法使用的杂合酶的真菌a-淀粉酶催化域包括源自曲霉属04werg/〃w)的菌抹的酸性a-淀粉酶，如米曲霉0^/wg/〃wwyzae)和黑曲霉(Apew说Mw'ge。a-淀粉酶。优选的真菌a-淀粉酶是Fungamyl-样a-淀粉酶，其优选源自米曲霉的菌抹。在本公开中，术语"Fungamyl-样a-淀粉酶，，表示与WO96/23874的SEQIDNO:10所示的氨基酸序列的成熟部分显示高同一性，即至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少％%、至少97%、至少98%、至少99%或甚至100%同一性的a-淀粉酶。优选的杂合酶包含Fungamyl-样a-淀粉酶催化域和源自罗耳阿太菌(Ara诉")葡糖淀粉酶的CBM。适用于本发明方法使用的杂合酶的另一个优选的酸性a-淀粉酶催化域源自黑曲霉菌林。在优选的实施方案中，酸性真菌a-淀粉酶是来自Swiss-prot/TeEMBL数据库中以原始登录号P56271作为"AMYA—ASPNG"公开的黑曲霉的酸性真菌a-淀粉酶，并在WO89/01969(实施例3)中更详细地描述。也将酸性黑曲霉酸性a-淀粉酶表示为WO2005/003311中的SEQIDNO:8。优选的酸性a-淀粉酶淀粉酶催化域还包含所述酸性真菌淀粉酶的变体，其与WO2005/003311中的SEQIDNO:8具有至少70%同一性，如至少80%或至少90%同一性，如至少95%,至少96%,至少97%,至少98%，或甚至至少99%同一性。优选地，包含CBM的真菌a-淀粉酶是WO2005/003311中公开的变体JA01。适用于本发明方法使用的杂合酶的另一个优选的酸性a-淀粉酶淀粉酶催化域是专利申请PCT/US05/46725(通过引用并入本文)中公开的任何a-淀粉酶催化域，且优选催化域源自其中公开的任何菌种，特别地选自由如下组成的组细毛嗜热霉(772wmomj;c&s/am^"ow力，特别是具有PCT/US05/46725(通过引用并入本文)的SEQIDNO:14中氨基酸1-441的多肽；畸枝霉属的菌种(Ma/6ra"c/zeasp.)，特别是具有SEQIDNO:18中氨基酸1-471的多肽；微小根毛霉(i/n'zomwcor;ws/〃w)，特别是具有SEQIDNO:20中氨基酸1-450的多肽；D/c/wtomoc/aAww/ze^e/^e/,特别是具有SEQIDNO:22中氨基酸1-445的多肽；韧革菌属的菌种OStewmsp.)，特别是具有SEQIDNO:26中氨基酸1-498的多肽；栓菌属的菌种(rrametessp.)，特别是具有SEQIDNO:28中氨基酸18-513的多肽；鲑贝革盖菌(Cw7V/wcww0ra)，特别是具有SEQIDNO:30中氨基酸1-507的多肽；刺杯毛孢属的菌种(Z^"e/nas/on'wwsp.),特别是具有SEQIDNO:32中氨基酸1-481的多肽；0，toypon'o/^sp.,特别是具有SEQIDNO:34中氨基酸1-495的多肽；色二孢属的菌种(Dzj9/0&asp.)，特别是具有SEQIDNO:38中氨基酸1-477的多肽；粘帚霉属的菌种(G//oc/aAwmsp.)，特别是具有SEQIDNO:42中氨基酸1-449的多肽；丛赤壳属的菌种(iVe"Wasp.)，特别是具有SEQIDNO:115中氨基酸1-442的多肽；镰孢属的菌种(Fwan'"msp.),特别是具有SEQIDNO:4中氨基酸1-480的多肽；具有SEQIDNO:6中氨基酸1-478的多肽；或具有SEQIDNO:117中氨基酸1-441的多肽；橙色嗜热子嚢菌(77^m2oaycw做ra""cw",特别是具有SEQIDNO:125中氨基酸1-477的多肽；雅致枝霉(77zam/"^wme/egam),特别是具有SEQIDNO:131中氨基酸1-446的多肽；冠毛犁头霉(JfoWacn、toto),特别是具有SEQIDNO:157中氨基酸41-481的多肽；枝顶孢霉属的菌种(v4cwmom'"msp.)