专利名称：一种生产氢气的方法
技术领域：
本发明属于生物能源领域，具体涉及一种生产氢气的方法。
背景技术：
18世纪工业革命以来建立的化石能源体系正面临着两大挑战煤炭、石油、天 然气等化石燃料的不可再生性；以及石油炼制产业引起的温室效应、酸雨、粉尘污 染等种种环境问题。这些都极大的推动了风能、太阳能、水能、生物质能、地热能、 海洋能等可再生能源产业的研究和发展。
生物质能一直是人类赖以生存的重要能源，它仅次于煤炭、石油和天然气，居 世界能源消费总量的第四位，在整个能源系统中占有重要地位。在我国，生物质能 占全部能源消耗总量的20%。但长期以来，生物质能在我国商业用能结构中的比率 极小，其主要是作为一次能源在农村利用，约占农村总能耗的70%左右。以生物质 为原料的生物炼制作为一个相对比较年轻的研究领域，系统的研究和开发主要是在 欧洲进行的；而工业领域的发展则主要是在美国。美国生物质技术顾问委员会开展 了一个关于生物能量、生物燃料和生物产物的长期计划和目标，基于生物质的运输 燃料将从2001年占美国燃料消耗的0. 5%增长到2030年的20%。从2006年1月1 日起，我国开始施行《中华人民共和国可再生能源法》，将大大促进可再生能源的 开发利用，增加能源供应，改善能源结构，保障能源安全，保护环境，实现经济社 会的可持续发展。在生物炼制中，基于生物原料的燃料包括固体、液体和气体三种 形式，生物柴油、乙醇、甲醇、甲垸和氢气等，是目前世界上被广泛关注的几种能 源形式。
因为氢气本身无毒，燃烧后仅生成水，所以被认为是理想的清洁能源。氢气不 但是一种优质燃料，还是石油、化工、化肥和冶金工业的重要原料。所有气体中， 氢气最轻，导热性最好；除核燃料外，氢的发热值是所有化石燃料、化工燃料和生 物燃料中最高的；氢可以气态、液态或固态的金属氢化物出现，能适应贮运及各种 应用环境的不同要求。通过生命周期分析，在所有燃料中氢气有最高的原料灵活性， 来源于可再生生产途径的氢气环境友好，不涉及温室气体排放，最终实现化石能源 到可再生能源的平稳转换。相对于日益完备的氢能利用的下游体系，在以可再生资源为原料的生产方面氢 气却没有实现突破。目前，氢气还是主要来自化石燃料的重整转化(占氢气来源的 96%)和电解水制氢(占4%)，这显然未能摆脱原有的化石能源体系。因此，如何可持 续地从自然界中获取氢气尤其受到人们的关注。生物制氢是解决这一问题的重要途
径之一。现代生物制氢的研究始于20世纪70年代的能源危机，到90年代随着对 温室效应的进一步认识，生物制氢作为可持续发展的工业技术再次引起人们的重
视。生物制氢技术包括光驱动过程和厌氧发酵两种路线前者利用光合细菌直接将
太阳能转化为氢气，是一个非常理想的过程，但是由于光利用效率很低，光反应器
设计困难等因素，近期内很难推广应用；而后者采用的是产氢菌厌氧发酵，它的优 点是产氢速度快，反应器设计简单，且能够利用可再生资源和废弃有机物进行生产， 相对于前者更容易在短期内实现。
发酵法制氢的研究始于90年代中，但是由于研究小组不多，进展并不大。90年
代末到本世纪初，由于逐步意识到发酵制氢具有在近期内实现产业化的潜力，在暗 发酵制氢方面的科研投入也大大增加。大量的微生物都具有不同程度的产氢能力， 因此利用发酵产氢微生物，将葡萄糖等生物质转化为氢气在技术本身没有问题，而 一直困扰其应用的是过程经济性的问题，即如何降低发酵制氢的成本，使之可以和 化石能源催化重整制氢的经济性相比拟，或者使之可以与其他生物能源(生物制甲 垸、燃料酒精、生物柴油)相竞争。当前的核心问题是如何提高从葡萄糖到氢气的 转化效率，包括转化速度和转化率。研究者从自然界中分离纯化新的产氢菌种，通 过基因工程改造产氢菌及氢酶，取得了大量的研究成果，有了一定的研究进展，但 是要和传统的化石能源相竞争，还是需要进一步提高能量转化率和提高氢气的转化 速度。
发明内容
本发明的目的是提供一种生产氢气的方法。 本发明提供的生产氢气的方法，是通过在含有磷酸根离子的培养基中培养产氢 微生物生产氢气。
