专利名称：一种用昆虫卵建立细胞系的方法
技术领域：
本发明涉及一种生物技术，尤其涉及一种用昆虫卵建立细胞系的方法。
背景技术：
自1965年第一株昆虫细胞系成功建立后至今，近40年的时间内，已经建 立的昆虫细胞系超过500种。昆虫细胞系作为研究材料， 一直是生理学、发育 生物学、细胞生物学、分子生物学和生物化学等科学研究的重要工具，而且昆 虫细胞作为杆状病毒表达载体系统的重要组成部分，表达了大量的具有重大经 济意义或科学意义的外源蛋白质；同时作为生物反应器，扩增昆虫杆状病毒用 作生物杀虫剂，特别是扩增含有外源基因的重组杆状病毒杀虫剂，昆虫细胞也 发挥了重要的作用。
大量的来源于鳞翅目昆虫商品化的细胞系已得到人们广泛的应用。鳞翅目 的细胞系来源于很多组织，包括卵巢、胚胎、血细胞、脂肪体等。对于每一株 细胞系，无论是来自同一种昆虫甚至同一个体，同一器官组织，在细胞系的建 立和细胞的培养过程中，都会出现不同程度的变异，其细胞生物学特性，对特 定杆状病毒的感受性都有可能不同。因而科学家们根据研究的需要或某些商业 目的，会尝试从不同种昆虫，同一昆虫不同器官组织中，建立和筛选各种类型 的细胞系，以满足不同的需求。
传统的昆虫细胞系的建立方法，带有很大的随机性和不确定性。多将相应 的昆虫器官或组织剪碎，或用胰蛋白酶把昆虫组织消化，释放出单个或成团的 细胞，放入特定的细胞培养液中培养，并定时更换培养液。昆虫胚胎细胞系的 建立方法，多是将多个昆虫卵粒用匀衆器研碎过滤后培养，对胚胎细胞伤害很 大。因此，细胞系建立成功与否随机性很强，有很大的不确定性，多数情况下以失败告终，而且这个过程很长， 一般一个细胞系建立成功需要1.5-2年甚至 更长时间。
发明内容
本发明的目的是提供一种用昆虫卵建立细胞系的方法，其能够快速、有效、 可重复地建立昆虫细胞系。
为实现上述目的，本发明采用如下方法-
一种用昆虫卵建立细胞系的方法，方法步骤如下
1) 将产下90—100小吋的昆虫卵受精卵片用次氯酸钠溶液或甲醛溶液浸 泡5—10分钟后用无菌水清洗，再将卵粒用乙醇溶液消毒后用生理盐水 Ringer' s清洗；
2) 将上述步骤处理后的卵粒倒入昆虫细胞培养液中，逐 一 轻挤压卵粒释放出胚
胎；
3) 将歩骤2)得到的胚胎剪碎成组织块，转入密闭培养瓶中，放入25 28。C无光照的细胞培养箱中培养20 30小时；
4) 加入细胞培养液，使胚胎的组织块完全或超半部分浸没在该培养液中， 在与步骤3)同样条件下培养；
5) 每7—15天更换培养液，直至观察到不断扩展并开始增殖的细胞充满 了整个培养瓶；
6) 从培养瓶中吸出半量的细胞培养液，其中含有新增殖出的单个细胞， 放入新培养瓶中，并加入等量的新细胞培养液；而原培养瓶中再加入同吸出量 同样多新的细胞培养液；将两个培养瓶再放回培养箱中与歩骤3)同样条件下培 养；得到昆虫卵胚胎第一代传代细胞，细胞系建立成功；
整个过程都是在无菌条件下进行的。
所述的昆虫卵尤指鳞翅目昆虫卵，如可以是杨扇舟蛾卵或美国白蛾卵、
春尺蠖卵。
本发明所使用的细胞培养液是常规采用的昆虫细胞培养液与青霉素、链霉素和胎牛血清的混合物，配成的细胞培养液pH在6. 2-6.6之间。昆虫细胞培 养液可以是各种商品化的昆虫细胞培养瓶如1M-FH， Grace' s， TC_100， IPL-41， ExKMl 405等等。
本发明所使用的细胞培养液中青霉素与链霉素的含量各为50 100 U/mL; 动物血清含量为细胞培养液的体积比为5% 15%。
