专利名称：用于猪食道口线虫病诊断的多重pcr检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及猪食道口线虫病的诊断和检测技术领域，更具体地 说，涉及猪有齿食道口线虫和四棘食道口线虫的PCR检测试剂盒和检 测方法。
技术背景食道口线虫病是由食道口属(&S0p力^"O9to/K7/Z7)的多种线虫寄生 于动物肠道引起，因有些种的幼虫在肠壁内形成结节状病变，故有结 节虫之称，严重感染时可引起结肠炎。目前，此病在我国各地牛、羊、 猪中普遍存在，分布极其广泛，给畜牧业生产造成较大经济损失。虽 然食道口线虫通常只在反刍动物、猪和猴子上发现，但也有感染人的 报道，特别是在非洲的某些地区，有很高的感染率。因此，对食道口 线虫的研究，除对畜牧业生产有重要意义外，也具有重要的公共卫生 的意义。对寄生虫虫种的鉴别是寄生虫学研究的一个重要内容，对食 道口线虫的精确的分类鉴定，更易于有针对性地预防和控制食道口线 虫病。对猪食道口线虫病，国内目前主要是一些调査报道。调査表明，感染猪的食道口线虫主要是有齿食道口线虫(& t ，腿￡/672&&/ )禾口长尾食道口线虫(OeSOp/zagaS^OM/ZZ 7(9/7;g7'Cat/(3^ff)，国外称长尾食道口线虫为四棘食道口线虫(^so/ 力a卵s z^/w/历 做rfri邵i;n^^鹏)。两种食道口线虫形态相近，形态学方法分类有局限性，特别是对虫卵及幼虫形态学鉴定十分困难。长期以来多以传 统的形态学方法来鉴别食道口线虫，此种方法简单易行，对成虫有一 定的准确性，但对于形态上难于区别的发育期，特别是对虫卵和幼虫 阶段的虫体，形态学方法有时则具有局限性。因此，随着现代分子生物学的发展，国外许多学者应用了 PCR相关的一些技术如PCR、 PCR-RFLP， PCR-SSCP等来对食道口线虫进行分类研究，大大地促进 了食道口线虫分类学的发展，而国内未见相关研究的报道。在国外的一些研究中，rDNA，尤其是内转录间隔区(ITS)被认 为是发展敏感、特异的检测系统的理想靶物，rDNA的ITS-1和ITS-2 是种特异的遗传标记。有鉴于此，华南农业大学兽医寄生虫学研究室 对从国内不同地区猪体分离出来的食道口线虫的ITS序列进行PCR扩 增、测序和序列分析。但尚未见使用方便、特异性强的检测试剂盒研 制出来。在此基础上，本申请人根据序列分析结果，设计猪有齿食道口线 虫和四棘食道口线虫种的特异引物，优化反应体系和反应条件，期望 研制出猪食道口线虫病多重PCR诊断试剂盒，为猪食道口线虫的诊断 和防治等进一步研究奠定基础。 发明内容本发明一个目的是填补现有技术的空白，提供一种用于猪食道口 线虫病诊断的多重PCR检测试剂盒。本发明的另 一个目的是提供所述试剂盒的使用方法。 本发明的技术方案是提供一种用于猪食道口线虫病诊断的多重PCR检测试剂盒，含有(1) DNA裂解液;(2) PCR反应液；(3) 有齿食道口线虫DNA阳性对照和四棘食道口线虫阳性对照， 用来比较PCR产物以及监测PCR操作过程是否正确。所述DNA裂解液为lOOmM的NaCl、 pH8. 0的lOmM的Tris-Cl、 pH8. 0的25mM的EDTA、 1% (W/V)的SDS禾卩1. 7 y g/ w L的蛋白酶K 的混合溶液。所述PCR反应液为终浓度200MM的dATP、 dTTP、 dGTP、 dCTP， 终浓度0. 5pmol/" L的引物OdspF、 0dspR2、 OqspF、 OqspR， 3. 5mM 的MgCl2的混合溶液。针对有齿食道口线虫，设计引物为上游引物OdspF序列为5， -GCAACAGGTACCTTAGAGCTA-3，； 下游引物0dspR2序列为5， -TTGCAAATGACATGAAACTAC-3，。 针对四棘食道口线虫，设计引物为上游引物OqspF序列为5， -ACTAACGTTTTACATTTGGGA-3，； 下游引物OqspR序列为5， -CATTCGTGTACCTTAGACGTA-3，。