专利名称：：野百合试管鳞茎的诱导方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，具体地涉及一种贵州野百合(Zi//Wm6raww7F五.)试管鳞茎的诱导方法。
背景技术：
：百合花形优雅，花色纯洁艳丽，是园林绿化和家庭装饰的上好材料。百合鳞茎富含蛋白质、脂肪、淀粉、糖及维生素B1、B2和维生素C等营养成分，是一种好的强身滋补品。俗话说得好"山高不过圣堂山，好吃不过百合粉"。随着人类社会和经济的发展，百合已成为高档的食用、药用、观赏多用的高收入经济作物。贵州独特的地理环境和气候条件，蕴藏有丰富的百合资源，其中野百合全省均有分布。以贵州野百合为原材料的名牌产品就有务川百合#\沿河百合4分等十来种。近年来，由于市场需求增加，人们过度挖掘，加上自然环境的恶化，贵州野百合资源形势严峻。同时，野百合具有较强的抗逆性，是百合育种的好材料，其保护对百合种质创新具有重要意义。迄今为止，未见有对贵州野百合进行试管鳞茎诱导和快速繁殖方法的报道。百合试管鳞茎诱导技术是目前百合规模化生产手段之一，影响百合试管鳞茎形成和膨大的因素是多方面的，如外植体来源、消毒试剂的选择及作用时间、激素配比、蔗糖浓度、光照、培养温度等等，在已报道的百合试管鳞茎诱导与快速繁殖中，外植体的消毒剂都选用O.P/。的升汞。升汞的消毒能力不可置疑，但对实验操作人员的健康和环境的清洁却存在较大的威胁，对实验材料百合鳞茎有较大的腐蚀，重金属汞是否继续存在于百合试管鳞茎还有待研究，而且升汞价格还很贵。总之，升汞在污染环境的同时，外植体通常还会出现变色、腐烂等不利于新鳞茎生成。培养基的激素成分和配比也是影响野百合鳞茎芽形成的重要因素，野生百合在含有不同激素的培养基上形成鳞茎芽的数量存在着差异，诱导培养基和增殖培养基的激素配比不一样，配制时需分开，操作复杂。在选择部位上，不同部位鳞茎芽的形成差异也;f艮大。
发明内容本发明的目的在于提供一种能缩短出苗时间，节约成本、操作简单的野百合试管鳞茎的诱导方法。野百合试管鳞茎的诱导方法，包括如下步骤(1)选取无病虫害的野百合鳞茎鳞片，用自来水冲洗后，75°/酒精浸泡30秒，无菌水冲洗3~4次，再加入3°/次氯酸钠浸泡10分钟，中间摇动几下，用无菌水沖洗34次，再用3%次氯酸钠浸泡IO分钟，中间摇动几下，后用无菌水冲洗67次后，然后置于有无菌滤纸的培养皿中切块备用；(2)将鳞片基部接种到诱导培养基中培养，培养温度为23-27°C,光照强度为1500Lx，光照时间为每天12小时；鳞茎诱导培养基以MS培养基为基本培养基，激素组合为6-碱基嘌呤(6-BA)和萘乙酸(NAA),用量为NAA0.3mg/L，6-BA为1.5mg/L，蔗糖浓度3%,琼脂粉用量为0.75%，培养基PH值5.8;(3)诱导培养30天后，将长出的试管鳞茎置增殖培养基(配方与诱导培养基相同)中进行增殖培养，接着在增殖培养基(配方与诱导培养基相同)中进行增殖培养，当鳞茎直径达l-2cm时，取出种植到有消毒基质的器皿中，浇透水，覆盖保鲜膜保湿，移苗3-5天后通风透气，待试管苗长出新叶，除去保鲜膜。本发明与现有技术相比，选用3%次氯酸钠作消毒剂，重复处理一次，消毒效果非常理想，重要的是在对操作人员、实^r材料和环境都不存在不好的影响，价格低廉，节省成本同时不会影响新鳞茎生成。