，会得到不同的蛋白空间结构；经实验证实，当氨基 酸序列为本专利中A8蛋白的序列时，能够得到一种稳定的蛋白空间结构，使得最终得到的 A8复合表位蛋白的免疫原性和免疫效果最佳。
[0025] 2、A8蛋白的表达与 Western Blotting检测 将步骤1中构建的表达A8复合表位蛋白的载体，命名为pET28a-A8,将此重组质粒转化 大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，将鉴定阳性的重组菌在卡拉霉素抗性的LB液体培养基 中培养过夜，然后按1%量转接到含0. 〇75mg/mL卡拉霉素的LB培养基中，37°C培养至对数 生长期（OD6。。为0. 5~1.0)，加入IPTG至终浓度为I mmol/L，37°C振荡培养3 h、5 h后，收 集I mL表达菌，裂解菌体后进行SDS-PAGE分析。结果，表达的A8蛋白大小介于35~40kD 之间，与预期的37kD大小相符，诱导5 h时A8蛋白表达量大，如图1所示。
[0026] 表达蛋白经SDS-PAGE电泳分离后转移至硝酸纤维素膜与猪FMDV阳性血清反 应，诱导的重组菌pET28a-A8出现特异性条带，而诱导的pET-28a载体与未诱导的重组菌 pET28a-A8对照未见任何反应带（图2)。说明表达蛋白具有很好的反应活性。
[0027] 3、A8蛋白包涵体的大量制备与溶解 取过夜培养的转化菌5 mL接种于500 mL LB培养液(含75Pg/mL卡那霉素）中，37°C， 250 r/min培养至OD6。。为0. 5~I. 0时，加入IPTG至终浓度为I mmol/L，诱导表达5 h，得 诱导表达后的重组A8蛋白。
[0028] 将诱导表达后的重组A8蛋白于4°C 10000 r/min离心15 min，收集菌体，弃上清， 每100 mL培养物加10 mL冰浴的IX IB Wash Buffer重悬沉淀，加入终浓度为100 μ g/ mL的溶菌酶，30°C温育15 min后，置于冰浴中超声波裂解至细胞完全裂解，溶液不再黏 稠。12000 r/min离心10 min，弃上清，每100 mL菌液的沉淀加10 mL冰浴的IXIB Wash Buffer重复洗涤一次，重悬后转移至已知重量的离心管中，12000 r/min离心10 min收集 包涵体，用卷纸吸干管底部微量液体。计算出包涵体的湿重，标准的包涵体重量为1~4 mg/ mL培养物； 室温下准备含有0.3%的N-十二烷基肌氨酸钠的IX IB Solubilization Buffer (50 mM CAPS，pH 11. 0)(即 49. 5mL IXIB Solubilization Buffer 中加入 0.5mL 30% N-十二烷 基肌氨酸钠)，按照包涵体湿重计算所要加入的IXIB Solubilization Buffer用量，将包 涵体的量调整到10~20 mg/mL。向包涵体中加入计算量的IX IB Solubilization Buffer， 轻轻混匀，反复吹打，破碎大量细胞碎片，室温孵育15 min，可适当延长时间至蛋白完全溶 解，12000 r/min离心30 min弃去不可溶物质，上清即为粗提的包涵体。
[0029] 4、重组A8蛋白的亲和层析纯化 在每4 mL包涵体裂解液中加入I mL 50%的Ni-NTA His .Bind Resin，轻柔混合均匀 后，室温条件下以200 r/min摇晃2 h，使目的蛋白与Ni-NTA His ^Bind Resin发生完全的 特异性结合；待液体流干，用 Washing Buffer (100 mM NaH2PO4,10 mM Tris .C1，8M urea; pH 6. 3)洗净未结合杂蛋白，洗涤2次，每次洗2个柱体积。最后用不同pH值（5. 9和4. 5) 洗脱缓冲液（100 mM NaH2P04，10 mM Tris*Cl，8M urea)洗脱柱体，洗脱4次，每次洗脱1 个柱体积。收集洗脱下的溶液为纯化后的A8蛋白，取部分蛋白溶液SDS-PAGE电泳分析，结 果pH值为5. 9的洗脱液中A8蛋白含量少，而pH值为4. 5的洗脱液中A8蛋白含量大，目的 蛋白纯度达95%以上（图3)。目的蛋白纯化达到制苗要求。
