专利名称：一种克隆多拷贝t-dna旁侧植物dna序列的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种克隆转基因植物中多拷贝T-DNA旁侧植物DNA 序列的方法。
背景技术：
在遗传修饰的植物中，T-DNA旁侧植物DNA序列可用于转基因植物的检测、基因功能 的研究以及外源基因整合机制的研究。目前，克隆T-DNA的旁侧序列主要方法有如下几种 反向PCR (inverse PCR)、热不对称交错PCR (thermal asymmetric interlaced PCR, TAIL-PCR)、 AL-PCR(adaptor ligation PCR)禾Q T Linker PCR(T-linker-specific ligation PCR)等。
TAIL-PCR的基本原理是利用目标序列旁的已知序列设计2-3个嵌套的特异性引物 (special primer,简称spl， sp2， sp3，约20bp)，用它们分别和1个具有低Tm值的短的随 机简并引物(arbitrary degenerate prime, AD，约14bp)相组合，以基因组DNA为模板，根 据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环，通过分级反应来扩增特异引物。
对于转基因植物中为单拷贝T-DNA时，TAIL-PCR方法可有效扩增T-DNA旁侧植物DNA 序列。但若转基因植物中含有多拷贝T-DNA时，TAIL-PCR方法扩增T-DNA旁侧植物DNA 序列的效率则会大大降低。本发明为用限制性内切酶切去除与植物DNA相连的部分T-DNA 序列以外的其它T-DNA序列，然后进行TAIL-PCR，可有效消除多拷贝T-DNA的影响，提 高扩增T-DNA旁侧植物DNA序列的效率。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种有效克隆转基因植物中多拷贝T-DNA旁侧植物 DNA序列的方法。
本发明所提供的方法是在TAIL-PCR的基础上进行改进的，包括以下步骤
(1) 常规方法提取转基因植物基因组DNA。
(2) 对歩骤l中所述的DNA进行酶切反应。 所述酶切反应既可以是单酶切，也可以是双酶切。单酶切既可以在NOSpolyA区进行，
也可以在35S poly A区进行，双酶切为同时在NOS poly A和35S poly A区进行。
在NOSpolyA区进行酶切的限制性内切酶为4/HI 、 r/ i、 Z^all,以及它们的同功 酶。在35SpolyA区进行酶切的限制性内切酶为Ms/1、爿《wl 、 Wol、 Mcrl、尸vwl，以及它们 的同功酶。用Sm/I酶可在NOS poly A区和35S poly A区同时切割。
(3) 常规方法将歩骤(2)中所述的酶切产物分离为两部分，回收大于3-5kb的片段部分。
(4) 以歩骤(3)中所述的回收片段为模板，进行TAIL-PCR扩增2轮。
扩增T-DNA右边界旁侧植物DNA时，在2轮TAIL-PCR中所用嵌套引物为具有序列表 中序列1和序列2的单链寡核苷酸序列；扩增T-DNA左边界旁侧植物DNA时，在2轮 TAIL-PCR中所用嵌套引物为具有序列表中序列4和序列5的单链寡核苷酸序列。
(4)按常规方法纯化、克隆TAIL-PCR产物。使用PCR法筛选阳性克隆后常规方法进 行测序，得到T-DNA旁侧的植物DNA序列。
测序前用PCR法筛选阳性克隆。对于T-DNA右边界旁侧植物DNA的克隆，所用引物为 具有序列表中序列2和序列3的单链寡核苷酸序列；对于T-DNA左边界旁侧植物DNA的克 隆，所用引物为具有序列表中序列5和序列6的单链寡核苷酸序列。
具体实施例方式
实施例1、多拷贝T-DNA转基因杨树T-DNA右侧植物DNA序列的克隆
(1) 常规方法提取转基因杨基因组DNA。杨树转化所用的载体为pYHY (参考林同 等.向小黑杨转化蜘蛛杀虫肽毒素基因.昆虫学报，2006，49(4):593-598)。
(2) 酶切反应。
在NOS poly A区酶切步骤(1 )中所得的DNA。选用的限制性内切酶为//pa II (MBI公 司)，按生产商提供的说明书进行操作。
(3) 利用琼脂糖电泳法进行步骤(2)中酶切产物的分离，利用上海生工UNIQ-IO柱式 DNA胶回收试剂盒(SK1131)回收大于5kbp的片段。按生产商提供的说明书进行操作。
(4) TAIL-PCR。以步骤(3)的回收产物为模板进行TAIL-PCR。 TAIL-PCR进行2轮 半嵌套式PCR。第l轮扩增中所用嵌套引物为具有序列表中序列l的单链寡核苷酸序列，随 机引物的序列为具有序列表中序列7、 8、 9和IO的单链寡核苷酸序列，程序为
1=94°C 4:00 2=94°C 0:30 3=60 °C 0:45 4=72 °C 1:30 5=Goto2， 14Times 6=94°C 0:307=25 °C1:30
8=0.3 °C /s to 72°C
9=72 。C1:30
10=94°C0:30
11=60°C0:45
12=72°C1:30
13=94°C0:30
14=60°C0:45
15=72°C1:30
16=94°C0:30
17=44°C0:45
18=72。C1:30
19= Goto 10,14Times
20=72 °C5:00
21=4°C forever
22=End
第2轮扩增中所用嵌套引物为具有序列表中序列2的单链寡核苷酸序列，随机引物的序 列为具有序列表中序列7、 8、 9和IO的单链寡核苷酸序列，程序为
1=94°C4:00
2=94 °C0:30
3=60 °C0:45
4=72 °C1:30
5=94 °C0:30
6=60°C0:45
7=72 °C1:30
8=94 °C0:30
9=44 °C0:45
10=72°C1:30
11= Go to 2,15Times