特别是具有SEQIDNO:159中氨基酸22-626的多肽；Com'oc/^etosp.,特别是具有SEQIDNO:161中氨基酸24-630的多肽；Mer—^;g""/ew，特别是具有SEQIDNO:163中氨基酸27-602的多肽；青霉属的菌种(尸em'c做wwsp.),特别是具有SEQIDNO:165中氨基酸21-643的多肽；淤泥链霉菌(&reptomjces//wosws)，特别是具有SEQIDNO:167中氨基酸29-566的多肽；Sw^/Z^orapracwrvato，特别是具有SEQIDNO:169中氨基酸22-613的多肽；总状共头霉(5^"ce;^a/^m^racewoswm)，特别是具有SEQIDNO:171中氨基酸21-463的多肽；皱褶栓菌(rrawefescwm^ato),特别是具有SEQIDNO:173中氨基酸21-587的多肽；7>/c/2o;/2aearaccato，特别是具有SEQIDNO:175中氨基酸30-773的多肽；Fa/^Wa厂wZ)n'com,特别是具有SEQIDNO:177中氨基酸22-586的多肽；Fa/saWa^"W//，特别是具有SEQIDNO:179中氨基酸20-582的多肽。还优选的是a-淀粉酶淀粉酶催化域，其具有与上述多肽同源的序列。最优选地，杂合体包含专利申请PCT/US05/46725(通过引用并入本文)中公开的CBM,优选地CBM来自选自下组的葡糖淀粉酶尸ac/zj^ytosporapapayracea(SEQIDNO:76)、环带栓菌(rram"es"'"gw/afa)(SEQIDNO:78)、大白桩蒜(丄e"co/7ax/〃"sg/ga"ft/力(SEQIDNO:80)、罗耳阿太菌(^决e/^ra诉//)(SEQIDNO:92)、川地曲霉(SEQIDNO:94)、黑曲霉(SEQIDNO:96)或来自选自下组的a-淀粉酶PCT/US05/46725(通过引用并入本文)中的7Hc/zc;p/2eraearaccato(SEQIDNO:52)、orapravwrrato(SEQIDNO:82)、^&an'an^hcoM(SEQIDNO:84)、枝顶孢霉属的菌种(SEQIDNO:86)、Mm>〃w5g/gawtews(SEQIDNO:88)、/4"ox;^a"7/z^co幽m/""ra(SEQIDNO:90)、Cbc/weto取(SEQIDNO:98)、C画'oc/zaetos/.(SEQIDNO:137)、皱褶对全菌(rrametescorragato)(SEQIDNO:139)、Fa/rahos;^r招(SEQIDNO:141)和青霉属的菌种(SEQIDNO:143)。还优选的是与上述序列中的任一个同源的序列。还优选用于本发明的是专利申请PCT/US05/46725中公开的V001、V002、V003、V004、V005、V006、V007、V008、V009、V010、VOll、V012、V013、V014、V015、V016、V017、V018、V019、V021、V022、V023、V024、V025、V026、V027、V028、V029、V030、V031、V032、V033、V034、V035、V036、V037、V038、V039、V040、V041、V042、V043、V047、V048、V049、V050、V051、V052、V054、V055、V057、V059、V060、V061、V063、V064、V065、V066、V067、V068和V069，并且通过引用并入本文。