专利名称：一种抗氧化活性肽及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种抗氧化活性肽，本发明还涉及一种该抗氧化活性肽的制备 方法。
背景技术：
玉米蛋白粉(Corn Gluten Meal縮写CGM)俗称玉米黄粉，是玉米湿法生 产淀粉的副产物之一，约含60%的蛋白质，抽样检测其蛋白质组成为玉米醇溶 蛋白(zein)占68%、谷蛋白(glutelin)占22%，其余为球蛋白(globulins) 和白蛋白(albumin)。玉米蛋白粉是一种资源丰富、成本低廉的天然植物蛋白 原料，但就其氨基酸组成而言，由于赖氨酸和色氨酸的含量都不高，所以玉米 蛋白是一种非全营养蛋白。另外，玉米蛋白粉所含的蛋白质难溶于水，组成复 杂，口感粗糙，因此，无论是在食品领域还是在饲料行业都很少有人予以重视， 有些工厂甚至将其与其它副产物一起不加回收就自然排放掉了，这不仅是对粮 食资源的一种浪费，同时也对生态环境造成了一定程度的污染。
再者，由于人类生存环境和生活方式、尤其是饮食结构的改变，体内环境 也在发生着潜移默化的改变。以基础物质代谢为例，越来越多的过氧化物质和 有害自由基正在人们体内源源不断的生成，严重地威胁着人们的健康。对此， 绝大多数人都缺少认知。虽然医学专业人员为解决这一问题做了很多的研究， 但是目前真正能够起到预防氧化、有效抑制体内自由基形成的高活性抗氧化物 质还不很多，这就需要我们相关专业的技术人员进一步做出更多的努力。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种抗氧化活性肽，由于生产该产 品的主要原料是玉米蛋白粉，首先为这种长期被冷落、被遗弃的天然资源提供 了一种有效的利用途径，同时还开发出了一种具有防治疾病、抗衰老等功能， 可以做为医药、化妆品等产品添加剂使用的抗氧化活性肽。本发明要解决的另 一个技术问题是提供一种该抗氧化活性肽的制备方法。
本发明产品抗氧化活性肽的分子量在20，100-31，000之间，N端5个氨基酸 序列为K-V-T-Y-H，抗氧化活力为236.68U/mL。
本发明产品抗氧化活性肽的制备方法以微生物纳豆芽孢杆菌(Bac,7/附 为菌种，以玉米蛋白粉为原料，采用液态培养方式，获得具有抗氧化活 性的多肽混合物，再通过离子交换层析、凝胶层析、反相色谱逐级收集高活性 且分子量〉5，000Da部分，最后通过凝胶电泳获得。
在上述技术方案中所使用的纳豆芽孢杆菌(J fl"7/"simrto)可以采用现有品 种，该菌种目前已经很容易得到。本发明最优选的菌种是本课题组于日本传统 食品纳豆中分离、筛选得到的，保藏号为00]\1<:€]\0.2236的菌株。该菌种最 突出的特性就是其分泌蛋白酶的活力较现有菌株至少要高出2.66%。
本发明产品制备的具体方法
1、发酵液的制备
以纳豆芽孢杆菌(5""7/"s"a/to)为发酵菌种，将lmL种子培养液接入装 有初始pH7.0的30mL发酵培养基的250mL三角瓶中，于34°C 、 200r/min条 件下振荡培养32h后5000 r/min离心10min，在沸水浴中灭酶活10min，所得 液体为抗氧化活性肽的混合物。2、 DEAE-Sepharose Fast Flow弱阴离子交换层析
将第一步所得的混合物10000r/min离心15min，取上清液过0.22pm的微 孔滤膜，滤液进行弱阴离子交换层析((p2.6*20cm)。起始缓冲液25mmol/L pH 9.0Tris-HCl ，洗脱液含lmol NaCl的25mmol/L pH 9.0 Tris-HCl，流速 1.5mL/min, UV280nm处检测。测定各管收集液的抗氧化活力，收集高活性部 分备用。
