专利名称：天然茶氨酸的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种天然茶氨酸的制备方法，属于生物工程技术领域。
背景技术：
茶氨酸(N-乙基卞谷氨酰胺)是茶叶特有的一种氨基酸，是绿茶中有效的呈味 物质，其含量直接决定茶叶的品质。此外，茶氨酸还具有降血压、抗肿瘤、保 护神经、放松、抗抑郁、抗疲劳、提高免疫力、减轻体脂等作用。因此，茶氨 酸越来越受到人们的重视，并有望添加于食品和药物中开发出新型的功能食品 和功能药物。
迄今为止，茶氨酸的制造方法，主要有三种。第一，是从茶叶中提取的方 法。但由于干茶叶中的茶氨酸含量仅有1.5%左右，且光合作用会使茶氨酸损失 一部分，致使产量很低。随后，便发明了适合于工业化生产的第二种方法，即 化学有机合成茶氨酸的方法。但该法可能会残留毒性物质，且生成物包括D、 L-型茶氨酸异构体，需要进行拆分才能得到L型产品，使得分离精制操作复杂。 第三种制造方法，是利用微生物酶法进行生产。目前报道了利用来自假单孢菌 属的谷氨酰胺酶的，谷氨酰基转移反应，由L-谷氨酰胺和乙胺合成茶氨酸的酶 法和固定化酶法，以及2005年公开的利用来自香茅醇假单孢菌GEA和2007年 公开的利用来自芽孢杆菌属、霉菌或酵母菌中的1种或2种以上的谷氨酰胺酶 酶法生产。但利用谷氨酰胺酶酶法生产存在着因谷氨酰胺酶的水解反应而在生 产茶氨酸的同时，还生成副产物谷氨酸，而使茶氨酸的精制变得复杂的问题。
发明内容
本发明是鉴于上述问题而完成的发明，其目的在于提供有效的制备茶氨酸 的方法。
本发明的技术方案 一株产生Y-谷氨酰转肽酶的菌株，其分类命名为枯草 芽孢杆菌(Bacz7/wsrato'fc) SK11.004，已保藏在中国典型培养物保藏中心，保 藏编号CCTCCNO: M 208083。
一种天然茶氨酸的制备方法 (1)制备粗酶粉使用枯草芽孢杆菌SK11.004为出发菌株；
培养基，以g/L计为蔗糖25、胰蛋白胨5、玉米浆15 、 MgS(V7H2O0.5、 K2HP04 1， pH7.0; 37°C， 200 rpm的条件下培养16 h;冷冻离心，制得的发酵 液上清液，即为粗酶液；
将粗酶液进行浓縮后，按酶液:酒精体积比4:1的比例添加酒精进行沉淀，
将沉淀后的蛋白冷冻干燥，即得粗酶粉；
(2) 酶反应制备天然茶氨酸使用制得的粗酶粉，以0.2U/mL加入到含谷 氨酰胺0.02M、乙胺0.15-0.25M的pH 9 10.5、 lOOmM Na2B407-NaOH硼酸钠
缓冲液中，在35 40'C下进行2小时的酶反应，合成了茶氨酸；
(3) 茶氨酸的精制将酶反应液通过减压浓縮除去乙胺后，再依次使用 001x7的732强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，201x7的717强碱性阴离子交换 树脂，和乙醇处理得到茶氨酸的精制品。
本发明的有益效果发明人等为了解决上述问题，从中国传统发酵制品中 分离筛选得到一株新型的可用于生产茶氨酸的菌株，其所产的Y-谷氨酰转肽酶， 在pH9 10.5、 35 4(TC的条件下，通过作用于谷氨酰胺和乙胺，可以高效的 生产茶氨酸，转化率可达80%以上。
本发明的酶法制备茶氨酸的方法具有反应时间短、酶活性源制备简单、能 使茶氨酸的生产简单，以及产品安全可靠的优点，适于进行大规模工业化生产。 生物材料样品保藏
上述茶氨酸生产菌是本发明人等首次发现鉴定的新型菌株，分类命名为枯 草芽孢杆菌(5a"7/^swZ^7&) SK11.004，保藏机关名称中国典型培养物保藏 中心，地址中国武汉武汉大学，保藏日期2008年07月10日，保藏编号 CCTCCNO: M 208083。
图1用枯草芽孢杆菌SK11.004所产的"谷氨酰转肽酶作用于谷氨酰胺和乙 胺合成茶氨酸时的氨基酸测定结果。glu:谷氨酸，gln:谷氨酰胺，the:茶氨酸。
具体实施例方式
下面，详细说明本发明的实施方式，但本发明的技术范围不受限于下述实 施方式，在不改变其要点的前提下，可做各种改变进行实施。另外，本发明的 技术范围延及均等的范围。
本发明的茶氨酸是指N-乙基-，谷氨酰胺，是茶叶特有的一种氨基酸，是绿 茶中有效的呈味物质，可以用作品质、风味改良剂及功能食品添加剂。
本发明中使用的乙胺衍生物，可以列举乙胺、乙胺盐酸盐等。
本发明所用的枯草芽孢杆菌SK 11.004是由本发明人等发现的新菌株，是具 有产生Y-谷氨酰转肽酶的茶氨酸生产菌。另外，本发明所用的枯草芽孢杆菌SK 11.004鉴定，是通过根据一定法则的菌类学性质、生物化学性质的分析和16s RNA序列的测定而得出的。
本发明的Y-谷氨酰转肽酶是来自枯草芽孢杆菌SK11.004的酶。该酶在碱性 条件下，水解活性很低，而其谷氨酰基转移活性很高，大大优于谷氨酰胺酶。 该反应的酶活性源可直接使用发酵液上清液或各种处理样品，例如经超滤、酒精沉淀或精制等所得的酶制品。
本发明中的谷氨酰转肽酶活性，是通过使酶作用于Y-谷氨酰对硝基苯胺和 双甘肽，定量所生成的对硝基苯胺而测定。该酶的单位定义为每1分钟生成
lpmol对硝基苯胺的酶量。
实施例l产谷氨酰转肽酶菌的分离