还优选的是与上述序列中的任一个同源的序列。更优选的是包含CBM的真菌a-淀粉酶，其中真菌a-淀粉酶催化域是与SEQIDNO:4的氨基酸13至450具有至少70%同源性的氨基酸序列，其优选来自微小根毛霉和/或真菌CBM是与SEQIDNO:2的氨基S臾488至595具有至少70%同源性的氨基酸序列，优选源自黑曲霉的菌抹的序列，优选源自黑曲霉葡糖淀粉酶的序列。最优选地，包含CBM的真菌a-淀粉酶是PCT/US05/46725中公开的杂合体V039，其包含来自微小根毛霉a-淀粉酶的CD和来自黑曲霉葡糖淀粉酶的接头和CBM,并具有如本文SEQIDNO:2中氨基酸13-595所示的序列。可以以0.001至1.0mg/gDS的量，优选以0.01至0.5mg/gDS的量，更优选以0.02至0.2mg/gDS的量^f吏用真菌a-淀4分酶。以AFAU测量，可以以0.01-10AFAU/gDS的量，以0.05-2.5AFAU/gDS的量，或更优选以0.1-1AFAU/gDS,如大约0.5AFAU/gDS的量使用真菌a-淀粉酶。葡糖淀粉酶术语"葡糖淀粉酶活性"表示葡聚糖l,4-a-葡萄糖普酶，其连续从链的非-还原末端水解末端l,4-连接的a-D-葡萄糖残基，释放P-D-葡萄糖，其属于EC3.2.1.3酶类。用于本发明方法的葡糖淀粉酶可以具有PCT/US05/46724的SEQIDNO:2中公开的氨基酸序列，并在本文显示为SEQIDNO:3或与SEQIDNO:3具有至少70%、优选至少75%、或至少80%、或至少85%、或90%、或至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%同一性。葡糖淀粉酶可以优选源自环带栓菌。可选才奪地，用于本发明方法的葡糖淀粉酶可以具有PCT/US05/01147作为SEQIDNO:2的氨基酸残基l至561显示的氨基酸序列，或与所述SEQIDNO:2(氨基酸残基l至561)具有至少70。/。、优选至少75%、或至少80%、或至少85%、或90%、或至少95%、至少96%、至少97°/。、至少98%或甚至至少99%同一性的氨基酸序列。葡糖淀粉酶可以优选源自罗耳阿太菌。还优选的是WO99/28448中公开的源自ra/arow_ycaseweraom7的葡糖淀粉酶和Boel等，(1984)，EMBOJ.3(5)p.1097-1102中公开的源自黑曲霉的葡糖淀粉酶。黑曲霉葡糖淀粉酶可从NovozymesA/S作为SprizymeP1usTm和SprizymeFuelTM获得。可以以0.01至2.0mg/gDS的量，优选以0.05至1.0mg/gDS的量，更优选以0.1至0.5mg/gDS的量使用葡糖淀粉酶。以AGU测量，可以以O.Ol-lOAGU/gDS的量，以0.05-2.5AGU/gDS的量，或更优选以0.1-1AGU/gDS,如约0.5AGU/gDS的量使用葡糖淀粉酶。蛋白酶根据本发明的方法，可以在糖化和/或发酵期间还提供蛋白酶。在优选的实施方案中，蛋白酶是微生物来源的酸性蛋白酶，优选真菌或细菌来源的。合适的蛋白酶包括微生物蛋白酶，如真菌和细菌蛋白酶。优选的蛋白酶是酸性蛋白酶，即，蛋白酶，其特征为在酸性条件(低于pH7，优选3.5至6，或更优选4至5)下水解蛋白的能力。