本发明同时提供所述试剂盒的使用方法，包括以下歩骤(1) DNA的提取虫体样品用双蒸水反复吹打冲洗3次以上， 加DNA裂解液置温箱37。C消化过夜，提取DNA;(2) PCR扩增按照扩增样品数加3的数目，取PCR反应液、Taq酶混合于一离心管中，混匀，分装；将阴性对照液加入一个分装 管中，取各样品的DNA加入对应反应管中；取两种阳性对照分别加入 一反应管中，各反应管标记后离心混匀，置于PCR扩增仪上反应；(3) PCR产物观察取扩增后的PCR产物加样于1. 2%琼脂糖凝 胶上，电泳后置于紫外透射仪下观察结果并拍照分析。步骤(2)所述Taq酶按每个PCR反应含按1.25U加入。 步骤(2)所述PCR扩增条件为94。C预变性5min;94i:变性30sec、 5(TC退火30sec、 72。C延伸30sec， 35个循环;72。C后延伸5min。本申请人根据华南农业大学兽医寄生虫研究室己测得的有齿食 道口线虫和四棘食道口线虫的ITS序列来设计种特异引物。猪有齿食道口线虫ITS序列(包括ITS-1， 5.8S， ITS-2序列)被 发明人国内首次报道，其中ITS-l序列为国际上首次报道，在GenBank 上的注册号为AJ619979。猪四棘食道口线虫ITS-1被发明人国际上首次报道，ITS-2序列 在国内首次报道，在GenBank上的注册号为AJ889566和AJ889568。根据有齿食道口线虫和四棘食道口线虫的ITS-1和ITS-2序列设 计种特异弓I物，其中用于扩增有齿食道口线虫的种特异引物为上游引物OdspF序列为5， -GCAACAGGTACCTTAGAGCTA-3，，下游引物0dspR2序列为5， -TTGCAAATGACATGAAACTAC-3，，为增强引物的特异性，引物OdspF的3'端倒数第2个碱基以"T" 代替"A"，引物0d印R2的3，端倒数第3个碱基以"T"代替"C"， 预期扩增片段大小约130bp。用于扩增四棘食道口线虫的种特异引物为上游引物OqspF序列为5， -ACTAACGTTTTACATTTGGGA-3，，下游引物OqspR序列为5， -CATTCGTGTACCTTAGACGTA-3，；为增强引物的特异性，引物OqspF的3'端倒数第2个碱基以"G" 代替"T",弓|物OqspR的3，端倒数第3个碱基以"G"代替"T"， 预期扩增片段大小约330bp。本发明试剂盒PCR反应条件的优化过程为通过对镁离子浓度和退火温度的调节来对PCR条件进行优化。 Mg十+浓度梯度在2. 5mM至4. OmM之间、退火温度在48。C至58。C之间 进行调整，以取得用多重特异PCR扩增片段的最佳Mg++浓度和最佳 退火温度。经试验确定，最佳退火温度为50°C; MgCl2的浓度为3. 5raM; 循环数选择为35个循环。本发明的猪食道口线虫多重PCR检测试剂盒的使用方法如下样品DNA提取虫体材料置于1. 5毫升的离心管中，用双蒸水反复吹打冲洗3次， 移去离心管中的水，加DNA裂解液消化蛋白质释放基因组DNA， 37°C 温箱消化过夜；消化好的虫体悬液按Promega试剂盒WizardTM DNA Clean-Up System使用说明提取虫体DNA，直接使用或于-20。C冰箱保 存备用。PCR扩增按照扩增样品数加3的数目n，向离心管中依次加入灭菌去离子 双蒸水、10Xbuffer、 MgCl2、 dNTPs，两对种特异引物的上下游引物、Taq DNA聚合酶，旋涡振荡混匀；瞬时离心后，分装于0.2uL的离 心管中，最后加样品模板DNA或阴、阳性对照；再旋涡振荡混匀，瞬 时离心，置于PCR扩增仪中扩增。PCR扩增体系为 PCR扩增体系试剂体积 (UL)ddH2014. 7510XPCR buffer2. 5MgC123. 5dNTPs (2. 5mM)2引物OdspF (50pmol/nL)0. 25引物0dspR2 (50pmol/nL)0. 25引物OqspF (50pmol/u L)0. 25引物OqspR (50pmol/u L)0. 25Taq酶(5U/nL)0. 25模板DNA1PCR扩增条件:94'C预变性94。C变性57。