采用中国传统发酵制品虾酱，取少许加入到分离培养基中(以g/L计)葡 萄糖20、酵母膏15、玉米浆IO、 MgSO4.7H2O0. 5、 K2HP041， pH7.0。在37。C， 200rpm的条件下培养24h，经稀释涂布后，获得纯培养物，37。C培养30h，得到 20株酶活较高的菌株，选定一株酶活可达2U/mL的菌株SK11.004为实验菌株。
实施例2粗酶粉的制备
使用实施例1所得到的枯草芽孢杆菌SK11.004,在发酵培养基中(以g/L 计):蔗糖25、胰蛋白胨5、玉米桨15、 MgSO4'7H2O0.5、 K2HP041， pH7.0， 37°C， 200rpm的条件下培养16h，冷冻离心，制得发酵液上清液，即为粗酶液。 将粗酶液进行浓縮后，按酶液:酒精-4:l(V:V)比例添加酒精，将沉淀后的蛋白冷 冻干燥，即得粗酶粉。
实施例3酶反应
使用实施例2的粗酶粉，以0.2U/mL加入到含谷氨酰胺0.02M、乙胺0.15M 的100mM硼酸钠缓冲液(Na2B407-NaOH、 pHIO)中，在37。C下进行2小时的 酶反应，合成了茶氨酸。
实施例4茶氨酸产量的测定
将实施例3中进行的酶反应液经TCA沉淀、稀释，通过安捷伦液相色谱仪， 分别对茶氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸进行定量。分析条件如下仪器型号AgllOO， 色谱柱(250X4.6) mm 5pm ODS HYPERSIL，柱温40°C。
实施例5芽孢杆菌SK 11.004培养条件的优化
本发明人等研究了使用实施例1中的培养基以外的培养基进行枯草芽孢杆 菌SK11.004的培养。在研究了麦芽糖、乳糖、蔗糖、淀粉、糊精、果糖、谷氨 酸钠等碳源后，结果发现，使用蔗糖时发酵液上清液酶活最高。在研究了鱼粉
蛋白胨、胰蛋白胨、大豆粕、柠檬酸钠、谷氨酸钠、尿素、(NH4)2S04等氮源后，
结果发现，使用胰蛋白胨可以达到最佳效果。同时研究了蔗糖、胰蛋白胨和玉 米浆最佳浓度比后发现，蔗糖、胰蛋白胨和玉米浆分别为25g/L、 5g/L、 15g/L 的条件下，可得到酶活达4U/mL的发酵液。
实施例6使用来自枯草芽孢杆菌SK 11.004的发酵液上清液的酶反应条件 的最优化。按照实施例3中的酶反应条件，研究了使用来自枯草芽孢杆菌SK 11.004的发酵液上清液时的最适酶反应条件，发现使用20mM谷氨酰胺与 200mM乙胺，在37。C， pH 10条件下反应2时可得到最大收率80%的茶氨酸。
实施例7精制茶氨酸。从反应液中分离精制茶氨酸是先通过减压浓縮除去乙胺后，再依次使用001x7(732)强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，201x7(717) 强碱性阴离子交换树脂，和乙醇处理得到。
权利要求
1.一株产生γ-谷氨酰转肽酶的菌株，其分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)SK11.004，已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NOM 208083。
2、 一种天然茶氨酸的制备方法，其特征在于，(1) 制备粗酶粉-使用枯草芽孢杆菌SK11.004为出发菌株；培养基，以g/L计为蔗糖25、胰蛋白胨5、玉米浆15、 MgSO4.7H2O0.5、 K2HP04 1， pH7.0; 37°C， 200 rpm的条件下培养16 h;冷冻离心，制得的发酵 液上清液，即为粗酶液；将粗酶液进行浓縮后，按酶液:酒精体积比4:1的比例添加酒精进行沉淀， 将沉淀后的蛋白冷冻干燥，即得粗酶粉；(2) 酶反应制备天然茶氨酸使用制得的粗酶粉，以0.2U/mL加入到含谷氨酰胺0.02M、乙胺0.15-0.25M 的pH9 10.5、 100mMNa2B4O7-NaOH硼酸钠缓冲液中，在35 4(TC下进行2 小时的酶反应，合成了茶氨酸；(3) 茶氨酸的精制将酶反应液通过减压浓縮除去乙胺后，再依次使用 001x7的732强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，201x7的717强碱性阴离子交换 树脂，和乙醇处理得到茶氨酸的精制品。
全文摘要
天然茶氨酸的制备方法，属于生物工程技术领域。本发明从中国传统发酵食品中分离筛选到的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SK11.004菌株是一株产谷氨酰转肽酶的茶氨酸生产菌，保藏编号CCTCC NOM 208083；将γ-谷氨酰转肽酶作用于谷氨酰胺和乙胺，在pH 10的条件下，能高效地生产茶氨酸。本发明的酶法制备茶氨酸的方法具有反应时间短、酶活性源制备简单、能使茶氨酸的生产简单，以及产品安全可靠的优点，适于进行大规模工业化生产。
文档编号C12N1/20GK101343618SQ20081002118
公开日2009年1月14日 申请日期2008年8月19日 优先权日2008年8月19日
发明者帅玉英, 涛 张, 波 江 申请人:江南大学