期望的酸性真菌蛋白酶包括源自如下的真菌蛋白酶曲霉属、毛霉属(Mwcor)、才艮霉属(//n'zo;ws)、念J朱菌属(Qmc^a)、革盖菌属(CoWo/w)、内座壳属(五"fifc^/"^)、_￡>2//7(W70_p/7^^、l巴菌属(7r/ex)、青霉属(尸em.c/〃/w附)、'J、核菌属(5Wera"wm)和球拟酵母属(7brw/opw;y)的真菌蛋白酶。特别期望的是源自黑曲霉(参见例如，Koaze等，(1964)，Agr.Biol.Chem.Japan,28,216)、斋藤曲霉(J5perg7'〃MSsa"o/)(参见例3口，Yoshida,(1954)J.Agr.Chem.Soc.Japan,28,66)、泡盛曲霉(v4，rg/肠a而膨n')(Hayashida等，(1977)Agric.Biol.Chem.，42(5),927-933)、棘孢曲霉C^/^g/〃wacw/e"/w力(WO95/02044)或米曲霉(Js;erg/〃twoo^ae),如pepA蛋白酶；以及来自孩丈小毛霉(A/wcor;ms〃/w力或米黑毛霉(Mwcor脂'e/ze/)的酸性蛋白酶。期望的还有中性或碱性蛋白酶，如源自芽孢杆菌属的菌抹的蛋白酶。特别预期用于本发明的蛋白酶源自解淀粉芽孢杆菌并具有可在Swissprot作为登录号P06832获得的序列。还期望的是与可在SwissProt作为登录号P06832获得的氨基酸序列具有至少90%同一性，如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或特别是至少99%的同一性的蛋白酶。进一步期望的是与WO2003/048353中作为SEQ,ID.NO:l公开的氨基酸序列具有至少90%同一性，如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98°/。或特別是至少99%的同一性的蛋白酶。还期望的是木瓜蛋白酶-样蛋白酶，如E.C.3.4.22.*(半胱氨酸蛋白酶)之内的蛋白酶，如EC3.4.22.2(木瓜蛋白酶)、EC3.4.22.6(木瓜凝乳蛋白酶(chymopapain))、EC3.4.22.7(萝蘼蛋白酶(asclepain》、EC3.4.22.14(actinidain)、EC3.4.22.15(组织蛋白酶(cathepsin)L)、EC3.4.22.25(甘氨酰内肽酶(glycylendopeptidase))和EC3.4.22.30(caricain)。可以以0.1-1000AU/kgdm，优选1-100AU/kgDS和最优选5-25AU/kgDS的量添加蛋白酶。其它成分16在糖化和/或发酵期间可以提供其它成分以增加本发明方法的有效性。例如，营养物(例如发酵生物体微量营养物)、抗生素、盐(例如锌盐或镁盐)、其它酶如肌醇六磷酸酶、纤维素酶、半纤维素酶、外切和内切葡聚糖酶以及木聚糖酶。发酵产物的回收在发酵后可任选地回收发酵产物，如乙醇。可以通过任何常规方式(例如蒸馏)来进行回收。本文中描述和要求保护的本发明不局限于本文公开的具体实施方案的范围，因为这些实施方案意欲作为本发明的几个方面的说明。任何等同的实施方案意欲在本发明的范围之内。实际上，从前面的说明，除本文显示和描述的那些之外，本发明的各种修饰对于本领域的那些技术人员是显而易见的。这些修饰也意欲落入所附权利要求的范围内。在冲突的情况下，以包括定义的本公开为准。本文引用了各种参考文件，其公开内容通过引用整体并入。材料与方法葡糖淀粉酶酸性细菌a-淀4分酶(ABAA)源自」"o;c;^a"7/wsco"tom/"(ms并具有SEQIDNO:l中所示的序列。酸性真菌(x-淀粉酶(AFAA)包含微小根毛霉a-淀粉酶催化域和黑曲霉葡糖淀粉酶接头和CBM并具有SEQIDNO:2中所示的序列。源自黑曲霉的葡糖淀粉酶在Boel等，(1984),EMBOJ.3(5)p.1097-1102中公开并且可从NovozymesA/S获得。