专利名称：肉鸽性别鉴定方法
技术领域：
本发明属于分子生物学技术领域。
技术背景目前，雏鸽的性别有根据初生重、脚趾长短比较、翻缸等经验与方法判 断，缺乏科学依据的同时，准确率也不高。鸟类的CHD基因，即染色体螺旋蛋白基因(chromo-helicase-DNAbinding gene)位于性染色体上，在非平胸鸟类中存在两个同源拷贝CHD-W和CHD-Z， 其中CHD-W为W连锁，CHD-Z为Z连锁。在大多数鸟类，此基因的外显子高 度保守，而内含子在两性间突变较大，因此可以根据公母间内含子长度不同 进行性别鉴定。由于肉鸽雌性为ZW型，雄性为ZZ型，因此根据内含子两端外显子设计 跨内含子的上下游引物，进行PCR扩增，再对PCR产物进行电泳检测时，在 雌性可以得到不同长度的片段，而在雄性只能得到相同长度的片段。Griffiths 等(1998)根据CHD基因设计了P2、 P8引物对，证实可以鉴定笑翠鸟、欧洲 食蜂鸟、深红玫瑰鹦鹉、雨燕、鸡、八哥、蓝冠山雀等27种鸟类的性别。另 外，鸟类性别鉴定所用的基因组DNA大多是从血液样本中提取，易对动物造 成伤害。发明内容本发明的目的是提供一种简单、准确、快速、无伤害的肉鸽性别鉴定方法。本发明的技术方案是通过原鸡和小天鹅CHD基因内含子两端的外显子 序列比对，在两端外显子上分别设计上下游引物Psf : 5，CAAGGATGAGAAACTGTGCAA3，； Psr: 5， GAATATCTTCTGCTCCTACTG3，； 再以Psf/Psr引物扩增肉鹆羽髓基因组DNA的Z和W染色体上的CHD基因， 最后经过10%聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染，根据带型判断性别，其中雌性为 两条带，雄性为一条带。本发明利用CHD基因内含子在Z、 W染色体上长度差异，设计跨内含 子引物，根据PCR扩增产生不同的带型来判断肉鸽的性别。本发明只需掌握 一般的PCR技术和聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染操作，就可进行鉴定，重复性 强，准确率高(100%， n=280)。另夕卜，本发明利用羽髓提取肉鹆基因组DNA， 再经过PCR扩增进行性别鉴定，能将对肉鸽的伤害减到最小，并能尽早准确 判定肉鸽性别，不仅有利于肉鸽育种计划的进行，还有利于肉鸽的集约化生 产，提高肉鸽经济效益。本发明在对肉鸽羽髓基因组DNA W和Z染色体上CHD基因内含子进 行扩增时，采用10ul体系取1 ul 10XPCRBuffer、 1.5mMMgCl2、 200pM dNTP、 5pmo1引物、100ng肉鸽羽髓基因组DNA和0.5U Taq DNA聚合酶，加双蒸水补至iow。另，本发明肉鸽羽髓基因组DNA的提取方法是取肉鹆颈部或翅部羽 毛，将末端羽髓部剪碎，置于1.5ml指形管，加600^1裂解液，37"C处理3h; 然后加入5"蛋白酶K， 55'C水浴过夜后，再加入等体积的Tris饱和酚、等 体积酚-氯仿-异戊醇和等体积氯仿-异戊醇各抽提1次；得到的上清用2.5倍 体积冷无水乙醇沉淀DNA， 70°/。冰乙醇洗两次，室温干燥，300lUTE37。C 溶解过夜，4"C保存备用。
图1为肉鸽CHD基因PCR扩增产物电泳图。
具体实施方式
1、肉鸽羽髓DNA的提取(1)取肉鸽颈部或翅部羽毛3-5根，将末端羽髓部剪碎，置于1.5ml指形管，力Q 600jil裂解液(50m MTris-HCl， lOOMm EDTA, lOOMm NaCl， 0.5% SDS,pH8.0)， 37t:处理3h，然后加入5 u 1蛋白酶K (20mg/ml)， 55。C水浴 过夜；(2) 加入等体积的Tris饱和酚，温和摇动30min， 12000rpm离心10min， 吸取上清液于1.5ml离心管内；(3) 加入等体积酚-氯仿-异戊醇(25: 24: 1)，温和摇动10min， 12000rpm 离心10min，吸取上清于另一干净离心管内；(4) 加入等体积氯仿-异戊醇(24: 1),温和摇动10min， 12000rpm离 心10min，吸上清于另一干净离心管内；(5) 2.5倍体积冷无水乙醇沉淀DNA， 70%冰乙醇洗两次，室温干燥， 300ulTE37'C溶解过夜，4"C保存备用。