C退火72'C延伸72X:后延伸5min30sec30sec30sec5min35个循环PCR产物观察PCR产物在1. 2%TBE琼脂糖凝胶中电泳后，紫外透射仪下观察结 果，如果观察到一条与有齿食道口线虫阳性对照同一位置出现的130 bp的片段，即为有齿食道口线虫阳性；如果观察到一条与四棘食道 口线虫阳性对照同一位置出现的330 bp的片段，即为四棘食道口线虫阳性。本发明的有益效果是(1) 本发明应用猪有齿食道口线虫和四棘食道口线虫的ITS重复DNA片段作为遗传标记，建立了用于猪食道口线虫病诊断的快速、 特异、敏感的多重PCR方法。(2) 本发明试剂盒操作简单程序化，方法特异性强，敏感性高， 结果判定客观，可用于猪食道口线虫病的诊断、流行病学调査及有齿 食道口线虫和四棘食道口线虫的鉴别诊断。
具体实施方式
实施例1 试剂盒的组成试剂盒内含DNA裂解液30ml，其中含lOOraM的NaCl、pH8. 0的10mM 的Tris-Cl、 pH8, 0的25mM的EDTA、 1% (W/V)的SDS和1. 7 P g/ u L 的蛋白酶K; PCR反应液100个反应(25y L/反应)，为终浓度各200幽 的dATP、 dTTP、 dGTP、 dCTP、终浓度各0. 5pmo1/u L的引物OdspF、 OdspR2、 OqspF及OqspR，终浓度3. 5mM的MgCl2， Taq酶25 u L (5U/uL);有齿食道口线虫DNA阳性对照和四棘食道口线虫阳性对 照各1支。实施例2试剂盒特异性试验用经过DNA有效性验证的的猪蛔虫、毛首线虫、旋毛虫、华枝睾 吸虫和日本血吸虫等5个对照样品DNA各1 u L为模板，按照试剂盒 的反应条件进行特异PCR扩增，同时设空白对照和试剂盒阳性对照。PCR扩增条件为94'C预变性94'C变性5min 30sec30sec 1 35个循环57"C退火 72。C延伸 30sec 72'C后延伸 5minPCR产物在1. 2%TBE琼脂糖凝胶中电泳后，紫外透射仪下观察结 果，凝胶成像系统摄像。结果试剂盒有齿食道口线虫DNA阳性对照扩增出约130bp的条 带，四棘食道口线虫DNA阳性对照扩增出约330bp的条带，两种阳性 对照的混合DNA扩增出约130bp和330bp的条带，而上述其他5种对 照寄生虫和空白对照均无条带出现。 实施例3试剂盒的敏感性试验首先将有齿食道口线虫样品和四棘食道口样品线虫提取DNA后 进行稀释，旋涡振荡混匀，按Eppendorf Biophotometer核酸蛋白测 定仪的操作规程，检测其总DNA含量。按5X、 IOX、 20X、 50X、 IOOX、 200X、 400X稀释DNA。 PCR扩增条件同上，同吋设空白对照。 PCR产物经1.2y。琼脂糖凝胶电泳检测，以确定其敏感性。试验结果表 明该PCR检测方法敏感性髙，最低能检测到0. lng DNA的有齿食道口 线虫和0. 12ng DNA的四棘食道口线虫。 实施例4试剂盒的保存期试验将在4'C和-2(TC保存1个月、3个月、6个月、9个月的试剂盒 对已知样品进行检测，扩增条件同前述。结果表明试剂盒可在4。C和-2(TC保存长期保存，Taq酶除外，须-2(TC保存。在试验周期的9个 月内，在合适保存条件下阳性样品均能扩增出目的亮带，而阴性对照 无条带出现。
实施例5试剂盒在猪食道口线虫病样品诊断中的应用
1. DNA样品
虫体样品来自中国广东阳江、黑龙江大庆、重庆及湖南望城、平 江、宁乡、长沙及岳阳，宿主为猪，共53个样品，70%酒精保存。
2. DNA的提取
虫体材料置于1. 5毫升的离心管中，用双蒸水反复吹打冲洗3次， 移去离心管中的水，加DNA裂解液消化蛋白质释放基因组DNA， 37°C 温箱消化过夜；消化好的虫体悬液按Promega试剂盒WizardTM DNA Clean-Up System使用说明提取虫体DNA，直接使用或于-2(TC冰箱保 存备用。
3. PCR扩增
应用试剂盒对上述抽提的基因组DNA进行PCR扩增，同时做阴性 对照和阳性对照。
4. 琼脂糖电泳分析
