一种许氏平鮋免疫增强蛋白hmgb1基因及编码蛋白和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种许氏平触免疫增强蛋白编码基因及 其蛋白制备和应用。
【背景技术】
[0002] 高迀移率族蛋白（HMGB)家族包括HMGBl, HMGB2, HMGB3和HMGB4,其中在鱼类中研 究较多的是HMGBl，其次是HMGB2。HMGBl是一种存在于真核细胞细胞核内的非组蛋白染色 体结合蛋白，因其在聚丙烯酞胺凝胶电泳中迀移速度快而得名。研究发现，HMGBl存在于大 多数动物体内。该类蛋白的主要特征在于他们均含有两个HMG结构域以及一个酸性羧基端 区域。在哺乳动物中，细胞核的HMGBl在核小体结构的稳定、DNA错配的修复和基因表达的 调控等方面起重要的作用。目前研究证实，当宿主受到病原感染后，细胞核的HMGBl会迀移 到细胞质，迀移到细胞质的HMGBl可刺激机体产生一系列的免疫反应，包括增强巨噬细胞 的呼吸爆发和吞噬作用以及促进淋巴细胞的增殖作用，增强TNF-α诱导因子的产生等。因 此，HMGBl在宿主对抗病原侵染的天然免疫中发挥重要作用。
【发明内容】
[0003] 本发明目的在于提供一种具有核酸结合特性的许氏平触免疫增强蛋白HMGBl编 码基因及其蛋白制备和应用。
[0004] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0005] 本发明的HMGBl为序列表SEQ ID No. 1中的氨基酸序列，其编码基因为序列表SEQ ID No. 2中的碱基序列。
[0006] 1)质粒pHMGBl的构建：
[0007] 以鳗弧菌刺激的许氏平触头肾cDNA为模板，用引物HMGB1F1和HMGB1R1进行PCR 扩增。PCR产物纯化后与载体pEasy-Tl连接，构建成质粒pTIHMGBl。将pTIHMGBl和质粒 PET259分别用限制性内切酶EcoRV和SwaI酶切，分别回收0. 621kb和5. 4kb片段，将这二 个片段用T4DNA连接酶连接，构建成质粒pHMGBl。
[0008] 2) HMGBl的重组表达和蛋白纯化：
[0009] 将步骤1)的质粒pHMGBl转化大肠杆菌BL21Transetta(DE3)，在含卡那霉素和氯 霉素的LB培养基上筛选转化子BL21/pHMGBl。将BL21/pHMGBl接种于含有卡那霉素和氯霉 素的LB培养基中，在37°C振荡培养至0D600约为0. 50,加入ImM异丙基-β -D-硫代半乳 糖苷，继续培养4小时，进行蛋白诱导表达。随后用nickel-nitrilotriacetic acid亲和 层析柱纯化重组蛋白。即为序列表SEQ ID No. 1中氨基酸序列所示的重组HMGBl蛋白。 [0010] 免疫增强蛋白可作为免疫增强剂用于增强鱼体的对鳗弧菌的抵抗能力。
[0011] 本发明具有如下优点：免疫增强蛋白在宿主被病原菌侵染时，能迅速激活宿主天 然免疫应答。
【附图说明】：
[0012] 图1为本发明实施例提供的重组后HMGBl蛋白与DNA的结合的电泳图谱。
【具体实施方式】
[0013] 下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而 非以任何形式对本发明进行限制。
[0014] 实施例1
[0015] 本发明的HMGBl为序列表SEQ ID No. 1中的氨基酸序列，其编码基因为序列表SEQ ID No. 2中的碱基序列。
[0016] 序列表 SEQ ID No. 1 为：
[0017] MVKEPGKPRGKMSSYAYFVQTCREEHKKKHPEASVNFSEFSKKCSERWKMMSAKEKGKFEDLARSDKVR YEREMMSYIPPRGSKTKKFKDPNAPKRPPSAFFVFCAEYRPKVKGEAPGLTIGEVAKRLGEMWNGTASEDKQPFEKK AAKLKEKYEKDVAAYRAKGKPGAAPTAAAPSKAPAKVEKKDDDDDDDDDEDDDDFDDDDD