12=72°C5:00
13=4°C forever
14=End(5)按常规方法对步骤(4)中的TAIL-PCR产物进行T-A克隆、测序。使用PCR法筛 选阳性克隆，所用引物为具有序列表中序列2和序列3的单链寡核苷酸序列。
实施例2、多拷贝T-DNA转基因杨树T-DNA左侧植物DNA序列的克隆
(1) 常规方法提取转基因杨基因组DNA。杨树转化所用的载体为pYHY (参考林同 等.向小黑杨转化蜘蛛杀虫肽毒素基因.昆虫学报,2006,49(4):593-598)。
(2) 酶切反应。
在35S poly A区酶切步骤(1)中所得的DNA。选用的限制性内切酶为^7/o I(MBI公司)， 按生产商提供的说明书进行操作。
(3) 利用琼脂糖电泳法进行歩骤(2)中酶切产物的分离，利用上海生工UNIQ-10柱式 DNA胶回收试剂盒(SK1131)回收大于5kbp的片段。按生产商提供的说明书进行操作。
(4) TAIL-PCR。以步骤(3)的回收产物为模板进行TAIL-PCR。 TAIL-PCR进行2轮 半嵌套式PCR。第1轮扩增中所用嵌套引物为具有序列表中序列4的单链寡核苷酸序列，随 机引物的序列为具有序列表中序列7、 8、 9和IO的单链寡核苷酸序列，程序为
1=94°C4:00
2=94 °C0:30
3=60 。C0:45
4=72 °C1:30
5=Go to 2,14Times
6=94 °C0:30
7=25 °C1:30
8=0.3 °C /s to 72°C
9=72 °C1:30
10=94°C0:30
11=60°C0:45
12=72°C1:30
13=94°C0:30
14=60。C0:45
15=72°C1:30
16=94°C0:30
17=44°C0:45
18=72°C1:30
19= Go to 10,14Times20=72 °C 5:00 21=4。C forever 22=End
第2轮扩增中所用嵌套引物为具有序列表中序列5的单链寡核苷酸序列，随机引物的序 列为具有序列表中序列7、 8、 9和IO的单链寡核苷酸序列，程序为
1=94°C4:00
2=94 °C0:30
3=60 °C0:45
4=72 °C1:30
5=94 °C0:30
6=60 °C0:45
7=72 。C1:30
8=94 °C0:30
9=44 °C0:45
10=72°C1:30
11= Go to 2,15Times
12=72°C5:00
13=4°C forever
14=End
(5)按常规方法对歩骤(4)中的TAIL-PCR产物进行T-A克隆、测序。使用PCR法筛 选阳性克隆，所用引物为具有序列表中序列5和序列6的单链寡核苷酸序列。序列表
<110>东北林业大学
<120> —种克隆多拷贝T-DNA旁侧植物DNA序列的方法
<160> 10
< 170> Patentln version 3.3
<210> 1
<2U> 22
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<223> TAIL-PCR第 一轮扩增T-DNA右边界旁侧植物DNA序列时的正向引物
<400> 1
ttgccggtct tgcgatgatt at 22
<210> 2
<211> 24
<212> DNA <213>人工序列
<220〉
<223> TAIL-PCR第二轮扩增T-DNA右边界旁侧植物DNA序列时的正向引物；PCR法筛 选阳性克隆时的正向引物。
<400> 2
gtttttatga ttagagtccc gcaa 24
<210> 3
<211> 22
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<223〉 PCR法筛选阳性克隆时的反向引物。
<400> 3
ctagtaacat agatgacacc gc 22<210> 4
<211> 25
<212〉 DNA <213>人工序列
<220>
<223> TAIL-PCR第一轮扩增T-DNA左边界旁侧植物DNA序列时的IE向引物。
<400〉 4
at卿gagt agttcccaga taagg 25
<210〉 5
<211> 24
<212〉 DNA <213>人工序列
<220>
<223> TAIL-PCR第二轮扩增T-DNA左边界旁侧植物DNA序列时的正向引物；PCR法筛 选阳性克隆时的反向引物。
<400> 5
tcgctcatgt gttgagcata taag 24
<210> 6
<211〉 25
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<223> PCR法筛选阳性克隆时的正向引物。
<400〉 6
attcggggga tctggatttt agtac 25
<210> 7
<211〉 16
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<223> TAIL-PCR扩增时的随机引物。<220>
<221> misc—feature
<222> (l)..(l)
<223> n=a或g或c或t
<220>
<221> misc—feature
<222> (7)..(7)
<223> s=g或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> w=a或t
<220〉
<221> misc_feature
<222> (ll)..(ll)
<223> n=a或g或c或t
<220>
<221 > misc—feature
<222〉 (13)..(13)
<223> w=a或t
<400> 7
ngtcgaswga nawgaa 16
<210> 8
<211> 16
<212> DNA <213>人工序列
<220〉
<223> TAIL-PCR扩增时的随机引物。
<220>