[0030] 5、纯化后的重组A8蛋白复性及浓度测定 将纯化后的重组A8蛋白装入透析袋。先用50倍体积的含0.1 mmol/ L DTT的复性液 (20 mmol/ L Tris-HCl，pH 8. 5) 4°C透析3h以上，并换液1次，继续透析3h以上；用不 含DTT的复性液再透析3h以上，并换液1次，以除去DTT。
[0031] 用Bradford蛋白质定量试剂盒(碧云天公司）测定纯化复性后重组A8蛋白的浓 度，纯化蛋白的浓度为I. 2 mg/mL。
[0032] 6、疫苗配制 水相的制备：将步骤4纯化后的重组A8蛋白与Toll样受体9的配体CpG分别按终浓 度为500 μ g/mL和300 μ g/mL配制于pH为7. 2~7. 6的磷酸盐缓冲液； 油相的准备：Montanide ISA-201油佐剂，购自法国Seppic。
[0033] 将水相和油相分别平衡至室温，再按体积比(水相：油相=1 : 1)真空进料到乳化 罐中，循环搅拌至水相与油相充分混合，再通过均质机乳化成双向油乳剂（w/0/w)疫苗。
[0034] 7、动物免疫 用体重40kg左右的健康易感猪(健康易感猪标准：乳鼠中和抗体滴度不高于1 : 4或 细胞中和抗体滴度不高于1 : 8或液相阻断ELISA抗体效价不高于1 : 8且3ABC抗体检 测为阴性)1〇头，分为2组，每组5头。将疫苗于耳根后肌肉注射5头猪，每头注射2 mL或 ImL (成年猪2 mL每头份，仔猪I mL每头份)。另一组每头注射2 mL PBS。接种后每周采 血一次，用间接ELISA测抗体，接种后28日，每头猪耳根后肌肉注射A/SEA/97系HNXX株乳 鼠毒2 mL (含1000 ID5。）。连续观察10日，对照猪均应至少有一蹄出现口蹄疫症状。免疫 猪出现任何口蹄疫症状即判为不保护。
[0035] 试验结果显示，疫苗免疫猪第7天就可检测到FMDV特异性抗体，抗体效价不断升 高，免疫第28天时抗体效价最高。而PBS免疫猪一直没检测到FMDV特异性抗体。用1000 个猪半数感染量（PID m)的A/SEA/97系HNXX株猪体适应毒攻击后，疫苗免疫组猪均可完全 抵抗强毒攻击，攻毒后10天内无一头猪表现出临床症状。对照组（PBS免疫组)五头猪于攻 毒后3天内全部发病(结果见表2)。说明重组A8抗原是一种很好的免疫原，添加 CpG能够 诱导免疫猪产生保护性的免疫应答，是一种新型的免疫增强型口蹄疫疫苗。
[0036] 表2.动物免疫试验结果
8、疫苗效力试验 根据OIE推荐疫苗效力试验标准，对18头健康大白猪(健康易感猪标准：乳鼠中和抗 体滴度不高于1:4或细胞中和抗体滴度不高于1:8或液相阻断ELISA抗体效价不高于1:8 且3ABC抗体检测为阴性)随机分为4组，其中3组每组5头猪，分别接种不同剂量(全剂量、 1/3剂量和1/9剂量）的疫苗。剩余1组3头猪接种PBS，作为对照。接种28天后，采血测 液湘阻断ELISA抗体效价，并将每头猪耳根后肌肉注射A/SEA/97系HNXX株乳鼠毒2 mL(含 1000 ID50)。连续观察10日，对照猪均应至少有一蹄出现口蹄疫症状。免疫猪出现任何口 蹄疫症状即判为不保护。根据免疫猪保护数，按Reed-Muench法计算TO50。
[0037] 结果表明（表3)，免疫28天后，全剂量和1/3剂量组的猪均产生较高水平的液湘阻 断ELISA抗体，1/9剂量组抗体效价相对较低，而PBS对照组动物均未产生抗体。攻毒后， 全剂量和1/3剂量组的猪均完全保护，1/9剂量组有2头猪未保护，PBS对照组动物全部发 病。根据攻毒保护结果，计算该疫苗每头份的效力为10. 81 PD50,远远高于OIE对于猪口蹄 疫疫苗不低于3 PD50/头份的标准，也高于我国的口蹄疫疫苗效力不低于6 PD50/头份的 规定，显示该疫苗具有较好免疫效力。