3、 Sephadex G-25凝胶过滤层析
① 将DEAE-S印harose Fast Flow的高活力样品冷冻抽干浓縮后，用洗脱液 25mmol/L pH 9.0 Tris-HCl溶解后进行凝胶层析脱盐((pl.6*50)，流速2.0mL/ min， UV280nm处检测。测定各管收集液的抗氧化活力，收集高活性部分备用。
② 将Q- Sepharose HP的高活力样品冷冻抽干浓縮后，用洗脱液双蒸水溶 解后10000r/min离心10min，取上清液进行凝胶层析脱盐(cpl.6*50),流速 2.0mL/min， UV280nm处检测，测定各管收集液的抗氧化活力，收集高活性且 分子量〉5，000Da部分备用。
4、 Q-SepharoseHP强阴离子交换层析色谱
将进行过①Sephadex G-25脱盐后的活性部分进行Q-Sepharose HP分离。 起始缓冲液25mmol/L pH 9.0 Tris-HCl，洗脱液:含lmolNaCl的25mmol/L pH 9.0Tris-HCl，流速2.0mL/min， UV280nm处检测，测定各管收集液的抗氧化 活力，收集高活性且分子量〉5，000Da部分备用。
5、 CM-S印harose Fast Flow弱阳离子交换层析
将进行过②Sephadex G-25脱盐后的活性部分进行CM-Sepharose Fast Flow色谱分离。起始缓冲液lmmol/L pH 3.0 Gly-HCl，洗脱液含lmol NaCl的0.001mol/LpH3.0Gly-HCl，流速2.0mL/min， UV280nm处检测，测定各 管收集液的抗氧化活力，收集活性部分备用。
6、 反相色谱
RESOURCE RPC (3mL)反相色谱分离
将经过②Sephadex G-25脱盐后活性部分进行RESOURCE RPC 3mL反 相色谱分离。洗脱液A: 0.065%TFA， 2%乙腈；洗脱液B: 0.05%TFA, 80% 乙腈；流速1.0mL/min， UV280nm处检测。测定各管收集液的抗氧化活力， 收集活性部分作下一步色谱分离用。
② 第一次SymmetryShield TMRP 18 ( 5jim)反相色谱
将进行过CM-Sepharose Fast Flow的高活力样品，进行Symmetry Shield TMRP18反相色谱分离。洗脱液A: 0.065%TFA ， 2%乙腈；洗脱液B: 0.05%TFA， 80%乙腈；流速1.0mL/min， UV280nm处检测。测定各管收集 液的抗氧化活力，收集活性部分进行第二次SymmetryShield TMRP 18反相色谱
③ 第二次SymmetryShield RP 18 (5jim)反相色谱 将第一次进行SymmetryShield TMRP 18反相色谱分离的高活力部分冷冻抽
干后进行第二次SymmetryShield RP 18分离。洗脱液A: 0.065%TFA， 8% 乙腈；洗脱液B: 0.05%TFA， 60%乙腈；流速1.0mL/min, UV280nm处检 测，测定各管收集液的抗氧化活力，收集活性部分进行蛋白质电泳。
7、 酸、碱性PAGE凝胶电泳垂直板电泳槽中灌注交联度为2.6%，浓度 为10% (w/v)分离胶和5% (w/v)浓縮胶。碱性电泳浓縮胶部分恒压40v，分离胶部分恒压70v，电泳2.0h左右。酸性电泳浓縮胶部分恒压100v，分离胶部 分恒压200v，电泳4.0h。