2、 设计引物通过原鸡和小天鹅CHD基因内含子两端的外显子序列比对，在两端外 显子上分别设计上下游引物Psf: 5， CAAGGATGAGAAACTGTGCAA3，； Psr: 5' GAATATCTTCTGCTCCTACTG3'3、 用得到的基因组DNA为模版进行PCR扩增PCR扩增采用10u l体系10XPCRBuffer 1 u l、MgCl2 1.5mM、dNTP200 u M、引物Psf/Psr各5 pmol、模版DNA 100ng、 Taq DNA聚合酶0.5U，加 双蒸水至10ul。扩增程序为94°C/4min; 94°C/30s， 56°C/55s， 72。C/30min， 35个循环；72°C/10min， 4。C保存。4、 10。/。PAGE胶(聚丙烯酰胺凝胶)电泳检测、银染10%PAGE胶120V电泳6h，然后银染，根据显色的带型判断性别雌 性为两条带，雄性为一条带，准确率高达100%。通过切胶回收、克隆测序发现，扩增的片段长度分别为CHD-Z 264bp， CHD-W 244bp (见图1)。<110>扬州大学<120>肉鸽性别鉴定方法 <160〉2<210>1 <211>21 <212〉DNA <213>人工序列<220>〈223〉利用CHD基因内含子在Z、 W染色体上长度差异，设计跨内含子引物<400>1caaggatgag aaactgtgca a<210>2 <211>21 <212>DNA <213>人工序列<220>〈223〉利用CHD基因内含子在Z、 W染色体上长度差异，设计跨内含子引物<400>2gaatatcttc tgctcctact g
权利要求
1、一种肉鸽性别鉴定方法，其特征在于通过原鸡和小天鹅CHD基因内含子两端的外显子序列比对，在两端外显子上分别设计上下游引物Psf5’CAAGGATGAGAAACTGTGCAA3’；Psr5’GAATATCTTCTGCTCCTACTG3’；以Psf/Psr引物扩增肉鸽羽髓基因组DNA的Z和W染色体上的CHD基因，经过10％聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染，根据带型判断性别，两条带为雌性，一条带为雄性。
2、 根据权利要求1所述肉鸽性别鉴定方法，其特征在于在对肉鸽羽髓基 因组DNAW和Z染色体上CHD基因内含子进行扩增时，采用lOul体系 取lullOXPCR Buffer 、 1.5mMMgCl2、 200jiM dNTP、 5pmo1引物、100ng 肉鸽羽髓基因组DNA和0.5UTaqDNA聚合酶，加双蒸水补至10^1。
3、 根据权利要求1所述肉鸽性别鉴定方法，其特征在于肉鹆羽髓基因组 DNA的提取方法是取肉鸽颈部或翅部羽毛，将末端羽髓部剪碎，置于1.5ml 指形管，加600(il裂解液，37。C处理3h;然后加入5lU蛋白酶K， 55。C水浴 过夜后，再加入等体积的Tris饱和酚、等体积酚-氯仿-异戊醇和等体积氯仿-异戊醇各抽提1次；得到的上清用2.5倍体积冷无水乙醇沉淀DNA， 70%冰 乙醇洗两次，室温干燥，300iUTE37。C溶解过夜，4。C保存备用。
全文摘要
肉鸽性别鉴定方法，属于分子生物学技术领域。通过原鸡和小天鹅CHD基因内含子两端的外显子序列比对，在两端外显子上分别设计上下游引物Psf5’CAAGGATGAGAAACTGTGCAA3’；Psr5’GAATATCTTCTGCTCCTACTG3’；再以Psf/Psr引物扩增肉鸽羽髓基因组DNA的Z和W染色体上的CHD基因，最后经过10％聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染，根据带型判断性别，其中雌性为两条带，雄性为一条带。本发明只需掌握一般的PCR技术和聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染操作，就可进行鉴定，重复性强，准确率高(100％，n＝280)。
文档编号C12Q1/68GK101333563SQ200810021280
公开日2008年12月31日 申请日期2008年7月23日 优先权日2008年7月23日
发明者丁家桐, 俞凤燕, 辉 刘, 曼 吴, 俊 孟, 舒 张, 潘孝青, 鹏 王, 秦志艳, 郑爱燕 申请人:扬州大学