专利名称：：一种表达人cdc25b3质粒及其构建方法
技术领域：
：本发明属于生物化学中基因工程
技术领域：
，特别涉及一种表达人CDC25B3质粒及其构建方法。二
背景技术：
：现有技术CDC25家族是一组在细胞周期调控中发挥巨大作用的苏/酪氨酸双功能酶，CDC25B(cdldivisioncycle25homologB)是CDC25双功能磷酸酶家族重要成员之一。CDC25B基因位于人类染色体20p13,由M期诱导结构域和疏氰酸生成酶结构域构成。不同的剪切方式可产生不同的剪切体，迄今为止一共发现5种CDC25B的mRNA，但只发现3种CDC25B蛋白(CDC25B1、CDC25B2、CDC25B3)，三种剪切体有约95.5%的序列是一致的。CDC25B对细胞周期的正常运行起着重要的生物学作用，整个细胞周期都能监测到CDC25B的mRNA的转录。它不仅对细胞周期的S期起推进作用，还对G2/M期过渡起"4M几，，作用，对G2/M期起检验点作用。胎鼠肝脏中过量表达CDC25B，敲除CDC25B的雌性小鼠丧失了生育能力，提示CDC25B可能与胚胎发育和卵细胞的发育相关。目前已有相当的研究表明，在多种人类恶性肿瘤中，如前列腺癌、食管磷状细胞癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胰腺癌、头颈部肿瘤、胃癌、肺非小细胞癌、结肠癌、非霍奇金淋巴瘤、神经母细胞瘤、曱状腺癌等都均存在不同比例CDC25B的过度表达。其中在乳腺癌、卵巢癌(30%)及结直肠癌(43%)的研究中发现过量表达的CDC25B与肿瘤的恶性度，转移及患者的预后相关。在非霍奇金瘤的研究中，CDC25B2的报道在56y。的样本中过度表达，虽然未发现与肿瘤的侵袭性及患者预后相关，但与患者死亡率相关。在曱状腺恶性淋巴瘤的研究中发现CDC25B过量表达率为63.80/。，远远高于慢性甲状腺炎，提示在CDC25B甲状腺恶性淋巴瘤转化中发挥着重大作用。食道磷状细胞癌的研究中，研究者发现高CDC25B的患者对放疗高度敏感，高表达CDC25B是否与不良预后相关目前还没有定论。在食道癌细胞林的研究中发现过量表达CDC25B可以增强射线所诱导刁亡的效应。文献报道在胃癌中高达49%的标本中有CDC25B过度表达且与肿瘤分期、浸润的深度、淋巴结转移呈正相关。在早期子宫内膜癌中过量的CDC25B(90%)与ER-a(65%)是相关的，而在晚期子宫内膜癌中CDC25B表达仅为42%，而ER-a则降为17。/。。可见在子宫内膜癌发生的早期CDC25B与ER-a可能有协同刺激转化的作用。在前列腺癌中CDC25B过度表达率高达97。/。，过度表达的CDC25B可增强雄激素的转录激活作用，有助于前列腺癌向非雄激素依赖性生长转化。在肺非小细胞癌、头颈部肿瘤、神经母细胞瘤的CDC25B的表达率为40%、50%、85%。这些都表明CDC25B过度表达对于肿瘤的发生、发展有关键性作用，可能是潜在的诊断标记和治疗靶点，CDC25B与胰腺癌的关系目前研究还比较少，GuoJ等研究发现CDC25B在胰腺癌原发灶和转移灶及正常胰腺的表达分别为48.6±16.3%、71.7±3.1%、8.3±1.8%,显然CDC25B在胰腺癌组织中是过度表达的，而且转移灶的表达明显高于原发灶。CDC25B特异性抑制剂作用于高表达CDC25B的人胰腺癌细胞林发现，抑制剂可以明显抑制该细胞眛的生长并发生G2/M期阻滞。我们的研究中，通过寡核苷酸基因芯片技术发现，CDC25B基因在24例胰腺癌组织中，有20例(83.3%)表达上调，与正常组织相比，其在胰腺癌中表达明显增高；通过Westemblot发现，所有正常胰腺组织只有很弱、甚至没有CDC25B的蛋白表达，而胰腺癌组织中则有较强的CDC25B蛋白表达。经过计算机扫描后定量分析，正常胰腺组织。00258蛋白表达为1.22±0.33,胰腺癌组织为5.56士1.57，上调4.56倍。细胞实验中，我们通过对四种胰腺癌细胞抹中CDC25B的三种剪切异构体的研究发现，在转录水平，Panc-1中CDC25B1与CDC25B2的表达强度无明显差异；CFPAC-1和SW-1990的CDC25B2的表达高于CDC25B1;而Bxpc-3的CDC25B1的表达强度高于CDC25B2，CDC25B3在四种胰腺癌细胞林中表达均不显著。Westernblot结果提示CDC25B蛋白在Panc-l和CFPAC-l过度表达，SW-1990的表达强度中等，Bxpc-3弱表达或不表达CDC25B蛋白。上述结果表明CDC25B1和CDC25B2在四种胰腺癌细胞抹中过表达，而CDC25B3与胰腺癌关系尚不明了。