PCR产物在1. 2%TBE琼脂糖凝胶中电泳后，紫外透射仪下观察结 果，凝胶成像系统摄像。
5. 扩增产物的DNA序列测定
取与试剂盒阳性对照带形一致的两个种的代表性PCR产物送上 海博尚生物技术有限公司，用相应的种特异引物进行双向测序。测序结果用DNAstar软件进行分析，用BLAST进行序列比对。 6.结果与分析
从国内不同地区收集的样品均扩增出约130bp或330bp的条带， 并且扩增的条带清晰，并发现有混合感染两种食道口线虫的现象，证 明了所建立的猪食道口线虫多重特异PCR方法可用于猪食道口线虫 病的诊断与流行病学调查。
权利要求
1、一种用于猪食道口线虫病诊断的多重PCR检测试剂盒，其特征在于包括(1)DNA裂解液；(2)PCR反应液；(3)有齿食道口线虫DNA阳性对照和四棘食道口线虫阳性对照。
2、 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述DNA裂解液 为lOOmM的NaCl、 pH8. 0的10mM的Tris-Cl、 pH8. 0的25mM的EDTA、 1% (W/V)的SDS和1.7ug/iiL的蛋白酶K的混合溶液。
3、 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述PCR反应液 为终浓度200W的dATP、 dTTP、 dGTP、 dCTP，终浓度0. 5pmol/uL 的引物0dspF、 0dspR2、 OqspF、 OqspR， 3. 5mM的MgCl2的混合溶液。
4、 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述有齿食道口 线虫引物为上游引物OdspF序列为5， -GCAACAGGTACCTTAGAGCTA-3，； 下游引物0dspR2序列为5， -TTGCAAATGACATGAAACTAC-3，。
5、 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述四棘食道口 线虫引物为上游引物OqspF序列为5， -ACTAACGTTTTACATTTGGGA-3，； 下游引物OqspR序列为5， -CATTCGTGTACCTTAGACGTA-3，。
6、 一种权利要求1所述试剂盒的使用方法，其特征在于包括以 下步骤(1) DNA的提取虫体样品用双蒸水反复吹打冲洗3次以上， 加DNA裂解液置温箱37。C消化过夜，提取DNA;(2) PCR扩增按照扩增样品数n加3的数目，取PCR反应液、 Taq酶混合于一离心管中，混匀，分装；将阴性对照液加入一个分装 管中，取各样品的DNA加入对应反应管中；取两种阳性对照分别加入 一反应管中，各反应管标记后离心混匀，置于PCR扩增仪上反应；(3) PCR产物观察取扩增后的PCR产物加样于1. 2%琼脂糖凝 胶上，电泳后置于紫外透射仪下观察结果并拍照分析。
7、 根据权利要求6所述试剂盒的使用方法，其特征在于歩骤(2) 所述Taq酶按每个PCR反应含按1. 25U加入。
8、 根据权利要求6所述试剂盒的使用方法，其特征在于步骤(2) 所述PCR扩增条件为94。C预变性5min; 94。C变性30sec、 5(TC退火 30sec、 72。C延伸30sec， 35个循环；72。C后延伸5min。
全文摘要
本发明公开了一种用于猪食道口线虫病诊断的多重PCR检测试剂盒，包括DNA裂解液；PCR反应液；有齿食道口线虫DNA阳性对照和四棘食道口线虫阳性对照。本发明应用猪有齿食道口线虫和四棘食道口线虫的ITS重复DNA片段作为遗传标记，建立了用于猪食道口线虫病诊断的快速、特异、敏感的多重PCR方法；操作简单程序化，结果判定客观，可用于猪食道口线虫病的诊断、流行病学调查及有齿食道口线虫和四棘食道口线虫的鉴别诊断。
文档编号C12Q1/04GK101230382SQ20081002629
公开日2008年7月30日 申请日期2008年2月4日 优先权日2008年2月4日
发明者宋慧群, 朱兴全, 林瑞庆, 琳 艾 申请人:华南农业大学