本发明的有益效果是本发明设计的产品具有很高的抗氧化活力，经测定 为236.68U/mL。纯品可满足对抗氧化活性肽结构、物性测定，活性、毒理实 验，乃至于治疗、培育等大规模应用的要求。同时抗氧化活性物质对超氧阴离 子自由基和羟基自由基有强烈的清除作用，并能显著抑制红细胞和肝脏、心脏、 脑组织脂质过氧化反应的发生，具有防治疾病、抗衰老等功能，所以本发明产 品可进一步开发成医药、化妆品等产品添加剂使用。
本发明中优选的纳豆芽孢杆菌(^"7/附/m加)菌株已由本申请人于2007 年10月30日向中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC) 提供了保藏，保藏号为CGMCCNo.2236。
具体实施例方式
实施例1:
1、 菌种纳豆芽孢杆菌(5fl"7/附wfl加)菌株，保藏号为CGMCC No.2236。
2、 斜面培养基及培养条件
斜面培养基牛肉膏O.Sg,蛋白胨lg， NaC10.5g，琼脂2g，水100mL， pH7.0-7.2， 37。C培养12h。
实施例2:
1、 菌种、斜面培养同实施例1
2、 种子培养基及培养条件
种子培养基蛋白胨lg，葡萄糖2g, K2HPO40.1g， MgSO40.05g，水100mL， pH7.0-7.2， 37°C、 200r/min条件下振荡培养12h。实施例3:
1、 菌种、斜面培养同实施例1
2、 种子培养同实施例2
3、 主要检测方法
(1) 蛋白含量测定Folin-酚法
(2) 抗氧化活力测定邻苯三酚自氧化法
4、 发酵培养基及发酵条件
发酵培养基玉米蛋白粉与水按一定比例配制。
取lmL种子培养液接入装有初始pH7.0的30mL发酵培养基的250mL三 角瓶中，34°C、 200r/min条件下振荡培养32h。
实施例4:
1、 斜面培养同实施例1
2、 种子培养同实施例2
3、 发酵条件同实施例3
4、 抗氧化活性肽的分离纯化
将发酵液10000r/min离心15min后，取上清液用0.22jim微孔滤膜过滤， 滤液进行弱阴离子交换层析，收集活性髙的部分用Sephadex G-25凝胶层析脱 盐。脱盐后的活性部分进行Q-SepharoseHP色谱分离，收集活性髙的部分用 Sephadex G-25凝胶层析进行脱盐。脱盐后的收集的活性部分再次进行弱阴离子 交换层析分离并脱盐。收集活性部分进行Symmetry Shield TMRP 18反相色谱分 离，收集高活性部分第二次经SymmetryShieldTMRP18反相色谱分离，收集活 性部分进行蛋白质电泳，并印迹至PVDF膜上。实施例5:
1、 斜面培养同实施例1
2、 种子培养同实施例2
3、 发酵条件同实施例3
4、 抗氧化活性肽的分离纯化同实施例4
5、 抗氧化活性肽的氨基酸序列的测定
将印迹到PVDF膜上的肽送到上海生化蛋白质组学研究分析中心用PE公 司的ABI491A氨基酸序列分析仪进行氨基酸序列测定。
实施例6
本发明产品抗氧化活力的测定，采用的方法是改进的邻苯三酚自氧化法， 采用4.5mL体系对各组分进行邻苯三酚自氧化的测定。Tris-HCl (pH8.2， 0.05mol/L) 4.5mL， 25。C水浴保温20min,对照管中加O.01mol/L HC1 10jiL和 4.5mL Tris-HCl，空白管中加入25°C预热的45mmol/L的邻苯三酚10jiL和4.5mL Tris-HCl混匀，开始计时，反应30s后，于325nm处作时间扫描，反应4min， 空白最佳的自氧化速率控制为0.070±0.002A/min,取玉米蛋白水解液10pL加入 到Tris-HCl缓冲液4.5mL中，同25。C预热的45mmol/L的邻苯三酚lOpL混匀， 30s后，于325nm处扫描，最后计算抗氧化活力。
计算酶活力(U/mL) = ( ODA-ODB) /ODaX100。/。/50。/。xV N/V2 其中Vr反应液总体积，mL