[0038] 表3.疫苗效力试验结果
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管 参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对 前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在 本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护 范围之内。
【主权项】
1. 一种A型口蹄疫基因工程复合表位蛋白，其特征在于：所述复合表位蛋白的氨基酸 序列为序列表中SEQIDNo. 2。2. -种核苷酸序列，其特征在于：编码权利要求1所述的A型口蹄疫基因工程复合表 位蛋白； 作为优选，所述核苷酸序列为序列表中SEQIDNo. 1。3. -种A型口蹄疫基因工程复合表位蛋白疫苗，其特征在于：所述疫苗包含权利要求1 所述的A型口蹄疫基因工程复合表位蛋白，和药学上可接受的媒介物； 作为优选，所述疫苗包括权利要求1所述的A型口蹄疫基因工程复合表位蛋白和Toll样受体9的配体CpG。4. 根据权利要求3所述的疫苗，其特征在于：所述疫苗由水相和油相按比例混合后制 备而成；所述水相的溶质为权利要求1所述的A型口蹄疫基因工程复合表位蛋白和Toll样 受体9的配体CpG;所述油相为MontanideISA-201油佐剂。5. 根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于：所述的A型口蹄疫基因工程复合表位蛋 白与Toll样受体9的配体CpG的重量比为5: (2-4)。6. 根据权利要求5任一所述的疫苗，其特征在于：所述水相和油相的体积比为1: (0· 95-1. 05)。7. 根据权利要求3-6任一所述的疫苗，其特征在于：所述疫苗的主要组分含量为复合 表位蛋白250μg/mL，CpG佐剂150μg/mL;作为优选，免疫有效量为成年动物每头份2 mL;幼年动物每头份1mL。8. 权利要求4-6任一所述的疫苗的制备方法，其特征在于：将权利要求1所述的A型口 蹄疫基因工程复合表位蛋白和Toll样受体9的配体CpG溶于磷酸盐缓冲液中，得到水相； 将水相与油相等温度充分混合，乳化，得疫苗。9. 权利要求3-7任一所述的疫苗在制备预防和/或控制A型口蹄疫的药物中的应用。10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述疫苗在制备预防和/或控制猪、牛 或羊A型口蹄疫的药物中的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种A型口蹄疫基因工程复合表位蛋白，其特征在于：所述复合表位蛋白的氨基酸序列为序列表中SEQ？ID？No.2。本发明还提供含有上述A型口蹄疫基因工程复合表位蛋白的疫苗。应用本发明的疫苗免疫动物，一周后就可检测到A型口蹄疫病毒特异性抗体，抗体效价不断升高，免疫四周时抗体效价最高。用A型口蹄疫流行毒攻毒后，疫苗免疫组猪均可完全抵抗强毒攻击，能够作为一种新型A型口蹄疫基因工程疫苗使用。
【IPC分类】A61K39/135, C07K14/09, C12N15/42, A61P31/14
【公开号】CN105399802
【申请号】CN201510897656
【发明人】曹轶梅, 卢曾军, 刘在新, 李冬, 孙普, 付元芳, 白兴文, 李平花, 包慧芳, 陈应理
【申请人】中国农业科学院兰州兽医研究所
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2015年12月8日