专利名称：：大豆7S球蛋白(α+β)亚基缺失型种质的α-亚基基因的特异性序列片断的制作方法大豆7S球蛋白(oc+p)亚基缺失型种质的oc-亚基基因的特异性序列片断.
技术领域：
.本发明涉及一种大豆蛋白的棊因序列片断。
背景技术：
：7S球蛋白是大豆种子贮藏蛋白的重要组分之一，大豆7S球蛋白亚基组成的不同直接影响大豆蛋白的营养品质和加工特性。大豆7S球蛋白也称P-伴大豆球蛋白，是由a'-(76kDa),a-(72kDa)禾Q卩-(52-54kDa)三个亚基组成的分子量为150kDa的三聚体化合物，具有天然的降血脂和降低血清胆固醇含量的保健功能。近年的研究结果表明大豆7S球蛋白的a-亚基是大豆蛋白的主要过敏源之一，但现有技术不能够实现在分子水平上调控大豆7S球蛋白oc-亚基的表达
发明内容.本发明是为了解决现有技术不能在分子水平上调控大豆7S球蛋白oc-亚基的表达的问题，而提供大豆7S球蛋白(oc+p)亚基缺失型种质的a-亚基基因的特异性序列片断。大豆7S球蛋白(cc+(3)亚基缺失型种质的oc-亚基基因的特异性序列片断长度为1379bp，基因序列如SEQIDNO.l所示。本发明成功的制备出与大豆7S球蛋白(a+p)亚基缺失型种质a-亚基缺失特性相关的ot-亚基基因的特异性序列片断，实现了在分子水平上调控大豆7S球蛋白ot-亚基的表达。(a+P)-亚基缺失型与日E(^基表现正常型)的部分a-亚基基因扩增片段的序列(NCBI序列号为GeneBank:M36686)进行比较，日E(亚基表现正常型)与(a+p)-亚基缺失型之间相同的核苷酸同源性为90.9%。具体实施例方式具体实施方式一本实施方式按照如下方法制备大豆7S球蛋白(a+j3)亚基缺失型种质的ot-亚基基因的特异性序列片断一、大豆7S球蛋白a-亚基缺失突变体的分析确认(SDS-PAGE梯度电泳法)a、称取5mg的大豆粉，加入0.5mL的抽提缓冲液(0.05M盐酸缓冲液(Tris-HCl,pH8.0)，0.2%十二烷基硫酸钠(SDS)，5M尿素(Urea))充分混匀，在室温条件下静置过夜，加入10pL的巯基乙醇，混匀，在4'C的条件下以14000r/min的速度离心15min,取20pL上清液进行SDS-PAGE电泳与考马斯亮蓝染色；b、凝胶制备(1)分离胶11.98%的分离胶配方如表1所示，依表中顺序加入试剂，搅拌均匀，最后加入N，N，N'，N'-四甲基乙二胺(TEMED)，混匀后快速灌入装好的玻璃板内，用胶头滴管加入一水层，等待分离胶凝固大约IO分钟，凝固后倒掉水层；'表1<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>(2)聚合胶4.38%的聚合胶配方如表2所示，药品配制步骤同分离胶，最后加入TEMED，混匀后快速灌在分离胶上，插入梳子，等待其凝固大约15分钟，小心拔出梳子，待用；.表2.<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>c、电泳将聚丙烯酰胺胶板固定于电泳槽上。加lxTAE于电泳槽内，确保电泳槽内不漏液。用微量移液器取1015pL上清液，点入点样孔内，待所有的材料点样完成后，开动电泳仪，先将电泳仪的电流调到15mA进行15分钟，后调到30mA进行40-60分钟；d、染色、脱色电泳结束后，先卸板，将板上部的聚合胶去除，切角(目的记住点样顺序)，然后放到染色剂中染色30min，染色结束后换成脱色剂脱色数小时直至条带清晰。染色、脱色过程需在摇床上进行；e、谱带分析用BIO-IDImage软件对图象进行处理、分析，根据各谱带峰面积的大小，分析每个电泳样品的蛋白质^a成，计算a-亚基的相对含量。二、大豆种子基因组DNA的提取a、取经聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)确认过亚基表现的大豆种子，去掉种皮，研磨成粉末状，称取20mg的豆粉装入1.5mL的离心管内；b、加入DNA提取液(pH值为7.8，具体成分见表3)40(^L和6^iL的蛋白酶K浸透粉末，倒转离心管，使粉末充分散开。然后在55。C水浴中保温20min;表3<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>c、加入400mLPCI溶液(pH值为7.8，具体成分见表4)充分混匀，然后在4。C的条件下以12000r/min的速度离心5min;表4<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>d、取上清液放入1.5mL的离心管中，加入400nL的异丙醇，混匀后室温下静置30min，再在4。C的条件下以12000r/min的速度离心5min;e、弃去上清液，加入400pL的TE(Tris-HCl和乙二胺四乙酸(EDTA)的混合液，具体成分如表5所示)溶解后在4。C的条件下以12000r/min的速度离心3min;表5<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>f、取上清液放入1.5mL的离心管中，加入2pLRNA酶在37。