所述培养基中磷酸根离子(无机磷酸根离子、焦磷酸根离子、聚磷酸根离子)
的浓度可为O. 01-0. 50 mol/L。
所述磷酸根离子可为无机磷酸根离子，如(H2P04) — 、 (HP04) 2—或(P04) 3—。 所述无机磷酸根离子的浓度具体可为O. 30 mol/L。所述磷酸根离子可为焦磷酸根离子。
所述焦磷酸根离子的浓度具体可为0.25 mol/L。
所述磷酸根离子可为聚磷酸根离子。 所述聚磷酸根离子的浓度具体可为0.30 raol/L。
每升所述培养基中除所述磷酸根离子外，还可含有以下组分葡萄糖10.0g、
胰蛋白胨5.0、硫酸铵2.0、硫酸镁0.2g;所述培养基的pH可为6.0。
所述产氢微生物具体可为产气肠杆菌(&teroZ^cz^r serogOTes IAM1183)。 上述方法中的培养条件为产氢微生物的适宜培养条件，如当产氢微生物为产气
肠杆菌(j5^ero力3Warae/Y^e/7esIAM1183)时，整个体系培养温度可为25-50°C ，
发酵时间可为5-40 h，发酵pH可为4.5-9.0。
实际进行生产时，具体可采取操作简单、最为广泛使用的批式培养。 在专性厌氧微生物和兼性厌氧微生物代谢过程中，不同专一性的控制机制是调
节电子流。许多微生物能够在氢化酶的作用下形成分子氢，同时解决多余的电子，
此即氢气生成的本质。
2e—+2H+—H2
目前相关研究主要基于三个方面过程参数(温度、PH等)的优化；关键因素 (底物、金属离子、甲酸等)的调节；相关代谢(氢酶、甲酸脱氢酶以及乳酸、乙 醇等路径)基因的调控(Xu匿i Liu， Nanqi Ren， F觀n Song， Chua叩ing Yang, Aijie Wang. Recent advances in fermentative biohydrogen production. Progress in Natural Science 18 (2008) 253-258)。这些方法的最终归结点都 在于使代谢流更多的朝氢气产生路径流动。 一些基因工程菌在实际应用当中还存在 着一些争议。
从能量和氧化还原电位角度考虑，ATP是细胞内部最重要的能量载体。调节控 制ATP的代谢，可以使更多电子流朝生成氢气方向流动，从而可以增强发酵产氢菌 的产氢能力。
通过添加磷酸盐控制胞内ATP水平的机制见图1。磷通过细胞膜磷传输系统进 入细胞内部，在磷酸烯醇丙酮酸合酶作用下生成ATP。 ATP能量物质可在聚磷酸激 酶的作用下生成一类叫做聚磷的能量储存物质。细胞内部的焦磷酸在乙酸激酶的作 用下可使ATP获得再生。所以可以通过调节胞内外的单磷酸盐、焦磷酸盐和多聚磷 酸盐的量，控制细胞的ATP水平以及细胞膜氧化还原电势，从而全局控制细胞电子流的流向及氢气的生成。
在基础培养基中，加入磷酸二氢钠， 一方面起到PH缓冲作用，另一方面加速
磷的传输，加速ATP水平和聚磷水平的调节，将细胞内部的ATP水平提高10倍左 右。在基础培养基中，加入焦磷酸钠，加速乙酸激酶调节系统，加速ADP向ATP的 合成，使得胞内消耗掉的ATP快速得到恢复。在基础培养基中，加入聚磷酸钠，通 过细胞膜上聚磷酸激酶的作用，大量生成ATP物质，降解得到的单磷进入细胞内部 参与ATP生成，从而增大细胞内外的ATP水平，改变细胞的膜电势，从而加速氢气 的生成。因此，在细胞环境中加入磷酸盐，可同时促进ATP快速生成和快速恢复， 从而控制细胞内部的ATP水平以及细胞内部的氧化还原电势，加速碳源的消耗和氢 气的生成效率，并且，磷酸盐可以在培养体系中重复循环利用，并不会造成对环境 的污染。应用本发明的方法，产氢速率可以提高3倍以上，糖利用率可以提高5倍 以上，大大提高了氢气的转化效率。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
图1为通过磷酸盐添加控制胞内ATP水平的机制。 图2为在不同培养基中培养产气肠杆菌时葡萄糖的消耗状况。 图3为在不同培养基中培养产气肠杆菌时氢气的产生状况。