葡糖淀粉酶源自环带栓菌并且具有SEQIDNO:3中所示的序列。酵母RedStar顶可以从RedStar/Lesaffre,USA获得。同源性/同一性在本发明的上下文中，多肽"同一性"指两个氨基酸序列之间的同一性程度。可通过本领域已知的计算机程序，如GCG程序包(ProgramManualfortheWisconsinPackage,8版，1994年8月，GeneticsComputerGroup,575ScienceDrive,Madison,Wisconsin,USA53711)(Needleman，S.B.和Wunsch，G,D.，(1970)JournalofMolecularBiology,48，443-453)中提供的GAP合适地确定同一性。使用多肽序列比较的下列设置GAP产生罚分为3.0和GAP延伸罚分为0.1。术语"同源序列，，用于表征与已知序列具有至少70%、优选至少75%、或至少80%、或至少85%、或90%、或至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%同一性的序列。用于同源性确定的氨基酸序列的相关部分是成熟多肽，即没有信号肽。a-淀粉酶活性(KNU)可使用马铃薯淀粉作为底物来确定淀粉分解活性。该方法基于改性马铃薯淀粉通过酶的分解，并通过将淀粉/酶溶液的样品与^典溶液混合来跟踪反应。起初，形成蓝黑色，但是在淀粉分解过程中，蓝色变弱并逐渐变为红褐色，其与有色的玻璃标准物相比。将一个KiloNovoa-淀粉酶单位(KNU)定义为在标准条件下(即在37。C+/-0.05;0.0003MCa2+;和pH5.6)将5260mg淀4分干物质MerckAmylumsolubile糊精化的酶量。更详细描述该分析方法的文件夹EB-SM-0009.02/01可根据向NovozymesA/S，Denmark要求而获得，所述文件夹通过引用并入本文。酸性a-淀粉酶活性当根据本发明使用时，任何酸性a-淀粉酶的活性可以以AFAU(酸性真菌a-淀粉酶单位)测量。可选择地，酸性a-淀粉酶的活性可以以AAU(酸性a-淀粉酶单位)测量。酸性a-淀粉酶单位(AAU)可以以AAU(酸性a-淀粉酶单位)测量酸性a-淀粉酶活性，这是一种绝对(absolute)方法。一个酸性淀粉酶单位(AAU)是在标准化的条件下，每小时将lg淀粉(100。/。干物质)转化为产物的酶量，所述产物在与已知强度(strength)的碘溶液反应后在620nm处具有与颜色参照之一等同的发射(transmission)。标准条件/反应条件底物可溶性淀粉浓度约20gDS/L.緩冲液柠檬酸盐，约0.13M,pH二4.2碘溶液40.176g碘化钾+0.088g硤/L自来水15。-20。dH(德国硬度(Germandegreehardness))pH:4.2温育温度30oC18反应时间ll分钟波长620nm酶浓度0.13-0.19AAU/mL酶工作范围0.13-0.19AAU/mL淀粉应为Lintner淀粉，其为在实验室中用作比色指示剂的稀糊淀粉(thin-boilingstarch)。通过将天然淀粉用稀盐酸处理，使其保持与石典生成蓝色的能力，从而获得Lintner淀粉。进一步细节可以在欧洲专利No.140410中找到，其公开通过引用并入本文。酸性a-淀粉酶活性(AFAU)可以以AFAU(酸性真菌a-淀粉酶单位)测量酸性a-淀粉酶活性，其相对于酶标准物确定。将lFAU定义为在下述标准条件下每小时降解5.260mg淀粉干物质的酶量。酸性a-淀粉酶，一种内切-a-淀粉酶(l，4-a-D-葡聚糖-葡聚糖水解酶，E.C3.2丄1)，水解淀粉分子内部区中的a-l,4-糖苷键以形成不同链长的糊精和寡糖。