发明内容技术问题本发明提供一种表达人CDC25B3质粒及其构建方法，该质粒转染低表达CDC25B蛋白的肿瘤细胞可以使CDC25B蛋白高表达，可以用于探讨CDC25B3基因的潜在致癌机制，在医学上具有重要的应用价值；同时本发明也提供了该质粒的构建方法。我们希望通过构建CDC25B3的重组质粒，随后进行体外实验，将质粒转染低表达CDC25B蛋白的胰腺癌细胞抹，观察转染前后细胞生物学行为发生的变化，探讨CDC25B3在胰腺癌发病过程中潜在机制。另外，因为CDC25B在多种人类肿瘤中存在过度表达，我们可以利用上述方法，将此类质粒用于其他人类肺瘤的研究上，以深入研究和阐明CDC25B基因在人类肿瘤发生发展中所充当的角色。因此，本发明的应用不局限于胰腺癌，可广泛应用于CDC25B在人类肿瘤的研究探讨上.技术方案本发明的技术解决方案为一种表达人CDC25B3的质粒，该质粒是含有CDC25B3的栽体pcDNA3.1(+)，其中CDC25B3具有SEQIDNO:l所示的核苷酸序列，可由pcDNA3.1(+)中的PCMV启动子表达。一种构建权利要求1所述质粒的方法，构建步骤为以CDC25B1的cDNA全长克隆IRATp970A0662D为模板，PCR定向扩增剪切异构体CDC25B3的a片段和b片段；设计两对引物引物1:5-AGGGGCCCTCTAGACTCGAGATGGAGGTGCCCCAGCCG-3引物2:5-TTGGTACCGAGCTCGGATCCTCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCCTGGTCCTGCAGCCGGCTAC陽3引物3:5-CATGGCATCTTGAAGACAAATCCATCCGGCATAGACTGGAAGCGTC-3引物4:5-GACGCTTCCAGTCTATGCCGGATGGATTTGTCTTCAAGATGCCATC-3以IRATp970A0662D为模板，用PCR方法，用引物1和3克隆CDC25B3的a片段，引物2和4克隆CDC25B3的b片段；获得CDC25B3基因的CDS区全长用PCR扩增的方法，用引物1和引物2对片段a和b进行拼结，得到CDC25B3基因的CDS区全长；获得重组质粒pcDNA3.l-CDC25B3:首先对质粒pcDNA3.1(+)进行改造，用BamHI和XhoI酶切质粒pcDNA3.1(+)，得到文造的线性化质粒片段，再将PCR扩增产生的CDC25B3基因用T4连接酶与改造后的线性化质粒片段连接，获得重组质粒pcDNA3.1-CDC25B3。有益效果基因的制备途径有如下几种方式①制备基因组DNA文库，通过杂交筛选获得特定的基因片段；②制备cDNA文库，通过杂交筛选获得特定的基因片段；③直接用限制酶从基因组DNA或其他重组质粒上切取目的基因片段；用PCR技术体外扩增有关DNA片段；⑤用化学方法合成目的基因片段。本发明中，我们直接从RZPD公司购买了CDC25Bl的cDNA全长克隆并用PCR的方法大量获得目的片段，而且可在上下游引物的5'端引入不同的酶切位点而实现定向克隆获得其灵两个剪切异构体。我们认为这是一种快速、高效、大量获得目的片段的方法，并且可有效的避免由于逆转录而造成的碱基错配。同时，本发明所用的pcDNA3.1(+)质粒是一种哺乳动物细胞表达载体，属于氨节青霉素抗性选择系统，带有氨卡青霉素抗性基因Ampr,在PCMV启动子驱动下可在真核细胞中表达，其编码产物能使新霉素类似物G418失活，故用G418筛选可获得导入有表达栽体的阳性细胞克隆；在pcDNA3.1(+)质粒的多克隆位点上游有一个PCMV启动子，插入到多克隆位点的外源性基因在该启动子的驱动下可以得到有效表达；另外把基因的羧基端融合有标记肽FLAG,非常方便用于免疫反应的检测以及作为诱斜蛋白检测酵母双杂交结果。