在MS添加NAA0.3mg/L和6-BA1.5mg/L组合的培养基上，其鳞茎的萌芽率最高，可以得到大量健壮的野生百合试管苗，选用相同的培养基，操作简单，而且在增殖过程中，试管鳞茎还会长根，节省了生根培养步骤，缩短了出苗时间。在选择部位上，选用带基部的鳞片其增殖系数通常较高，因此，在野百合的繁殖过程中，切取鳞茎的基部做外植体。要实现百合资源的可持续开发利用，运用组织培养技术对现存的百合种类进行培养具有重要的经济价值。具体实施方式实施例1:(1)采自贵阳市黔灵山生长健壮、开花性状好、无病虫害的野百合植抹的鳞茎鳞片；用自来水沖洗后，75°/。酒精浸泡30秒后，无菌水冲洗3~4次，再加入3%次氯酸钠浸泡10分钟，中间摇动几下，用无菌水沖洗3-4次，再用3%次氯酸钠浸泡10分钟，后用无菌水冲洗67次后，然后置于有无菌滤纸的培^JCL中切块备用；次氯酸钠的消毒效果经过多次试验得出，用3%次氯酸钠浸泡10分钟，处理两次，消毒效果也非常理想，在接种的120个三角瓶，共360块外植体中，只有4瓶6块外植体污染，其中l瓶为细菌污染。结果显示，用3%次氯酸钠对百合鳞茎外植体进行消毒完全是可行的，而且对操作人员、实验材料和环境都不存在不好的影响，价格还低廉。(2)不同激素配比对试管鳞茎形成的影响当前，未见对贵州野百合进行试管鳞茎诱导和增殖的相关报道，也就是说没有现成的培养基配方供直接使用。为筛选贵州野百合的最佳试管鳞茎诱导培养基，以MS培养基为基本培养基，以细胞分裂素6-碱基嘌呤(6-BA)和生长素萘乙酸(NAA)不同浓度进行配比，研究对贵州野百合鳞茎诱导和增殖的影响。外植体选用消毒过的鳞片基部，培养温度为23-27°C,光照强度为1500Lx,光照时间为每天12小时，接种30天后观察实验结果。结果见表l。表i不同激素配比对贵州野百合试管鳞茎形成的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>从表l可看出，不同浓度的激素配比对贵州野百合鳞茎芽诱导效果存在明显差异。6-BA浓度相同的条件下，NAA的浓度上升，鳞茎芽的萌芽率相应提高，到0.5mg/L时平均可达80.0%以上。当NAA的浓度不变时，6-BA的浓度在1.5mg/L时，野百合的鳞茎芽萌发率最大，诱导的芽数最多，芽长得也较壮，并且芽基部都出现膨大，部分鳞茎芽还长出新根。当6-BA的浓度低于1.0mg/L时，野百合的鳞茎芽萌发率普遍不高，而且长出的芽普遍生长势弱。浓度过高，则导致部分鳞茎芽出现玻璃化现象，不利于增殖。可见，不管是低浓度的激素配比，还是高浓度的激素配比，都不利于野百合鳞茎芽的产生。最好的激素配比就是0.3mg/L的NAA和1.5mg/L的6-BA组合，此时的鳞茎芽萌发率达90.0°/。，诱导的芽数也最多，平均每块外植体2个鳞茎芽。生长势上，鳞茎芽也较壮，没有出现变态芽和玻璃化芽，所以此激素组合比较适合用于野百合鳞茎芽的诱导。不同部位外植体对试管鳞茎形成的影响采用前面筛选得到的野百合试管鳞茎最佳诱导培养基研究发育程度、不同部位外植体对试管鳞茎形成的影响。具体操作是接种时将消毒的贵州野百合鳞茎外层、中、内层以及上、中、下段分开接种。结果外层和中层都见有新鳞茎产生，而内层几乎没有新鳞茎生成。不同的部位对新鳞茎形成的影响见表2。