C的水浴保温30min，再加入40pL的浓度为3mol/L的NaAC溶液和lmL的巯基乙醇，混匀后在室温下静置10min，然后在4。C的条件下以12000r/min的速度离心5min，弃去上清液，加入lmL的质量浓度为7(P/。的酒精，然后在4"C的条件下以12000r/min的速度离心5min，再次弃去上清液后在4°C的条件下以12000r/min的速度离心5min，再弃去上清液;g、将离心管倒置在吸水纸上，自然干燥至上清液消失，再加200pL的无菌去离子水溶解，4。C保存；即得到大豆种子基因组的DNA。三、用PCR反应制备(a+(3)亚基缺失型种质的a-亚基基因的特异性序列片断oc-亚基基因的特异性弓I物序列正向弓I物CTTCAATCTGGTGATGCCCT反向引物CAAAGGACCCTTTCTTCCCTPCR反应体系如表6所示，反应程序如表7所示表6<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表7<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>三、将PCR'产物用EZ-10spincolumnDNA回收试剂盒(上海生工出品)进行切出与纯化a、加入48mL质量浓度为99%乙醇于洗脱液中待用；将洗脱缓冲溶液放到55"C的水浴锅中预热；'b、称量1.5mL离心管，记录重量；c、切胶，并将DNA胶移至称量好重量的1.5mL离心管内，再称重量，计算出胶块的重量；d、按每100mg胶块加400pL结合缓冲液II(BindingbufferII)的比例加入结合缓冲液II(BindingbufferII)，再放入506(TC的水浴10min，期间每隔3min上下颠倒离心管直至凝胶完全溶解；e、溶解的凝胶加到EZ-10柱中，在375(TC的恒温金属浴中静置2min后以8000r/min的速度离心lmin，弃离出液;'f、加入500^L的洗脱液(ElutionBuffer)到上步的'EZ-IO柱中，再以8000r/min离心lmin弃离出液，重复本步骤一次；g、再以10，000r/min的速度离心lmin，弃离出液；h、将上步的EZ-10柱放到一个新的1.5mL离心管中，在柱的中心加入3050)iLS5。C预热的洗脱缓冲液，在3750。C的恒温金属浴中静置2min，再以10000r/min的速度离心lmin，然后回收DNA，放到-20。C中保存。四、大肠杆齒感受态细胞的制备a、取DH-5ot大肠杆菌原种，于LB琼脂板上划线培养(过夜)；b、挑取新鲜单菌落，接种于30mL的LB培养基中，37。C震荡培养过夜；c、取对数生长期的菌液，按1/100的稀释比例接种于50mL的LB液体培养基中，'继续培养至OD6oo为0.40.5;d、菌液冰浴"min,分.装于1.5mL无菌离心管中，在4。C的条件下以4000r/min的速度离心6min，收集细菌沉淀；e、加入600pL的冰预冷无菌的0.1mol/L的CaCl2溶液，悬浮细菌沉淀，在冰浴条件下保温30min，再在4°C的条件下以4000r/min的速度离心10min，收集细菌沉淀；'f、每管加入100pL冰浴冷的0.1mol/L的CaCl2溶液，重悬细菌沉淀，即为感受态细胞，在4'C下保存；五、目的片段的连接反应.a、PCR产物浓度需确保为0.2pmol/L，体系最终用去离子水调整至终体积为10iaL，反应体系如表8所示，其中T4QNA连接酶应最后加入;b、连接产物在16'C的金属浴中过夜；表8.<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>六、连接产物转化大肠杆菌a、向在16。C过夜的连接产物内加入l^iL、5mol/L的NaCl溶液中，用枪头轻轻混匀，加入100pL的感受态细胞，混匀后在冰上放置30min，再放42°C的水浴中热'激45s后，迅速置于冰上冷却2min;b、加入90(HiL的LB液体培养基，，在37。C的水浴中以100r/min的速度振荡培养1.5h;c、将200mg/mL异丙基-(3-D-硫代半乳糖苷(IPTG，具体成分如表9所示)和Mmg/mL5-溴4-氯-3-卩引哚-P-D-半乳糖苷(X-gal，具体成分如表10所示)依次均匀涂布于^"有抗生素(100mg/mL的氨苄青霉素(Amp))的预先制备好的LA培养基上，待用。表9药品.剂量IPTG2g<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>d、将培养好的菌液转移至1.5mL离心管内，收集细菌沉淀，并将菌液均匀涂布于LA板上，37。C倒置培养14~16小时；七、克隆产物的筛选a、蓝、白斑确认选择LA板上白色单一菌落，编好序号，转移至新LA板上；'b、重组质粒的筛选和鉴定，'质粒检测PCR反应体系如表11所示，PCR反应程序如表12所示，质粒筛选通用引物序列为正向弓I物5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'反向引物5'-AGAGGATAACAATTTCACACAGGA-3'表11<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>八、质粒DNA的制备碱裂解法小量制备质粒DNA(采用EZ—IOSpinColumn质粒DNA提取试剂盒)a、将洗脱缓冲液放到375(TC的水浴中待用；检查SolutionII是否有沉淀，若有，37"保温至沉淀溶解，加RNaseA溶液(具体成分如表13所示)到SolutionI中混匀，在4。