因此，利用该载体方便用于筛选和鉴定。四图1为pcDNA3.1(+)质粒图谱图2为PCR鉴定pcDNA3.1-CDC25B3阳性克隆，Marker的条带依次是2kb、lkb、750bp、500bp、250bp、100bp。图3为CDC25B3外源表达Westernblot图，1、4转染的质粒量为0.5pg,2、3转染的质粒量为3吗，5与6为对照组。Westernblot检测结果显示，CDC25B3在瞬时转染pcDNA3.1-CDC25B3载体的293T细胞中的过量表达，提示本重组质粒的构建是成功的，可用于进一步实验研究。图4为重组质粒pcDNA3.1-CDC25B3的测序结果。图5正常SW-1990图6转染空质粒pcDNA3.1图7稳定转染pcDNA3.卜CDC25B3图8芯片电泳模拟图显示CDC25B3mRNA的表达差异图9转染前后CDC25B蛋白在SW-1990中的表达差异五具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实^r方法，通常按照常规条件如JoeSambrook、DavidRussell等人，《MolecularCloning:ALaboratoryManual》3rded(ColdSpringHarborLaboratoryPress2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例l:1.重组质粒pcDNA3.1-CDC25B3的构建1.1以本实验室保存的从RZPD公司购买的CDC25B1的cDNA(IRATp970A0662D)为模板；1.2以IRATp970A0662D为模板，利用引物l和3从扩增CDC25B3的a片段，2和4扩增CDC25B3的b片段。A.反应体系a片段试剂Primer(-)P30牟Primer(+)Pl0牟ddH2013単10xbuffer2DNTPs(2.5mM)0単pftipolymerase0.2pl模板(10ng/ul)1Total20nlb片段试剂Primer(-)P40.4^1Primer(+)P20.4nlddH2013単10xbuffer2piDNTPs(2.5mM)0.8nlpfUpolymerase0.2jil模板(10ng/ul)1piTotal20plB.反应条件PCR仪进行反应，按以下循环条件94°C30sec94°C30sec60°C30secf30cycle72°C30sec72。C6min1.3分离纯化a片段和b片段将上述混合的反应物置于37°C，lh后，电泳鉴定反应产物，用PCR产物纯化试剂盒回收，获得纯化的a片段和b片段，在紫外分光光度仪测定其浓度和纯度，-20'C保存备用。1.4a片段与b片段的拼接为得到CDC25B3的全长，需采用PCR扩增的方法对片段a与b进行拼接，模板为上一轮回收的PCR产物。PCR扩增，反应体系为5(VL:<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>酶切PCR片段和载体使用BamHI和XhoI进行酶切消化上一轮的PCR产物和载体，酶切产物用DNA纯化试剂盒纯化，在紫外分光光度仪测定其浓度和纯度后，-2(TC保存。①酶切反应A.反应体系在0.5mlEppendorf管中加入下列试剂酶切载体纯化的DNA质粒(1ug/nl)2pi10xbuffer5nllOOxBSA0.5piBamHI(10U1)1WXhol(10U/nl)1piH2040.5piTotal50pi酶切PCR产物:纯化的DNA质粒(1ug/pl)2nllOxbuffer5pllOOxBSA0.5piBamHI(10,)1^Xhol(10U/'ul)1piH2040.5piTotal50^B,反应条件37"C作用lh后，电泳确证酶切产物。酶切产物用DNA纯化试剂盒纯化，在紫外分光光度仪测定其浓度和纯度后，-20。C保存。1.6连接反应A.反应体系在0.5mlEppendorf管中加入下列试剂酶切回收的载体DNAlOOng/pl1pi酶切回收的PCR产物lOOng/pl110xT4嘆菌体DNA连接酶缓冲液1^T4噬菌体DNA连接酶1piddH206piTotal10(ilB.