具体实施例方式
能够在代谢过程中产生分子氢的发酵细菌包括兼性厌氧菌和专性厌氧菌，主要 有肠杆菌禾斗(fi7tera6a"e"'ace3e)、 梭菌属(67astrW鹏)、巨型球菌属 (J/e卵5iD力sera)、韦荣氏球菌属(Fei^one^s)、互养球菌属(5yMr(9/ / ococciAS)、 线形醋菌属"ceto/i'2柳eM咖)、醋微球菌属"ce&肌'cro&'咖)、醋弧菌属 C4ce"w7u^'o)、拟杆菌属CfecterozWes)、闪烁杆菌属(/^na'a^/ 3cz^ri鹏)、瘤胃 球菌属(/ 咖j./70coccw5)、真杆菌属(f"/ s"eri咖)、粪球菌属(C。/ r。coccws)等。
以下实施例以产气肠杆菌(^2fei^Z^cz^r aerobe"" I AMI 183)为例，以葡萄 糖作为碳源，进一步阐述本发明的技术方案和效果。
产气肠杆菌(^5^eroZ^"er se/Y^e/ " IAM1183)，购自日本东京大学应用微 生物研究所菌种库。产气肠杆菌为兼性厌氧菌。产气肠杆菌培养温度为37°C。基础 培养基组分(每升)为葡萄糖10. 0g、胰蛋白胨5. 0g、硫酸铵2. 0g、硫酸镁0. 2g。 产气肠杆菌能利用葡糖酸盐、葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、半乳糖、D-甘露醇、 水杨苷、D-阿东醇、间-肌醇、D-山梨醇、L-阿拉伯糖、棉籽糖、L-鼠李糖、麦芽糖、D-木糖、海藻糖、纤维二醇、a-甲基-D-葡萄糖苷、七叶灵、蜜二糖、D-阿拉 伯糖醇、粘质酸盐、D-甘露糖和甘油。也能能利用丙二酸盐、柠檬酸盐和醋酸盐作 为唯一碳源，并能利用一定浓度甲酸。产气肠杆菌可以在log P值为3.2以上的溶 剂(异辛烷、庚垸、己烷、环己烷)中生存，还能在汞存在的条件下生存，表明其 具有处理富溶剂废物的潜力。
为方便陈述，以下实施例中磷酸盐的浓度单位都是以磷酸根离子的摩尔浓度为 基准的。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。 实施例l、采用基础培养基生产氢气
将基础培养基(葡萄糖10.0g/L，胰蛋白胨5.0g/L，硫酸铵2.0g/L，硫酸镁 0.2g/L)的pH调至6.0。在培养基中接入活化后的产气肠杆菌(&fero&cfer 3e^rage/7es IAM1183)，使产气肠杆菌(^fez^ro/ ac"r aeroge/7es IAM1183)的初 始含量为5X108CFU/ml， 37°C、 170rpra培养15h。培养过程中采用厌氧条件，通过 氮气吹扫的方式去除空气中的氧气。培养过程中收集产生的气体，培养结束后，计 算生成的氢气总量，同时检测培养基中葡萄糖的剩余含量。
氢气的测量采用气相色谱的方法(上海精密科学仪器有限公司GC112A型号气 相色谱；TCD检测器；TDX-01不锈钢填充柱；进样器、检测器和柱箱温度分别为120、 120和80。C;氮气作为载气，流速为10ml/min)。葡萄糖的测定采用常规3， 5-二 石肖基7K杨酸比色法(Miller GL. 1959. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal Chem 31(3):426-428.)。
试验重复三次，结果为平均值土标准差的形式。
结果表明培养结束后，1升培养物生产0.46±0.02升(常温常压)氢气。 在批式培养中，只能消耗11%±0. 30%的碳源。
实施例2、采用添加无机磷酸盐的培养基生产氢气