C保存，加入48mL、浓度为96%~100%的乙醇到12mL的洗脱液中混匀；<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>b、挑取一个PCR检测为阳性的单菌落在10mL的LA液体培养基中、37"C的条件下振荡培养过夜；c、取2个1.5mL离心管，每管加入1.5mL的过夜培养的菌液，在4"C的条件下以12000r/min的速度离心lmin，除去上清液，重复此步骤35次；d、加入200^iL的SolutionI到离心管中，振荡至悬浮，静置2min，再加入400pL的SolutionII，上下颠倒46次，室温静置lmin，然后加入700pL的SolutionIII，轻缓混匀，室温静置2min，然后以12000r/min的速度离心5min;e、取上清液于EZ—10柱中，室温静置lmin，以8000r/min的速度离心lmin，弃掉离出液，再加入500pL的洗脱液到EZ—10柱中，以8000r/min的速度离心lmin，弃掉离出液，.然后加入50(HiL的洗脱液到EZ—10柱中，以8000r/min的速度离心lmin，弃掉离出液，再以10000r/min的速度离心lmin，弃掉离出液；f、把EZ—10柱放到一个新的1.5mL离心管中，加50pL的洗脱缓冲液到EZ—10柱的中心处，室温静置2min，再以10/000r/min的速度离心2min，回收质粒DNA，将获得的质粒DNA放到-20。C保存；九、将PCR检测呈阳性的菌株进行测序，即得到大豆7S球蛋白(a+卩)亚基缺失型种质的oc-亚基基因的特异性序列片段，长度为i379bp，基因序列如下所示<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>序列表<110〉刘珊珊-〈120大豆7S球蛋白(a+(3)亚基缺失型种质的a-亚基基因的特异性序列片断<160>5<210>1<211>1379<212>DNA<213>人工序列<220><223>大豆73球蛋白(a+P)亚基缺失型种质的qc-亚基基因的特异性序列片断<400>1.gtgatgccctaagcagctccctgcaggaaccttcaatctgctgacaa&gagatUgaggtcaaatcttaagctccagtagcgacccgtttccgcgcggggggttctgaagatcaagttgtttcagtgttgtgcactttcttcctttgttcacgtactagtgacggcgaacg3tactgaatttctcatattttgttttattaatt犯tttgaaggcgttccctggttgtggatgccgagaatctcactacttattgatcaatcttcctacttgcaacaccatctattgattttatcagcaacaag已ttcgggaacgagattacccg3t3tgCgtt3gttsgagtttgggtatttgtaatttgcttttgg3tatcacgatacatgtgagtctgcai61tcagcctcagag3tg3t^ctttataacttttcttttctgttcagcatacgctagc8g3CCattggggtg3gCaC3acttgsggaaacct已ttcagctctt-tttaggcaaacgccctttgCCC3gC3ggttatcaatgcccatagctgac33tgtgataag3ta"ttg3gacaggcactcgccataattaattaactgcagagttgt3ttcaaattcaatagctgcagtgccaaatctccgcgaccccccctcagctt3aaa3ctg3ttgagactttctgccacactattgaacttggaagtgcggatatccagttggagaacccatgctgttgatgagctatttgccagataccacctaataaacacatact3tacccgttaacttattattcttcttcctatctagaggcctcttatcattatcaaggttcgtgattgagttcaaggatctattccacgggacttgg3ta^tg3ttcaattcaaattggcattaatggtccgcagaggaacttagtgUgttactaatccttttagtc3gtggagccaaagtgtggttaacc60acccggta120aatttgUtc180tagcactc240atacgacgta300ccttatattt360tgtttggtag420tggaaatctc480agaccatttc540tcgcttgg600atgtcttcct660gagttctatt720ttactttttt780ggcc由gtg840agaacaacaa900tgaattgtct960tacctcagat1020cttgcaggta1080cUtUUgt1140ggtgattgaa1200caggagcttg1260gagtcctact1320ggtcctttg1379,<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>a:亚基基因特异性的正向引物<400>2cttcaatctggtgatgccct20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>a-亚基基因特异性的反向引物<400>3caaaggaccctttcttccct20<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>.