反应条件4'C作用12h，获得重组pcDNA3.1-CDC25B3表达质粒。实施例2:重组质粒转化大肠杆菌2.1感受态细菌制备(略)2.2阳性克隆的筛选与鉴定'(1)阳性克隆的筛选(略)(2)阳性克隆的PCR鉴定重组阳性克隆行PCR鉴定，PCR产物于琼脂糖凝胶中电泳，有535bp左右长度插入片段释放出者视为阳性重组体。(3)阳性克隆核酸测序鉴定从上述方法鉴定的克隆中任选2个克隆，接种于培养基上制备新鲜菌液，测序鉴定插入片段的正确性。实施例3:细胞培养和重组质粒共转染3.1293T细胞的培养和铺种3.2细胞瞬时转染3.3有限稀释法筛选高效表达CDC25B3的阳性细胞克隆实施例4:CDC25B3蛋白表达的检测Westernblot检测CDC25B3蛋白在293T细胞中的表达实施例5:为说明CDC25B3在肿瘤研究方面的应用，以胰腺癌为例进行如下实验1.细胞转染1.1G418浓度梯度试验G418筛选阳性克隆前要做浓度梯度试验确定最佳筛选浓度。1)胰酶消化细胞成细胞悬液，稀释至1,000cell/mL。2)24孔板中取20个孔，每孔加入100nL的细胞悬液及无双抗的培养基900nL。3)将每孔中的G418浓度稀释至0、200、300、400、500、600、700、800、900、1，00(Vg/mL等10个级别。4)每35天换液，培养10天，记录细胞全部死亡的最低浓度。以细胞全部死亡的最低浓度加一个级别为筛选浓度。1.2转染细胞1)取处于对数生长期的SW-1990细胞，弃去细胞液，加2mlPBS洗一次。2)加1ml月夷酶消4匕12min。3)弃去胰酶，加3-4mlDMEM(不含血清)吹打均匀。4)将细胞滴加于6孔培养板中(每孔2ml),使培养24h后，细胞融合度控制在70~80%。5)对于6孔板的每个孔，培养液体积调整为1ml,用2pgCDC25B3DNA质粒与240piOpti-MEMI混合。6)将LipofectAMINE2000试剂轻柔摇匀，取5LipofectAMINE2000试剂在另一管中与i245plOpti-MEMI混合，在室温下温育5min。7)把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine2000进行混合，轻轻地颠倒混匀，不要振荡。必须在5min之内混合。8)混合后，在室温下温育20min，以便形成质粒DNA与LipofectAMINE2000稀释液的转染复合物。9)把质粒DNA与LipofectAMINE2000的混合液加入培养细胞，轻柔前后推摇培养板以混匀液体。然后将培养板送入细胞培养箱。10)在转染满8h后需更换新鲜的含血清的培养液。11)转染后36h后，然后1:2-3比例传代，同时加G418筛选，浓度为500jig/mL12)二周后待单克隆细胞岛形成后，胰酶消化细胞重新铺板并改G418维持浓度为100pg/ml稳定培养传代。1.3以RT-PCR和Westernblot检测CDC25B3在SW-1990中的表达100pg/mlG418维持培养转染细胞SW-1990二周，传代5次后行RT-PCR和Westernblot检测(方法同前)。实施例6:G418浓度梯度试验结果以400jig/mL的G418浓度培养，SW-1990细胞在10天时间细胞全部死亡。500ng/mL应为SW-19卯细胞合适的筛选浓度。实施例7:RT-PCR产物芯片电泳鉴定结果CDC25B3的mRNA的表达丰度为33.21±5.67，而正常细胞和转空质粒组CDC25B3的mRNA表达丰度只有1.957±0.112和1.645±0.242。转染组CDC25B3mRNA的表达约为转空质粒组的20倍(P<0.05)，如图5所示。说明本质粒可成功在胰腺癌细胞中转录，为进行下一步细胞生物学实验奠定了基础，可用来探讨CDC25B3在胰腺癌发生发展中的作用。实施例8:100ng/mlG418维持培养二周后，与转染空质粒和正常细胞相比，Westernblot检测转染组中CDC25B3蛋白表达升高，并明显高于转空质粒组和正常细胞组(图6)。说明本质粒可成功在胰腺癌细胞中表达，为进行下一步细胞生物学实验奠定了基础，可用来探讨CDC25B3在胰腺癌发生发展中的作用。