与碘形成的颜色的强度与淀粉浓度成正比。使用反向比色法在特定的分析条件下测定淀粉浓度的减少作为淀粉酶活性。淀粉+碘""定麟糊精+寡糖40°C，2.5A=590廳蓝/紫1=23秒脱色标准条件/反应条件底物可溶性淀粉约0.17g/L緩冲液柠檬酸盐，约0.03M碘(12):0,03g/LCaCl2:1.85mMpH:2.50±0.05温育温度40oC反应时间23秒波长590nm酶浓度0.025AFAU/mL酶工作范围0.01-0.04AFAU/mL更详细描述该分析方法的文件央EB-SM-0259.02/01可根据向NovozymesA/S,Denmark要求而获得，所述文件夹通过引用并入本文。葡糖淀粉酶活性可以以AGI单位测量或以淀粉葡萄糖芬酶单位(AGU)测量葡糖淀粉酶活性。葡糖淀粉酶活性(AGI)葡糖淀粉酶(等同于淀粉葡萄糖苷酶)将淀粉转化为葡萄糖。在此通过用于活性测定的葡萄糖氧化酶方法来确定确定葡萄糖的量。该方法在AmericanAssociationofCerealChemists,2000;ISBN:1-891127-12匿8中，于"ApprovedmethodsoftheAmericanAssociationofCerealChemists".Vol.1-2AACC中的76-11节"淀粉-葡糖淀粉酶方法及用葡萄糖氧化酶进行葡萄糖的后续测量"中描述。一个葡糖淀粉酶单位(AGI)是在该方法的标准条件下每分钟形成l微摩葡萄糖的酶量。标准条件/反应条件底物可溶性淀粉，浓度约16g千物质/L.緩冲液乙酸盐，约0.04M,pH二4.3pH:4.3温育温度60°C反应时间15分钟反应的终止NaOH至约0.2g/L的浓度(pH9)酶浓度0.15-0.55AAU/mL.淀粉应该是Linter淀粉，这是在实验室中用作比色指示剂的稀糊淀粉。将天然淀粉用稀盐酸处理，使其保持与碘生成蓝色的能力，从而获得Lintner淀粉。葡糖淀粉酶活性(AGU)将Novo葡糖淀粉酶单位(AGU)定义为在标准条件下每分钟水解l微摩尔麦芽糖的酶量，所述标准条件为37。C、pH4.3，底物麦芽糖23.2mM,緩沖液乙酸盐0.1M，反应时间为5分钟。可以使用自动分析系统。向葡萄糖脱氢酶试剂中加入变旋酶(mutarotase)，从而将存在的任何a-D-葡萄糖转化成P-D-葡萄糖。在上述反应中，葡萄糖脱氢酶特异性地与(3-D-葡萄糖反应形成NADH，使用光度计在340nm处测定形成的NADH，作为测定起始葡萄糖浓度的量度。AMG温育底物麦芽糖23.2mM缓沖液乙酸盐0.1MpH:4.30±0.05温育温度37°C±1反应时间5分4中酶工作范围0.5-4.0AGU/mL显色反应GlucDH:430U/L变旋酶9U/LNAD:0.21mM緩沖液磷酸盐0.12M;0.15MNaClpH:7.60±0.05温育温度37°C士1反应时间5分钟波长340nm更详细描述这种分析方法的文件夹(EB-SM-0131.02/01)可根据向NovozymesA/S，Denmark要求而获得，所述文件夹通过引用并入本文。蛋白水解活性(AU)可以用变性血红蛋白作为底物来确定蛋白水解活性。在用于确定蛋白水解活性的Anson-Hemoglobin方法中，消化变性的血红蛋白，并用三氯乙酸(TCA)沉淀未消化的血红蛋白。用酚试剂确定TCA可溶产物的量，所述酚试剂与酪氨酸和色氨酸显蓝色。将一个Anson单位(AU)定义为在标准条件(即25。C、pH"和10分钟反应时间)下以初始速率消化血红蛋白，^f吏得每分钟释放一定量的TCA可溶产物的酶量，所述可溶产物与酚试剂给出与一毫当量(milliequivalent)酪氨酸相同的颜色。