表2不同部位对试管鳞茎生成的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表2显示贵州野百合诱导能力强弱依次为鳞片基部、鳞片中部、鳞片上部。表2中，鳞茎基部诱导鳞茎芽的萌发率可达82.5%,平均每一个鳞茎基部就可形成3-4个新鳞茎芽。而鳞茎的中部和上部的鳞茎芽萌发率却相对比较低，平均芽数也少。上部的鳞茎芽萌发率仅有25.0%,平均鳞茎芽只有l个而已。于是得出，越靠近鳞片基部，器官发生能力也越强，这可能与极性有关。因此，为了获得好的实验结果和降低材料消耗，外植体选择百合鳞茎的基部是最理想的。(3)试管鳞茎的增殖和移栽将筛选的最佳激素配比的诱导培养基用于野百合鳞茎芽的增殖培养，培养条件同诱导培养。结果在接种15天左右，有新的鳞茎芽生成，成丛生状。培养时间越长，芽数越多。25天左右，部分鳞茎芽生出粗壮的根。当鳞茎直径达l-2cm左右时，取出种植到有消毒基质的器皿中，浇透定根水，覆盖保鲜膜保湿，移苗3-5天后通风透气，待试管苗长出新叶，除去保鲜膜。移栽成活率在90%以上。以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。权利要求1、一种野百合试管鳞茎的诱导方法，包括如下步骤(1)选取无病虫害的野百合鳞茎鳞片，用自来水冲洗后，75％酒精浸泡30秒，无菌水冲洗3～4次，再加入3％次氯酸钠浸泡10分钟，中间摇动几下，用无菌水冲洗3～4次，再用3％次氯酸钠浸泡10分钟，中间摇动几下，后用无菌水冲洗6～7次后，然后置于有无菌滤纸的培养皿中切块备用；(2)将鳞片基部接种到诱导培养基中培养，培养温度为23-27℃，光照强度为1500Lx，光照时间为每天12小时；(3)诱导培养30天后，将长出的试管鳞茎置增殖培养基中进行增殖培养，当鳞茎直径达1-2cm时，取出种植到有消毒基质的器皿中，浇透水，覆盖保鲜膜保湿，移苗3-5天后通风透气，待试管苗长出新叶，除去保鲜膜。2、如权利要求1所述的野百合试管鳞茎約诱导方法，其中鳞茎诱导培养基和增殖培养基相同，均以MS培养基为基本培养基，激素组合为6-碱基嘌呤和萘乙酸，用量为NAA0.3mg/L，6-BA为1.5mg/L,蔗糖浓度3%,琼脂粉用量为O.75%,培养基PH值5.8。全文摘要本发明公开了一种野百合试管鳞茎的诱导方法，包括如下步骤(1)选取无病虫害的野百合鳞茎鳞片，用自来水冲洗后，75％酒精浸泡30秒，无菌水冲洗3～4次，再加入3％次氯酸钠浸泡10分钟，中间摇动几下，用无菌水冲洗3～4次，再用3％次氯酸钠浸泡10分钟，中间摇动几下，后用无菌水冲洗6～7次后，然后置于有无菌滤纸的培养皿中切块备用；(2)将鳞片基部接种到诱导培养基中培养，培养温度为23-27℃，光照强度为1500Lx，光照时间为每天12小时；(3)诱导培养30天后，将长出的试管鳞茎置增殖培养基中进行增殖培养，当试管鳞茎直径达1-2cm时，取出种植到有消毒基质的器皿中，浇透水，覆盖保鲜膜保湿，移苗3-5天后通风透气，待试管苗长出新叶，除去保鲜膜。本发明能缩短出苗时间，节约成本、操作简单。文档编号C12N5/04GK101238794SQ20081006864公开日2008年8月13日申请日期2008年3月7日优先权日2008年3月7日发明者令狐克勇,刘红美,方小波申请人:贵阳医学院