序列表<110>东南大学<120>—种表达人CDC25B3质粒及其构建方法<160>5<210〉1<211>3578<212>DNA<213〉人工序列<220〉<221>CDS<222>(1)".(3578)<400>11GCAGCCAGTCGCGGAGGCGGGGAGGCTGCGCGGTCAGAGGCGCCTGGAGCGAGCGAATCC61TGGCCCACCGCCTGCCCAACCGCGTGACCTTGATTGAGTTAATGAACTTCACGCCTCAGC121GTCCAGGTCTGTAAAATGGGGTGTCTAACGCAGACCGTACAGCCCAGCTGGGTTTAGCAA181ACTTCCGGGAGCCAGTTGGAGCCTCTCCCCATCCCTAGCGGTGATCCCAGGTGACGACAT241GCCGCGGGGGGTCCTGCGGAGGCCACCCTAGGGCGTTGCTGCTGCCTTTGGGAGTGTGGA301GCTCCAAACCATGTCGCGAGAGGCGGATTTTGGGAGGCCGGGATCCTCGCGCCAGGGGGA361TGTGCGAGGGTGTGGGATAAATCTTAATTCCTCCGGCCCACCCAAAGCCTGGAAATCCAG421CCTCCGCGCCTCTTGCCCTGCGGGCCCCGCCCTCAGTCCCGCCCTCATCTAACCCGCTAC481CCCATTGGTGGCGTCCGGCGGCGCGGCTGCTGTTATTTTTCGAATATATAAGGAGGTGGA541AGTGGCAGCTGCAACTAGAGGCTTCCCTGGCTGGTGCCTGAGCCCGGCGTCCCTCGCCCC601CCGCCCTCCCCGCATCCCTCTCCTCCCTCGCGCCTGGCCCTGTGGCTCTTCCTCCCTCCC661TCCTTCCCCCCCCCCCCACCCCTCGCCCGCTGCCTCCCTCGGCCCAGCCAGCTGTGCCGG721CGTTTGTTGGCTGCCCTGCGCCCGGCCCTCCAGCCAGCCTTCTGCCGGCCCCGCCGCGAT781GGAGGTGCCCCAGCCGGAGCCCGCGCCAGGCTCGGCTCTCAGTCCAGCAGGCGTGTGCGG841TGGCGCCCAGCGTCCGGGCCACCTCCCGGGCCTCCTGCTGGGATCTCATGGCCTCCTGGG901GTCCCCGGTGCGGGCGGCCGCTTCCTCGCCGGTCACCACCCTCACCCAGACCATGCACGA961CCTCGCCGGGCTCGGCAGCGAAACCCCAAAGAGTCAGGTAGGGACCCTGCTCTTCCGCAG1021CCGCAGCCGCCTGACGCACCTATCCCTGTCTCGACGGGCATCCGAATCCTCCCTGTCGTC1081TGAATCCTCCGAATCTTCTGATGCAGGTCTCTGCATGGATTCCCCCAGCCCTATGGACCC1141CCACATGGCGGAGCAGACGTTTGAACAGGCCATCCAGGCAGCCAGCCGGATCATTCGAAA1201CGAGCAGTTTGCCATCAGACGCTTCCAGTCTATGCCGGATGGATTTGTCTTCAAGATGCC1261ATGGAAGCCCACACATCCCAGCTCCACCCATGCTCTGGCAGAGTGGGCCAGCCGCAGGGA1321AGCCTTTGCCCAGAGACCCAGCTCGGCCCCCGACCTGATGTGTCTCAGTCCTGACCGGAA1381GATGGAAGTGGAGGAGCTCAGCCCCCTGGCCCTAGGTCGCTTCTCTCTGACCCCTGCAGA1441GGGGGATACTGAGGAAGATGATGGATTTGTGGACATCCTAGAGAGTGACTTAAAGGATGA1501TGATGCAGTTCCCCCAGGCATGGAGAGTCTCATTAGTGCCCCACTGGTCAAGACCTTGGA1561AAAGGAAGAGGAAAAGGACCTCGTCATGTACAGCAAGTGCCAGCGGCTCTTCCGCTCTCC1621