[0018] (a)序列特征：
[0019] ?长度：206
[0020] ?类型：氨基酸序列
[0021] 鲁链型：单链
[0022] 鲁拓扑结构：线性
[0023] (b)分子类型：蛋白质
[0024] (C)假设：否
[0025] (d)反义：否
[0026] (e)最初来源：许氏平触
[0027] (f)结构特征：该蛋白预期含有两个HMG结构域（分别由氨基酸7-79和93-163组 成）。
[0028] 序列表 SEQ ID No. 2 为：
[0029] ATGGTGAAAGAACCAGGAAAGCCGAGGGGCAAGATGTCCTCCTATGCCTATTTTGTCCAGACTTGTC GGGAGGAGCACAAGAAGAAGCACCCCGAAGCTTCGGTCAACTTCTCTGAGTTCTCCAAGAAGTGCTCTGAGCGGT GGAAGATGATGTCTGCCAAGGAGAAGGGCAAATTTGAGGACCTGGCCAGGTCGGACAAGGTACGCTATGAGAGGG AGATGATGAGCTACATACCACCCAGGGGATCCAAGACGAAGAAGTTCAAGGACCCTAATGCCCCCAAGAGACCCC CATCTGCCTTCTTCGTCTTTTGCGCGGAGTATCGCCCCAAGGTGAAAGGCGAGGCCCCTGGTCTGACCATTGGAG AAGTTGCCAAGAGGCTGGGTGAGATGTGGAACGGCACCGCTTCAGAGGACAAGCAGCCCTTTGAGAAGAAGGCAG CTAAATTGAAGGAGAAGTATGAGAAGGACGTCGCAGCATACCGCGCTAAGGGCAAACCAGGCGCCGCACCAACAG CAGCAGCACCAAGCAAAGCCCCGGCCAAGGTAGAGAAGAAGGACGACGACGACGACGATGATGATGACGAGGACG ACGACGACTTCGATGATGACGACGACTAG
[0030] (a)序列特征：
[0031] ?长度：621
[0032] ?类型：碱基序列
[0033] (b)分子类型：基因
[0034] (C)假设：否
[0035] (d)反义：否
[0036] (e)最初来源：许氏平触
[0037] 实施例2
[0038] 高迀移率族蛋白1的制备方法：
[0039] 1)质粒pHMGBl的构建：
[0040] 对HMGBl编码基因对应的氨基酸序列进行分析，以去除编码信号肽和终止密码的 基因序列为模板，设计正向引物HMGB1F1和反向引物HMGB1R1。以鳗弧菌刺激的许氏平触头 肾cDNA为模板，用引物HMGB1F1和HMGB1R1进行PCR扩增。扩增条件为：94°C 60s预变性模 板 DNA,然后 94°C 40s, 55°C 60s, 72°C 30s, 5 个循环后改为 94°C 40s, 61°C 60s, 72°C 30s, 25 个循环后再在72°C延伸7min。PCR产物纯化后与载体pEasy-Tl(购于"全式金（北京） 生物技术有限公司"）于室温连接10分钟，连接混合液转化大肠杆菌后在含氨苄青霉素 (100 μ g/ml)、Xgal (40 μ g/ml)、异丙基-β -D-硫代半乳糖苷（24 μ g/ml)的LB培养基上培 养18-24小时，筛选转化子提取质粒，即为质粒pTIHMGBl。
[0041] 将上述质粒pTIHMGl和质粒pET259(质粒pET259构建过程参见 Zheng WJj HuYHj Sun L.Cloning and analysis of a ferritin subunit from turbot (Scophthalmus maximus). Fish Shellfish Immunol. 2010a ；28 (5 - 6),829 - 836.) 分别用限制性内切酶EcoRV和SwaI酶切