本发明的积极效果是本发明方法可以在短期内建立需要研究或生产用的 昆虫细胞系，能够提供大量的昆虫细胞种类的来源，并供使用者筛选，使建立 细胞系成为实验室的常规实验方法成为可能。
具体实施例方式
本发明用昆虫卵建立细胞系的方法具体步骤如下
(1) 将产下约四天(90— 100小时)的受精卵片放入10ral试管中，然后 用10%次氯酸钠溶液浸没约2-5分钟并轻振荡，倒掉次氯酸钠溶液并用无菌水 清洗卵粒，倒掉无菌水后用75%乙醇溶液消毒卵粒10-20分钟，期间不断轻轻 振荡，倒掉乙醇后用Ringer' s清洗卵粒; (2) 将卵粒倒入或用移液器移入装有1-2nd的昆虫细胞培养液中，在解 剖镜下用弯头眼科镊逐一轻挤卵粒释放出胚胎；
(3) 用移液器轻轻转移胚胎入另一装有0. 5mL昆虫细胞培养液的培养皿 中，用眼科剪将胚胎剪碎，长度约l-2mm。用移液器将胚胎组织块转入含有0. 5mL 细胞培养液润洗过的细胞培养瓶中，盖紧瓶盖，放入27'C无光照的细胞培养箱 中培养24小时；
(4) 加入适量的细胞培养液，使组织块完全或大部分浸没在该培养液中， 在与步骤(3)同样条件下培养；
(5) 每7—15天吸出半量的培养液，并同时换入半量新的细胞培养液， 直至观察到不断扩展并开始增殖的细胞充满了整个培养瓶；
(6) 把含有新增殖出的单个细胞，连同全部的细胞培养液吸出放入新培 养瓶中，并加入新的细胞培养液，而原含有组织块的培养瓶中再加入同吸出量同样多新的细胞培养液，两个培养瓶放入培养箱中培养，细胞开始传代，细胞 系建立成功；
整个过程都是在无菌条件下进行的。
本发明方法所使用的细胞培养液是昆虫细胞培养液与青霉素、链霉素和胎 牛血清的混合物，配成的细胞培养液pH在6.2-6. 6之间。其中所述的昆虫细 胞培养液选自商品化的昆虫细胞培养液TNM-FH， Grace， s， TC-100， IPL-41， 或Ex-Cell 405中的任何一种，优选TNM-FH;青霉素含量为50— 100U/mL，优 选100U/mL;链霉素含量为50— 100U/mL，优选100U/mL;胎牛血清含量为细胞 培养液的5 — 20 '。(体积比)，优选10%。
以下可以通过实验来说明优选方案的确立
① 选取TNM-FH， Grace' s， TC-100， IPL-41, Ex-Cell 405五种细胞培 养液进行杨扇舟蛾胚胎细胞原代培养，每种培养液培养三瓶，用TNM-FH培养 的三瓶比用其他几种培养液较快游离出细胞，并且成功建立成系。其他几种培 养液在最初三个月有生长，但没有成功建立成系。
② 加5%胎牛血清时组织中细胞游离出来较慢(一个月左右)；加10%胎牛 血清时组织中细胞游离出来较快(一周左右)，而且较快建成细胞系。加15% 胎牛血清时培养液容易结晶，不利细胞生长。
相对于传统的细胞系建立方法，本发明方法的细胞系建立过程由通常的耗 时1.5-2年縮减到1-3个月，其优势非常明显，而且重复性很强，用同样方法 建立同样昆虫组织的细胞系，在预定的时间内可以使细胞传代，因而大大提高 了昆虫细胞系建立的效率。第一次传代以后，根据细胞生长增殖的情况，用传 统培养昆虫细胞系的方法对细胞进行分瓶传代处理。根据不同细胞系的特性， 细胞系的生长将在第一次传代l-3个月后达到稳定状态。此时可以定期传代， 并用传统细胞冻存的方法对一定代次的部分细胞进行冻存处理，保存细胞的种 资，其它细胞用于常规的细胞生物学特性鉴定，并进行相应的科学实验和生产 应用。下面以具体实施例详细说明