将基础培养基(葡萄糖10.0g/L，胰蛋白胨5.0g/L，硫酸铵2.0g/L，硫酸镁 0.2g/L)的pH调至6.0。分别在基础培养基中加入不同量的磷酸二氢钠，使各培养 基中无机磷酸根浓度的分别为0、 0.02、 0.05、 0.1、 0.15、 0.2、 0.25、 0. 3mol/L。 每种不同无机磷酸根含量的培养基分别接入产气肠杆菌(^^erWacter朋^^e"es IAM1183)，使产气肠杆菌(^fero/ scfer ae/Y^e/7es IAM1183)的初始含量为5 X108CFU/ml， 37°C、 170rpm培养15h。培养过程中采用厌氧条件，通过氮气吹扫的方式去除空气中的氧气。分别收集采用各培养基进行培养时产生的气体，培养结束 后，计算生成的氢气总量，同时检测各培养基中葡萄糖的含量。
氢气和葡萄糖的测定方法同实施例1。
试验重复三次，结果为平均值土标准差的形式。
采用不同培养基培养产气肠杆菌(A/^erotecter 3eroge/7es IAM1183) 15小 时，培养基中的残糖浓度见图2，生成的氢气量见图3。结果表明采用不含无机 磷酸根的培养基时，1升培养物可以生产0.46±0.02升(常温常压)氢气，消耗 11%±0. 30%的葡萄糖碳源；采用无机磷酸根浓度为0. 3 mol/L的培养基时，1升培 养物可以生产1.9士0.50升(常温常压)氢气，消耗97%±0.30%的葡萄糖碳源。
在基础培养基中加入磷酸二氢钠，提高了氢气产量的可能机理是磷酸二氢钠 一方面起到pH缓冲作用，另一方面加速了磷的传输，加速了 ATP水平和聚磷水平 的调节，将细胞内部的ATP水平比之前提高了 IO倍左右。
实施例3、采用添加焦磷酸盐的培养基生产氢气
将基础培养基(葡萄糖10.0g/L，胰蛋白胨5.0g/L，硫酸铵2.0g/L，硫酸镁 0.2g/L)的pH调至6.0。分别在基础培养基中加入不同量的焦磷酸钠，使培养基中 焦磷酸根的浓度分别为O、 0.02、 0.05、 0.1、 0.15、 0.2、 0.25、 0. 3 mol/L。每种 不同焦磷酸根含量的培养基分别接入产气肠杆菌(^^ero&"er seroge;7es IAM1183)，使产气肠杆菌(&z^ro力acter aeroge/ es IAM1183)的初始含量为5 X108CFU/ml， 37°C、 170rpm培养15h。培养过程中采用厌氧条件，通过氮气吹扫的 方式去除空气中的氧气。分别收集采用各培养基进行培养时产生的气体，培养结束 后，计算生成的氢气总量，同时检测各培养基中葡萄糖的含量。
氢气和葡萄糖的测定方法同实施例1。
试验重复三次，结果为平均值士标准差的形式。
采用不同培养基培养产气肠杆菌(&fero力s"e2^er^e/7esIAM1183) 15小时， 培养基中的残糖浓度见图2，生成的氢气量见图3。结果表明采用不含焦磷酸根 的培养基时，1升培养物可以生产0. 46±0. 02升(常温常压)氢气，消耗11%±0. 30% 的葡萄糖碳源；采用焦磷酸根浓度为0. 25 mol/L的培养基时，1升培养物可以生产 2.0士0.50升(常温常压)氢气，消耗97%±0.30%的葡萄糖碳源，而且氢气生成速 度是添加磷酸二氢钠盐产氢速度(实施例2)的1.5倍。
在基础培养基中加入焦磷酸钠，提高了氢气产量的可能机理是焦磷酸钠加速了乙酸激酶调节系统，加速了 ADP向ATP的合成，使得胞内消耗掉的ATP快速的得 到恢复。
实施例4、采用添加聚磷酸盐的培养基生产氢气
将基础培养基(葡萄糖10.0g/L，胰蛋白胨5.0g/L，硫酸铵2.0g/L,硫酸镁 0.2g/L)的pH调至6.0。分别在基础培养基中加入不同量的聚磷酸钠，使培养基中 聚磷酸根的浓度分别为O、 0.02、 0.05、 0.1、 0.15、 0.2、 0.25、 0. 3 mol/L。每种 不同聚磷酸根含量的培养基分别接入产气肠杆菌(^"rote"er aerc^e77es IAM1183)，使产气肠杆菌(&z^ro6a"er aeroge"es IAM1183)的初始含量为5 X108CFU/ral， 37°C、 170rpm培养15h。培养过程中采用厌氧条件，通过氮气吹扫的 方式去除空气中的氧气。分别收集采用各培养基时产生的气体，培养结束后，计算 生成的氢气总量，同时检测各培养基中葡萄糖的含量。
