A型口蹄疫基因工程复合表位蛋白及疫苗的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于口蹄疫免疫技术领域，具体涉及一种A型口蹄疫基因工程复合表位蛋 白及疫苗。
【背景技术】
[0002] 口蹄疫（foot-and-mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus, FMDV)引起偶蹄动物的一种急性、高度接触性、发热性传染病，以传播迅 速、感染率高而著称。该病一旦暴发将会造成巨大的经济损失。FMDV有七个血清型，分别为 0、A、C、Asia l、SATl、SAT2、SAT3〇
[0003] 我国口蹄疫流行由来已久，目前流行的血清型主要有0型和A型。Asia 1型处于 基本控制状态（自2009年5月以后至今近6年时间内亚洲I型在我国再未发生)。0型的流 行有所缓和，A型流行增加，猪发病病例增多。2009年A型东南亚拓扑型（A/SEA-97/G1)引 发牛口蹄疫，2012年2月至2013年1月无临床病例、但病原广泛存在。2013年2月A型东 南亚拓扑型病毒的另一分支（A/SEA-97/G2)引起广东茂名猪发生FMD，截止同年8月A型在 全国发生16起，波及广州、云南、青海、西藏和新疆5个省（自治区）。同时，东南亚地区国家 还存在A/IRAN/05等较多谱系的A型口蹄疫病毒，疫情形势复杂，时刻威胁着我国畜牧养殖 业的健康发展。不同谱系A型口蹄疫病毒的抗原性变异较大，交叉免疫保护作用较差，给疫 苗研究带来了困难。研究抗原谱广的疫苗产品，将为我国口蹄疫防控提供重要的技术支撑。
[0004] 在FMD流行的国家，疫情的控制仍然依赖于现有的传统灭活疫苗以及当地兽医工 作者的辛勤劳动，通过强制性高强度的免疫，逐步减少疫情的发生。但是由于口蹄疫病毒本 身免疫原性弱，以及灭活疫苗生产成本的限制等因素，造成疫苗的免疫持续期较短，保护水 平较低，而且个体差异较大，保护性抗体产生的水平不整齐；同时灭活疫苗的生产需要高级 别的防护措施以消除病毒逃逸等安全隐患；而且，非纯化的灭活疫苗多次免疫会产生非结 构蛋白抗体，给感染动物与免疫动物的鉴别诊断带来困难。另外，接种全病毒灭活疫苗不能 阻断病毒的持续感染状态。由于这些因素，促使人们研制更加高效安全的新型FMD疫苗。随 着国内外免疫学研究的深入、以及抗原递呈机理与方法的研究进展，在疫苗分子设计、复合 表位疫苗与免疫佐剂等方面都取得了明显进展。
[0005] 与传统灭活疫苗相比，口蹄疫复合表位蛋白疫苗具有以下的优点：生产过程不涉 及感染性的FMDV，不存在散毒的危险；在同一种表位蛋白中引入多个谱系的保护性抗原表 位，拓展表位蛋白的抗原谱，从而使表位蛋白疫苗所诱导产生的免疫应答更具有广谱性；通 过与通用的T细胞表位融合设计，形成复合表位蛋白，刺激产生更全面的体液免疫与细胞 免疫应答；利用非疫苗用病毒蛋白建立的诊断方法可对疫苗免疫动物和自然感染动物进行 有效区分，从而可准确评估动物的感染状况，为疫病防控提供准确的监测技术支撑。口蹄疫 表位蛋白疫苗弥补了目前传统疫苗所存在的诸多不足，成为口蹄疫新型疫苗发展的主要趋 势之一。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是克服现有技术的疫苗缺陷，提供一种A型口蹄疫基因工程复合表 位蛋白和疫苗，利用该疫苗免疫动物，能够产生很好的保护性免疫效果，是一种安全、高效 的口蹄疫新型分子疫苗。
[0007] 本发明的第一个目的是提供一种A型口蹄疫基因工程复合表位蛋白，所述复合表 位蛋白的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No. 2。