Vr测定样品的体积，mL N-样品稀释倍数 ODA-邻苯三酚自氧化法速率ODB-样品光密度值变化速率 经测定其抗氧化活力为236.68U/mL。
实施例7
本发明产品氨基酸序列的测定，所采用的方法是Edman降解法，测定该 抗氧化活性肽的氨基酸序列结果是该肽N端5个氨基酸序列为K-V-T-Y-H。
权利要求
1、一种抗氧化活性肽，其特征是该产品的分子量在20,100--31,000之间，N端5个氨基酸序列为K-V-T-Y-H，抗氧化活力为236.68U/mL。
2、 一种如权利要求1所述抗氧化活性肽的制备方法，其特征是该产品 是以玉米蛋白粉为原料，使用纳豆芽孢杆菌(5fl"7/附/iWto)为发酵菌种，采用 液态培养方式，获得具有抗氧化活性的多肽混合物，再通过离子交换层析、凝 胶层析、反相色谱，逐级收集高活性并分子量〉5，000Da部分，最后通过电泳分 离获得。
3、 根据权利要求2所述的抗氧化活性肽的制备方法，其特征是所述的 纳豆芽孢杆菌(5fl"7/"s/m"o)菌种为本申请人于2007年10月30日在中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号为CGMCC No.2236的菌株。
4、 一种如权利要求2或3所述抗氧化活性肽的制备方法，其特征是所述 的液态培养方式如下；取发酵菌种纳豆芽孢杆菌(^1"7/附《^似)菌株，将lmL 种子培养液接入装有初始pH7.0的30mL发酵培养基的250mL三角瓶中，于 34。C 、 200r/min条件下振荡培养32h后5000 r/min离心10min,在沸水浴中灭 酶活10min，所得液体为抗氧化活性肽混合物。
5、 一种如权利要求4所述抗氧化活性肽的制备方法，其特征是所述的 离子交换层析包括弱阴离子交换层析，具体;r序为使用的弱阴离子为DEAE 一SepharoseFastFlow，具体步骤是将抗氧化活性肽混合物10000r/min离心 15min ，取上清液过0.22jim微孔滤膜，滤液进行弱阴离子交换层析((p2.6*20cm );起始缓冲液25mmol/L pH 9.0 Tris-HCl ,洗脱液含lmol NaCl的25mmol/L pH9.0Tris-HCl，流速1.5mL/min， UV280nm处检测，测定各管收集液的抗 氧化活力，收集高活性部分备用。
6、 一种如权利要求5所述抗氧化活性肽的制备方法，其特征是所述的凝 胶层析采用Sephadex G-25,具体步骤是① 将DEAE-Sepharose Fast Flow的高活力样品冷冻抽干浓縮后，用洗脱液 25mmol/L pH 9.0 Tris-HCl溶解后进行凝胶层析脱盐(q>1.6*50)，流速为 2.0mL/min， UV280nm处检测；测定各管收集液的抗氧化活力，收集高活性部 分备用；② 将Q- S印harose HP的高活力样品冷冻抽干浓縮后，用洗脱液双蒸水溶 解后10000r/min离心lOmin，取上清液进行凝胶层析脱盐(<pl.6*50)，流速 2.0mL/min， UV280nm处检测，测定各管收集液的抗氧化活力，收集高活性并 分子量〉5，000Da部分备用。
7、 一种如权利要求6所述抗氧化活性肽的制备方法，其特征是所述的反 相色谱包括强阴离子交换层析色谱，采用的是Q-SepharoseHP，具体步骤是 将进行过Sephadex G-25脱盐后的活性部分进行Q-S印harose HP分离，起始缓 冲液25mmol/L pH 9.0 Tris-HCl，洗脱液:含ImolNaCI的25mmol/L pH 9.0 Tris-HCl,流速2.0mL/min， UV280nm处检测，测定各管收集液的抗氧化活 力，收集高活性并分子量〉5，000Da部分备用。