更详细描述这种分析方法的文件夹AF4/5可4艮据向NovozymesA/S,Denmark要求而获得，所述文件夹通过引用并入本文。实施例l:从194.44g粉碎的玉米(corn)(90Q/。小于0.5mm),305.56g37mMNaOAc，0.025%叠氮化钠，20mMCaCl2,pH4.5制备35%DS浆料。用5NNaOH将pH调节至4.5并将浆料在室温搅拌温育一小时。对于每个反应将5g浆料加入20ml管，并在添加酶之前将管在32。C温育一小时。在每个管中添加适量的酶，如表l所示，加盖并立即涡旋。将管在32。C温育并在0.5、1、2、3和4小时时涡旋。在4小时处通过添加50micrL40%112804终止反应。每个反应重复进行三次。样本制备包括将上清液离心并将其通过0.45微米滤器过滤。将等待HPLC分析的样本保存于4。C。HPLC结果在下面表1中显示。表l.与多种葡糖淀粉酶(GA),细菌a-淀粉酶(BAA)和真菌a-淀粉酶(FAA)的组合温育后水解产物中的糖浓度。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>实施例2将磨碎的玉米410g(90%小于0.5mm)与590g自来水(tapwater)、3,0mL1g/L青霉素和lg尿素混合。用5NNaOH将pH调节至4.5。DS水平确定为35。/。。对于每个反应将5g此浆料加入20ml管中。根据表2或3在每个管中添加适量的酶，接着添加200microL酵母增殖物/5g发酵物，然后在32。C温育。每个处理进行9次重复发酵。在24小时、48小时和70小时时间点选择3个重复进行分析。将管在24、48和70小时时涡旋。时间点分析包括管称重和为HPLC准备样本。HPLC准备包括通过添加50microL40%112804终止反应、离心和通过0.45um滤器过滤。将等待HPLC分析的样本保存在4。C。HPLC结果在表2中显示。表2.与环带栓菌葡糖淀粉酶(GA)、细菌a-淀粉酶(BAA)和真菌a-淀粉酶(FAA)的组合及酵母温育后的乙醇产率(yield)。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>权利要求1.一种方法，其包括使用如下物质将颗粒状淀粉糖化a)葡糖淀粉酶，b)包含碳水化合物结合模块(CBM)的细菌α-淀粉酶，和，c)包含CBM的真菌α-淀粉酶，以产生淀粉水解物。2.权利要求l的方法，还包括将所述淀粉水解物与发酵生物体接触以产生发酵产物。3.权利要求1或2中任一项的方法，其中糖化和发酵同时进行。4.权利要求l-3中任一项的方法，其中在发酵后回收所述发酵产物。5.权利要求l-4中任一项的方法，其中所述发酵产物是醇，优选乙醇，尤其是燃料乙醇，可饮用乙醇和/或工业乙醇。6.权利要求l-5中任一项的方法，其中所述包含CBM的真菌a-淀粉酶和/或包含CBM的细菌a-淀粉酶是酸性真菌a-淀粉酶和/或酸性细菌a-淀粉酶。7.权利要求l-6中任一项的方法，其中所述包含CBM的真菌a-淀粉酶和/或包含CBM的细菌a-淀粉酶是包含CBM的野生型酶或野生型酶的遗传修饰的变体。8.权利要求l-7中任一项的方法，其中所述包含CBM的真菌a-淀粉酶源自川地曲霉的菌抹。9.权利要求l-8中任一项的方法，其中所述包含CBM的细菌a-淀粉酶源自黄热芽孢杆菌的菌抹。10.权利要求l-9中任一项的方法，其中所述包含CBM的真菌a-淀粉酶和/或包含CBM的细菌a-淀粉酶是杂合酶，优选包含a-淀粉酶催化域(CD)和碳水化合物结合模块(CBM)和任选的接头的杂合酶。11.