[0008] 本发明的A型口蹄疫基因工程复合表位蛋白包含由A/SEA/97，A/IRA/05，A22三 个谱系中不同流行毒株的主要中和性抗原表位区、通用T细胞表位以及表位间的间隔序列 串联组成，表位间的间隔序列有助于蛋白形成稳定的空间结构，提高蛋白的免疫原性；并在 重组蛋白末端融合的6个组氨酸标签，以便于表位蛋白的分离纯化。
[0009] 本发明的第二个目的是提供一种核苷酸序列，编码权利要求1所述的A型口蹄疫 基因工程复合表位蛋白； 作为优选，所述核苷酸序列为序列表中SEQ ID No. 1。
[0010] 本发明的第三个目的是提供一种A型口蹄疫基因工程复合表位蛋白疫苗，所述疫 苗包含权利要求1所述的A型口蹄疫基因工程复合表位蛋白，和药学上可接受的媒介物； 作为优选，所述疫苗包括权利要求1所述的A型口蹄疫基因工程复合表位蛋白和Toll 样受体9的配体CpG。
[0011] 作为优选，所述疫苗由水相和油相按比例混合后制备而成；所述水相的溶质为权 利要求1所述的A型口蹄疫基因工程复合表位蛋白和Toll样受体9的配体CpG ;所述油相 为 Montanide ISA-201 油佐剂。
[0012] 作为优选，所述的A型口蹄疫基因工程复合表位蛋白与Toll样受体9的配体CpG 的重量比为5: (2-4)。
[0013] 作为优选，所述水相和油相的体积比为1: (0.95-1.05)。
[0014] 作为优选，所述疫苗的主要组分含量为复合表位蛋白250 μ g/mL，CpG佐剂150 μ g/mL ; 作为优选，免疫有效量为成年动物每头份2 mL，幼年动物每头份I mL。
[0015] 本发明的第四个目的是提供上述疫苗的制备方法，将权利要求1所述的A型口蹄 疫基因工程复合表位蛋白和Toll样受体9的配体CpG溶于磷酸盐缓冲液中，得到水相；将 水相与油相等温度充分混合，乳化，得疫苗。
[0016] 本发明的第五个目的是提供上述疫苗在制备预防和/或控制A型口蹄疫病毒的药 物中的应用。
[0017] 作为优选，所述疫苗在制备预防和/或控制猪、牛或羊A型口蹄疫的药物中的应 用。
[0018] 经实验，应用本发明的疫苗免疫动物，一周后就可检测到A型FMDV特异性抗体，抗 体效价不断升高，免疫四周时抗体效价最高。用A型口蹄疫流行毒攻毒后，疫苗免疫组猪均 可完全抵抗强毒攻击。疫苗效力试验结果表明，该疫苗每头份的效力为10. 81 PD50,能够作 为一种新型A型口蹄疫基因工程疫苗使用。
【附图说明】
[0019] 附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实 施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中： 图1为重组菌A8抗原表达产物SDS-PAGE ;其中，M为蛋白分子量Marker ;1为未诱导 的重组菌pET28a-A8对照；2为重组菌pET28a-A8诱导3小时产物；3为重组菌pET28a-A8 诱导5小时产物； 图2为重组菌A8抗原Western Blotting检测结果图；其中，M为预染的蛋白分子量 Marker ;1为未诱导的重组菌pET28a-A8对照；2为诱导的pET28a载体对照；4, 5为重组菌 pET28a-A8诱导表达产物； 图3为A8抗原表达纯化后SDS-PAGE分析图。M蛋白分子量Marker ; 1为pH值为5. 9 的洗脱缓冲液洗脱的目的蛋白；2为pH值为4. 5的洗脱缓冲液洗脱的目的蛋白。
【具体实施方式】
[0020] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市 售。
[0021] 试剂 1、IX IB Wash Buffer :EDTA 10mmol/L，Tris-HCl 20mmol/L，pH 7. 5，Triton X-100 l%〇