8、 一种如权利要求7所述抗氧化活性肽的制备方法，其特征是所述的离 子交换层析还包括弱阳离子交换层析，使用的是CM-Sepharose Fast Flow,具 体步骤是将进行过Sephadex G-25脱盐后的活性部分进行CM-Sepharose FastFlow色谱分离；起始缓冲液lmmol/LpH3.0Gly-HCl，洗脱液含lmolNaCl 的0.001mol/LpH3.0Gly-HCl，流速2.0mL/min， UV280nm处检测，测定各 管收集液的抗氧化活力，收集活性部分备用。
9、 一种如权利要求8所述抗氧化活性肽的制备方法，其特征是所述的反 相色谱分离步骤包括 RESOURCE RPC (3mL)反相色谱分离将经过②S印hadex G-25脱盐后活性部分进行RESOURCE RPC 3mL反 相色谱分离；洗脱液A: 0.065%TFA， 2%乙腈；洗脱液B: 0.05%TFA, 80% 乙腈；流速1.0mL/min， UV280nm处检测；测定各管收集液的抗氧化活力， 收集活性部分作下一步色谱分离用；② 第一次SymmetryShield TMRP 18 ( 5jun)反相色谱将进行过CM-Sepharose Fast Flow的高活力样品，进行Symmetry Shield TMRP18反相色谱分离；洗脱液A: 0.065%TFA , 2%乙腈；洗脱液B: 0.05%TFA， 80%乙腈；流速1.0mL/min， UV280nm处检测；测定各管收集 液的抗氧化活力，收集活性部分进行第二次SymmetryShield TMRP 18反相色谱③ 第二次SymmetryShield TMRP 18 (5jim)反相色谱 将第一次进行SymmetryShield TMRP 18反相色谱分离的高活力部分冷冻抽干后进行第二次SymmetryShield TMRP 18分离；洗脱液A: 0.065%TFA， 8% 乙腈；洗脱液B: 0.05%TFA， 60%乙腈；流速1.0mL/min， UV280nm处检测，测定各管收集液的抗氧化活力，收集活性部分进行蛋白质电泳。
10、 一种如权利要求9所述抗氧化活性肽的制备方法，其特征是所述的 酸、碱性PAGE凝胶电泳垂直板电泳槽中灌注交联度为2.6%，浓度为10% (w/v)分离胶和5% (w/v)浓縮胶；碱性电泳浓縮胶部分恒压40v，分离胶部分 恒压70v，电泳2.0h;酸性电泳浓縮胶部分恒压100v，分离胶部分恒压200v，电 泳4.0h。
全文摘要
本发明公开了一种抗氧化活性肽及其制备方法，产品是以微生物纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)为菌种，玉米蛋白粉为原料，经液态培养，再通过离子交换层析、凝胶层析、反相色谱和电泳法对发酵液进行分离制备而成；该产品的分子量在20,100-31,000之间，N端5个氨基酸序列为K-V-T-Y-H，抗氧化活力为236.68U/mL；本发明产品具有较高的抗氧化活力，纯品可满足对抗氧化活性肽结构、物性测定，活性、毒理实验，乃至于治疗、培育等大规模应用的要求；由于抗氧化活性物质对超氧阴离子自由基和羟基自由基有强烈的清除作用，并能显著抑制红细胞和肝脏、心脏、脑组织脂质过氧化反应的发生，具有防治疾病、抗衰老等功能，可进一步开发成医药、化妆品等产品添加剂使用。
文档编号C12R1/07GK101284872SQ20081006429
公开日2008年10月15日 申请日期2008年4月9日 优先权日2008年4月9日
发明者刘晓兰, 杰 林, 王晓杰, 郑喜群 申请人:齐齐哈尔大学