氢气和葡萄糖的测定方法同实施例1。
试验重复三次，结果为平均值土标准差的形式。
采用不同培养基培养产气肠杆菌(&feroZ^cfer seroge/ esIAM1183) 15小时， 培养基中的残糖浓度见图2，生成的氢气量见图3。结果表明采用不含聚磷酸根 的培养基时，1升培养物可以生产0. 46±0. 02升(常温常压)氢气，消耗11%±0. 30% 的葡萄糖碳源；采用聚磷酸根浓度为0.30mol/L的培养基时，1升培养物可以生产 1.8士0.40升(常温常压)氢气，消耗98%±0.30%的葡萄糖碳源，而且氢气生成速 度是添加磷酸二氢钠盐产氢速度(实施例2)的1. 5倍。
在基础培养基中加入聚磷酸钠，提高了氢气产量的可能机理是聚磷酸钠通过 细胞膜上聚磷酸激酶的作用，大量生成ATP物质，以及降解得到的单磷进入细胞内 部参与ATP生成。从而增大细胞内外的ATP水平，改变细胞的膜电势，从而加速氢 气的生成。
本发明通过试验证明 一方面，通过在细胞环境中加入磷酸根(无机磷酸根、 焦磷酸根、聚磷酸根)，可控制细胞内部的ATP水平以及细胞内部的氧化还原电势， 促进ATP快速生成和快速恢复，从而加速碳源的消耗和氢气的生成效率；另一方面， 磷酸盐可以在培养体系中重复循环利用，并不会造成对环境的污染。
权利要求
1、一种生产氢气的方法，是通过在含有磷酸根离子的培养基中培养产氢微生物生产氢气。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述培养基中磷酸根离子的浓度为0.01-0.50 mol/L。
3、 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述磷酸根离子为无机磷酸根离子，优选为(H2P04) 、 (HP04) 2或或(P04) 3-。
4、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于:所述无机磷酸根的浓度为0.30 mol/L。
5、 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述磷酸根离子为焦磷酸根离子。
6、 根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述焦磷酸根的浓度为0.25 mol/L。
7、 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述磷酸根离子为聚磷酸根 离子。
8、 根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述聚磷酸根的浓度为0.30 md/L。
9、 根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于每升所述培养基中除所述 磷酸根离子外，还含有以下组分葡萄糖10.0g、胰蛋白胨5.0、硫酸铵2.0、硫酸镁 0.2g;所述培养基的pH为6.0。
10、 根据权利要求1至9中任一所述的方法，其特征在于所述产氢微生物为产 气肠杆菌(五她ra6acter aerage腦IAM1183 )。
全文摘要
本发明公开了一种生产氢气的方法。本发明所提供的生产氢气的方法，是通过在含有磷酸根离子的培养基中培养产氢微生物生产氢气。在细胞环境中加入磷酸盐，可同时促进ATP快速生成和快速恢复，从而控制细胞内部的ATP水平以及细胞内部的氧化还原电势，加速碳源的消耗和氢气的生成效率，并且，磷酸盐可以在培养体系中重复循环利用，并不会造成对环境的污染。应用本发明的方法，产氢速率可以提高3倍以上，糖利用率可以提高5倍以上，大大提高了氢气的转化效率。
文档编号C12P3/00GK101294167SQ20081011539
公开日2008年10月29日 申请日期2008年6月23日 优先权日2008年6月23日
发明者元 卢, 翀 张, 来奇恒, 赵洪新, 邢新会, 堃 马 申请人:清华大学