GTCCATGCCCTGCAGCGTGATCCGGCCCATCCTCAAGAGGCTGGAGCGGCCCCAGGACAG1681GGACACGCCCGTGCAGAATAAGCGGAGGCGGAGCGTGACCCCTCCTGAGGAGCAGCAGGA1741GGCTGAGGAACCTAAAGCCCGCGTCCTCCGCTCAAAATCACTGTGTCACGATGAGATCGA1801GAACCTCCTGGACAGTGACCACCGAGAGCTGATTGGAGATTACTCTAAGGCCTTCCTCCT1861ACAGACAGTAGACGGAAAGCACCAAGACCTCAAGTACATCTCACCAGAAACGATGGTGGC1921CCTATTGACGGGCAAGTTCAGCAACATCGTGGATAAGTTTGTGATTGTAGACTGCAGATA1981CCCCTATGAATATGAAGGCGGGCACATCAAGACTGCGGTGAACTTGCCCCTGGAACGCGA2041CGCCGAGAGCTTCCTACTGAAGAGCCCCATCGCGCCCTGTAGCCTGGACAAGAGAGTCAT2101CCTCATTTTCCACTGTGAATTCTCATCTGAGCGTGGGCCCCGCATGTGCCGTTTCATCAG2161GGAACGAGACCGTGCTGTCAACGACTACCCCAGCCTCTACTACCCTGAGATGTATATCCT22212281234124012461252125812641270127612821288129413001306131213181324133013361342134813541GAAAGGCGGCCCGGCCCATGCAGCTGGGCTGGCCTGCGCCGGCCTGCCGGGGGTGTCCTGTCCTGGTGCCACCAGCTTAAACCCTTCATCGAGAGCCGTGTCTCTGCCCTTGTCTGCCATAGCCTGAACATGACTTTACGAGTTACCCACTCCCAGGGCAGTGAACCCTGGTTGGATGGAAACCAGGTGGTTTGTGTGGAGAAGCAGCTAGCTGTGCTTGCAAGTTGAGATACAAGGAGTAACCACGAGGGGGGAGCGGAAGTCCTGCTAGCTGAGGGCCCCTGTCTGCCCCCCACCCCTAGGCAGTATTTTCCTGTGTCGTCCCTGAGGGTGTACTTCCGTTGCCCCTTGAAGCTCTTACCCATCTCAGTCGGTCCCAGAGGGTTAAGGGGGCCTGACTTGGGTGGATGGAGCGTTTTGCAAAAATATTAACCAAGGACAAGGCCCTGCAAAAAAAAAATCTTCCCTCACCTTCAAGGAGCCGGCGGGACCTCCCTTGCTGCTGGAGGCCCAGCCCAGAGGAAGAGCCCTTGTGTCCTCCTGAAACGCTATGGGTCAGACGGGCCAGGGTCTCTTTTCCCTCTTTCCTAGACACTTCCGTTTTGTTGCCCCTGAATCATGCTCAGAACTGCCGTGGATGTTGAGCATGATACACTTAGG1iN_^丄TGAGTCATCTAAAAAAAAAAGCACCCGAACTGAGCTAAAGGCTCTGTAGCCTTTCGAGGCCTCAGGTGCTTTCCCCTGTGAGTCTGTTGACAGGAGCTTCCCTTTGTGTGGCTAAACTCCCTGCCCCTAACCTTTCCTGTTTTCAGTGTTTAGACTGTTTCCAGAAAGGGGAGCCTGCTGTGCTGCTGTCGCCGTGGMGCAGCCTGCAGGTTTGGAGCT\JJ>%_1%_JJ1丄丄V_上\JGTTAGGGCCTAAAAAAAATTCTGTGAACACCTTCCGCCCGGCTGCAGGCTGAAGCCAGGTCCATGGGATCATCCCATCGTTAGTTAAGTTGTTTCCTTTGTGTCAGCTTTCCTGGCCTTCTCTGTAGGCCCACCATACACCTG丁GTGCAGGTTCCCCTATGTTATTATGAAGCCCAGCTTGTTGCGGACGCAGTGCCTCAGGAATATAATTCAAGAGGTGGTTCAATACCCAGGACTATCAAGACTCGACCAGTGAGGCTGCCCTATGAAGATGGTGTATTTTCCATATTGGGTTAATGTTAGGGTTAGAGGCTGGGGGAGAGTCAGCAACCGTGGTAGAGCACCTCCTTGGTCTGTTGTCAAATATCCCTTGGGGGCCCCTACTGCTTGGATGGAAGTGCATACCCATGTGTGCCTAAAATGTCACA广广广广r17\「。丄vj^n^n。vjAAGCACTGAG<210>2<211>38<212〉DNA<213>合成引物<400>2AGGGGCCCTCTAGACTCGAGATGGAGGTGCCCCAGCCG<210>3<211>67<212>DNA<213〉合成引物<400>31TTGGTACCGAGCTCGGATCCTCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCCTGGTCCTGCAGC61CGGCTAC<210〉4<211>46<212>DNA<213>合成引物<400>41CATGGCATCTTGAAGACAAATCCATCCGGCATAGACTGGAAGCGTC<210>5<211>46<212>DNA<213>合成引物<400>51GACGCTTCCAGTCTATGCCGGATGGATTTGTCTTCAAGATGCCATC权利要求1.一种表达人CDC25B3的质粒，其特征在于该质粒是含有CDC25B3的载体pcDNA3.1(+)，其中CDC25B3具有SEQIDNO1所示的核苷酸序列，可由pcDNA3.1(+)中的PCMV启动子表达。2.—种构建权利要求1所述质粒的方法，其特征在于构建步骤为a.以CDC25B1的cDNA全长克隆IRATp970A0662D为模板，PCR定向扩增剪切异构体CDC25B3的a片段和b片段；b.设计两对引物引物1:5-AGGGGCCCTCTAGACTCGAGATGGAGGTGCCCCAGCCG-3引物2:5-TTGGTACCGAGCTCGGATCCTCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCCTGGTCCTGCAGCCGGCTAC-3引物3:5-CATGGCATCTTGAAGACAAATCCATCCGGCATAGACTGGAAGCGTC-3引物4:5-GACGCTTCCAGTCTATGCCGGATGGATTTGTCTTCAAGATGCCATC-3以IRATp970A0662D为模板，用PCR方法，用引物1和3克隆CDC25B3的a片段，引物2和4克隆CDC25B3的b片#殳；c.获得CDC25B3基因的CDS区全长用PCR扩增的方法，用引物1和引物2对片段a和b进行拼结，得到CDC25B3基因的CDS区全长；d.获得重组质粒pcDNA3.1-CDC25B3:首先对质粒pcDNA3.1(+)进行改造，用BamHI和XhoI酶切质粒pcDNA3.1(+),得到改造的线性化质粒片段，再将PCR扩增产生的CDC25B3基因用T4连接酶与改造后的线性化质粒片段连接，获得重组质粒pcDNA3.1-CDC25B3。全文摘要一种表达人CDC25B3的质粒，该质粒是含有CDC25B3的载体pcDNA3.1(+)，其中CDC25B3具有SEQIDNO1所示的核苷酸序列，可由pcDNA3.1(+)中的PCMV启动子表达。一种构建表达人CDC25B3的质粒的方法。本发明提供一种表达人CDC25B3质粒及其构建方法，该质粒转染低表达CDC25B蛋白的肿瘤细胞可以使CDC25B蛋白高表达，可以用于探讨CDC25B3基因的潜在致癌机制，在医学上具有重要的应用价值；同时本发明也提供了该质粒的构建方法。文档编号C12N15/85GK101358199SQ20081002071公开日2009年2月4日申请日期2008年2月22日优先权日2008年2月22日公开号200810020713.9发明者卫文俊,波孔,齐张,杨正平,欣石,志肖申请人:东南大学被以下专利引用(1),