<221> misc—feature
<222> (3)..(3)
<223> w=a或t
<220>
<221 > misc—feature<222> (5)..(5)
<223> n=a或g或c或t
<220>
<221> misc—feature
<222> (8)..(8)
<223> s=g或c
<220>
<221 > misc一feature
<222> (IO)..(IO)
<223> n=a或g或c或t
<220>
<221> misc—feature
<222> (13)..(13)
<223> s=g或c
<400> 8
tgwgnagsan casaga 16
<210> 9
<211> 16
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<223> TAIL-PCR扩增时的随机引物。
<220>
<221 > misc—feature
<222> C3)..(3)
<223> w=a或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> n =a或g或c或t
<220>
<221> misc—feature
<222> (8)..(8)
<223> w=a或t<220>
<221 > misc一feature
<222> 阔..(IO)
<223> n =a或g或c或t
<220>
<221 〉 misc一feature
<222> (13)"(13)
<223> w=a或t
<400> 9
agwgnagwan cawagg 16
<210> 10
<211> 16
<2I2> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TAIL-PCR扩增时的随机引物。
<220>
<221> misc—feature <222>
<223> s=g或c <220>
<221> misc—feature
<222> (5)..(5)
<223> n =a或g或c或t
<220>
<221> misc—feature
<222〉 (8)..(8)
<223> s=g或c
<220>
<221 > misc一feature
<222> 阔..(IO)
<223> n =a或g或c或t
<220>
<221 > misc—feature
<222> (13)..(13)<223> n =a或g或c或t <400> 10
sttgntastn ctntgc 1权利要求
1. 一种克隆转基因植物中多拷贝T-DNA旁侧植物DNA序列方法，包括以下步骤(1)常规方法提取转基因植物基因组DNA。(2)对步骤1中所述的DNA进行酶切反应。(3)常规方法将步骤(2)中所述的酶切产物分离为两部分，回收大于5kb的片段部分。(4)以步骤(3)中所述的回收片段为模板，进行TAIL-PCR扩增2轮。(5)按常规方法纯化、克隆步骤(4)中所述的TAIL-PCR产物。使用PCR法筛选阳性克隆后常规方法进行测序，得到T-DNA旁侧的植物DNA序列。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于酶切反应既可以是单酶切，也可以是双酶切。
3、 根据权利要求2所述的方法，其特征在于单酶切既可以在NOSpoly A区进行，也 可以在35S poly A区进行，双酶切为同时在NOS poly A和35S poly A区进行。
4、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于在NOSpoly A区进行酶切的限制性内切 酶为4/ffl 、 r/ I、 //pall,以及它们的同功酶。在35SpolyA区进行酶切的限制性内切 酶为Ms/1、 v4gwl 、 Mcrl、 PvwI，以及它们的同功酶。
5、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于用Sw/I酶在NOSpolyA区和35SpolyA 区同时切割。
6、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于扩增T-DNA右边界旁侧植物DNA时， 在2轮TAIL-PCR中所用嵌套引物为具有序列表中序列1和序列2的单链寡核苷酸序列；扩 增T-DNA左边界旁侧植物DNA时，在2轮TAIL-PCR中所用嵌套引物为具有序列表中序列 4和序列5的单链寡核苷酸序列。
7、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:测序前用PCR法筛选阳性克隆。对于T-DNA 右边界旁侧植物DNA的克隆，所用引物为具有序列表中序列2和序列3的单链寡核苷酸序 列；对于T-DNA左边界旁侧植物DNA的克隆，所用引物为具有序列表中序列5和序列6的 单链寡核苷酸序列。
8、 根据权利要求l、 2、 3、 4、 5、 6、 7所述的方法，其特征在于既可以是含有单拷贝 T-DNA的转基因植物，也可以是含有多拷贝T-DNA的转基因植物。
全文摘要
本发明公开了一种可有效克隆含多拷贝T-DNA遗传修饰植物中T-DNA旁侧植物DNA序列的方法。本发明的主要步骤是用限制性内切酶切去除与植物DNA相连的部分T-DNA序列以外的其它T-DNA序列，然后进行2轮TAIL-PCR。酶切位点位于T-DNA上的NOS poly A区或/和35S poly A区，TAIL-PCR所用嵌套引物也是根据T-DNA上的NOS poly A区和35Spoly A区的序列设计，因此本方法具有通用性。
文档编号C12P19/00GK101285084SQ200810064648
公开日2008年10月15日 申请日期2008年6月2日 优先权日2008年6月2日
发明者景天忠, 王志英, 齐凤慧 申请人:东北林业大学;景天忠;王志英