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述真菌a-淀粉酶催化域是与SEQIDNO:4的13至450位氨基酸具有至少70°/。同源性的氨基酸序列，优选源自微小根毛霉。12.权利要求l-ll中任一项的方法，其中所述真菌CBM是与SEQIDNO:2的488至595位氨基酸具有至少70。/。同源性的氨基酸序列，优选源自黑曲霉的菌抹的序列，优选源自黑曲霉淀粉葡萄糖苷酶的序列。13.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述包含CBM的真菌a-淀粉酶是与SEQIDNO:2的13至595位的氨基酸具有至少70%同源性的氨基酸序列。14.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述细菌a-淀粉酶催化域是与SEQIDNO:1的32至520位的氨基酸具有至少70%同源性的氨基酸序列。15.权利要求1-14中任一项的方法，其中所述细菌a-淀粉酶催化域和/或CBM源自黄热芽孢杆菌。16.权利要求1-15中任一项的方法，其中所述细菌CBM是与SEQIDNO:1的521至619位氨基酸具有至少70%同源性的氨基酸序列。17.权利要求1-16中任一项的方法，其中所述葡糖淀粉酶源自罗耳阿太菌04欣^^//^')、环带栓菌或黑曲霉。18.权利要求1-17中任一项的方法，其中所述方法在存在蛋白酶或肌醇六磷酸酶的条件下进行。19.权利要求1-18中任一项的方法，其中所述含淀粉的材料从块茎、根、茎、果实或全谷物中获得。20.权利要求1-19中任一项的方法，其中所述含淀粉的材料从谷类中获得。21.权利要求l-20中任一项的方法，其中所述含淀粉的材料从玉米、穗轴、小麦、大麦、黑麦、买罗高粱、西米、木薯(cassava)、树薯、木薯(tapioca)、高粱、稻或马铃薯中获得。22.权利要求1-21中任一项的方法，其中所述方法在3-7，优选3.5-6或更优选4-5的pH进行。23.权利要求l-22中任一项的方法，其中干固体含量(DS)为20-55wt,%,优选25-40wt,%,更优选30-35wt.-G/o的范围。24.权利要求l-23中任一项的方法，其中在糖化和发酵期间将糖浓度保持在约3wt.%以下或低于约3wt.%的水平。25.权利要求l-24中任一项的方法，其中通过将含淀粉材料粉碎至0.1-0.5mm的粒度来制备粉碎的含淀粉材料。26.权利要求l-25中任一项的方法，其中所述粉碎的含淀粉材料是通过干磨或湿磨获得的颗粒状淀粉。27.权利要求l-26中任一项的方法，其中所述粉碎的含淀粉材料是全谷物。28.权利要求l-27中任一项的方法，其中在发酵期间的温度为28°C-36°C，例如29。C-35°C,例如30。C-34。C，例如大约32。C。29.适合糖化颗粒状淀粉的组合物，所述组合物包含含有碳水化合物结合模块(CBM)的细菌a-淀粉酶，以及含有CBM的真菌a-淀粉酶。30.权利要求29的组合物，其还包含葡糖淀粉酶。31.权利要求29或30中任一项的组合物，其还包含一种或多种选自下组的酶蛋白酶、肌醇六磷酸酶、纤维素酶、半纤维素酶、外切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶，和木聚糖酶。全文摘要本发明涉及用于产生淀粉水解物和任选的发酵产物，如乙醇的方法。文档编号C12P19/14GK101466844SQ200780021874公开日2009年6月24日申请日期2007年6月15日优先权日2006年6月15日发明者卡斯滕·安德森,吉姆·刘,安德斯·维克索-尼尔森申请人:诺维信公司;诺维信北美公司