<223>质粒筛选通用的正向引物<400>4cgccagggttttcccagtcac.gac24<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>质粒筛选通用的反向引物<400>5agaggataacaatttcacac3gga2权利要求1、大豆7S球蛋白(α+β)亚基缺失型种质的α-亚基基因的特异性序列片断，其特征在于大豆7S球蛋白(α+β)亚基缺失型种质的α-亚基基因的特异性序列片断如下所示CTTCAATCTGGTGATGCCCTAAGCAGCTCCCTGCAGGAACCACATACTATGTGGTTAACCCTGACAACGACGAGAATCTCAGAATGAIAACACTCGCCATACCCGTTAACAAACCCGGTAGATTTGAGGTACTACTTATTCTTTATAACTAATTAATTAATTATTATTCTAATTTGTTTCCAAATCTTAAGATCAATCTTTTTCTTTTCTCTGCAGAGTTTCTTCCTATCTAGCACTCAAGCTCAACAGTCCTACTTGCAAGGGTTCAGCAAGAATATTCTAGAGGCCTCATACGACGTAAGCGACCAACACACCATCTAATACGCTAGCAAATTCAATATTATCATTATCCTTATATTTGTTTCCGCGCTTGATTTTATAGACCAAATTCGAGGAGATAAACAAGGTTCTGTTTGGTAGAGAGGAGGGGCAGCAACAAGGGGAGGAGAGGCTGCAAGAGAGTGTGATTGTGGAAATCTCAAAGAAACAAATTCGGGAACTGAGCAAACATGCCAAATCTAGTTCAAGGAAGACCATTTCTTCTGAAGATAAACCTTTCAACTTGAGAAGCCGCGACCCCATCTATTCCATCAAGCTTGGCAAGTTGTTTGAGATTACCCCAGAGAAAAACCCTCAGCTTCGGGACTTGGATGTCTTCCTCAGTGTTGTGGATATGAACGAGGTAAGCAGAAAAACTGAACATGACAATTGAGTTCTATTCACTTTCTTCTTAGTTAGAGAAACCTATTCTTGAGACTTTAAATAATGATTTACTTTTTTCTTTGTTCACAAATATAGGGAGCTCTTTTTCTGCCACACTTCAATTCAAAGGCCATAGTGGTACTAGTGATTAATGAAGGAGAAGCAAACATTGAACTTGTTGGCATTAAAGAACAACAACAGAGGCAGCAACAGGAAGAGCAACCTTTGGAAGTGCGGAAATATAGAGCTGAATTGTCTGAACAAGATATATTTGTAATCCCAGCAGGTTATCCAGTTGTGGTCAACGCTACCTCAGATCTGAATTTCTTTGCTTTTGGTACAATGCCGAGAACAACCAGAGGAACTTCTTGCAGGTACATATTTTGTATATCACGATCAAATAGAACATGCTGTTGAAGTGTTGTTACTTTTTTTGTTTTATTAATTACATGTGAAACATAGCTGACTGAGCTATTTCTAATCCTTTGGTGATTGAAAATTTGAAGGTTCGAAAGACAATGTGATAAGCCAGATACCTAGTCAAGTGCAGGAGCTTGCGTTCCCTGGGTCTGCAAAAGATATTGAGAACCTAATAAAGAGCCAAAGTGAGTCCTACTTTGTGGATGCTCAGCCTCAGCAGAAAGAGGAGGGGAACAAGGGAAGAAAGGGTCCTTTG。全文摘要大豆7S球蛋白(α+β)亚基缺失型种质的α-亚基基因的特异性序列片断，它涉及一种大豆蛋白的基因序列片断。本发明是解决了现有技术不能在分子水平上调控大豆7S球蛋白α-亚基的表达的问题。本发明利用PCR获得大豆7S球蛋白(α+β)亚基缺失型种质的α-亚基基因的特异性序列片断，大豆7S球蛋白(α+β)亚基缺失型种质的α-亚基基因的特异性序列片断长度为1379bp。本发明实现了在分子水平上调控大豆7S球蛋白α-亚基的表达。文档编号C12N15/10GK101363023SQ20081006456公开日2009年2月11日申请日期2008年5月23日优先权日2008年5月23日发明者刘珊珊,张永强,李文滨申请人:刘珊珊