[0022] 实施例1 I、A8免疫原的设计与表达 本申请人根据国内外A型口蹄疫流行病学信息，设计并合成了免疫原基因 A8。其中AS 包含A/SEA/97, A/IRA/05, A22三个谱系中不同流行毒株的主要中和性抗原表位区以及通 用T细胞表位，各表位之间以甘氨酸-甘氨酸（GG)、甘氨酸-甘氨酸-半胱氨酸（GGC)或甘 氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-甘氨酸-半胱氨酸（GPGPGC)的间隔氨基酸序列相连，以 形成稳定的蛋白空间结构，最后加6组氨酸标签序列，以有利于表达蛋白的纯化。设计好的 序列交由南京GenScript公司进行编码序列的优化与合成，两端分别加入Nco I酶切位点/ 启始密码子与终止密码子Hind III酶切位点，合成序列经Nco I/Hind III酶切位点插入 pET28a载体中，用于复合表位蛋白A8的表达。编码复合表位蛋白的核苷酸序列如下，为序 列表中SEQ ID No. 1，其蛋白序列为序列表中SEQ ID No. 2。
[0023] ATGGCTAAGT TCGTGGCTGC ATGGACGCTG AAAGCAGCAG CCGGTGGTTG CGTGTACAGC GGTACATCCA AATATTCTGC CCCTCAAAAT CGTCGCGGCG ATAGCGGACC ACTGGCAGCA CGTCTGGCAG CTCAGCTGCC GGCATCCTTC AACTTTGGTG GTGCCGTGGA AGTCAGCTCC CAGGACCGCC ACAAACAAAA GATCATTGCA CCAGCCAAAC AAGGCGGAGT GTACTCAGGT ACTAGTAAGT ATAGTGCGTC GCAGAATCGT CGCGGCGATC TGGGCCCTCT GGCTGCTCGC CTGGCTGCTC AGCTGCCAGC TAGCTTCAAC TTTGGACCTG GTCCCGGCTG CGTCTACAAT GGCGTTTCGA AGTATAGCAC CACTGGAAAT GGTCGTCGCG GAGATCTGGG TTCTCTGGCA GCACGTGTCG CAGCTCAGCT GCCTTCTTCA TTCAACTTTG GTGGCGCAGT TGAGGTGCTG TCACAGGACC GCCATAAACA AAAGATCATT GCCCCCACCA AACAGGGTGG TGTGTACTCC GGTACTTCTA AGTATTCAGC ACCACAGAAC CGTCGCGGCG ACCTGGGTCC GCTGGCTGCT CGCCTGGCCG CTCAGCTGCC TGCGTCCTTC AACTTTGGCC CGGGACCAGG TTGCGTTTAC AATGGCACGA CAAAATATTC TACGGGTAAC GCAGGACGTC GCGGCGATTT AGGCTCACTG GCAGCACGTG TGGCAGCTCA ACTGCCAGCG AGCTTCAATT TTGGCGGAGC TGTCAAGGTT ACCAGCCAGG ACCGTCACAA ACAACGCATC ATTGCGCCGG CTAAGCAGGG TGGCGTGTAC AACGGCACGA GTAAGTATTC GGCACCAGCA ACACGTCGCG GCGATCTTGG CAGTCTGGCT GCTCGTCTGG CTGCCCAGCT GCCAGCATCG TTCAACTATT GCGGTGGCAC CGCCAAATCT AAAAAGTTCC CATCCTACAC CGCCACCTAT CAGTTCCACC ACCACCATCA CCACTAA 上述序列中各段核苷酸编码氨基酸序列的来源与功能如下表1所示。
[0024] 表1. A8复合表位蛋白编码序列中各段氨基酸来源与功能
各表位间的间隔氨基酸序列不同时