实施例l:杨扇舟蛾细胞系的实现
在无菌操作台内(以下操作都在无菌条件下，所使用器具都要经过灭菌或 消毒处理)将产下约四天的杨扇舟蛾(Gosfera s/ sc/ orfs Fabricius)受精 卵片放入10ml试管中，然后用10%次氯酸钠溶液浸没约2-5分钟并轻振荡， 倒掉次氯酸钠溶液并用无菌水清洗卵粒，倒掉无菌水后用75。/。乙醇溶液消毒卵 粒10-20分钟，期间不断轻轻振荡，倒掉乙醇后用Ringer' s清洗卵粒；将卵 粒倒入或用移液器移入装有1-2ml的昆虫细胞培养液中(以T画-FH为主，含 100U/mL的青霉素，100U/mL的链霉素和10% (v/v)的胎牛血清，pH=6. 3)，在 解剖镜下用弯头眼科镊逐一轻挤卵粒释放出胚胎；用移液器轻轻转移胚胎入另 一装有0. 5mL昆虫细胞培养液的培养皿中，用眼科剪将胚胎剪碎，长度约 1-2mm。用移液器将胚胎组织块转入含有0. 5mL细胞培养液润洗过的25cn^细胞 培养瓶中，盖紧瓶盖，放入27卩无光照的细胞培养箱中培养24小时；加入适 量的细胞培养液，使组织块完全或大部分浸没在该培养液中，放入同样条件下 培养。
该方法成功建立细胞系的关键是选取产下四天左右的受精卵；挤出的 胚胎要剪成卜2mm;瓶中装适量培养液，使组织块紧贴在细胞培养瓶底，勿使 组织块悬浮在细胞培养液中。以后每7-10天左右吸出半量的培养液，并同时 换入半量的新培养液。在此操作第7-10天后可以观察到组织块周围游离出大 量单个的细胞，并逐渐向外围扩展。第20天后见到细胞不断增殖并充满整个 培养瓶，把含有新增殖出的细胞的培养液吸出放入新培养瓶中，并加入等量 (l-2mL)新的细胞培养液。细胞系建立初步成功。在细胞开始传代的第7天 后开始第二次分瓶传代，以后传代时间逐渐縮短，传到第5代时，细胞生长开 始稳定，最终该细胞系被命名为Clan I 。并于2008年7月11日保藏在中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 2579。实施例2:美国白蛾细胞系的实现
在无菌操作台内(以下操作都在无菌条件下，所使用器具都要经过灭菌或 消毒处理)将产下约四天的美国白蛾(份/ 力朋m'a Drury)受精卵片放
入10ml试管中，然后用10%次氯酸钠溶液浸没约2-5分钟并轻振荡，倒掉次 氯酸钠溶液并用无菌水清洗卵粒，倒掉无菌水后用75%乙醇溶液消毒卵粒 10-20分钟，期间不断轻轻振荡，倒掉乙醇后用Ringer， s清洗卵粒将卵粒 倒入或用移液器移入装有1-2ml的昆虫细胞培养液中(以TNM-FH为主，含 100'J/mL的青霉素，100U/mL的链霉素和10% (v/v)的胎牛血清，pH=6.5)，在 解剖镜下用弯头眼科镊逐一轻挤卵粒释放出胚胎；用移液器轻轻转移胚胎入另 一装有0. 5mL昆虫细胞培养液的培养皿中，用眼科剪将胚胎剪碎，长度约 l-2mm。用移液器将胚胎组织块转入含有0. 5mL细胞培养液润洗过的25cn^细胞 培养瓶中，盖紧瓶盖，放入27'C无光照的细胞培养箱中培养24小时；加入适 量的细胞培养液，使组织块完全或大部分浸没在该培养液中，放入同样条件下 培养。以后每7-10天左右吸出半量的培养液，并同时换入半量的新培养液。 在此操作第10天后可以观察到组织块周围游离出大量单个的细胞，并逐渐向 外围扩展。第25天后见到细胞不断增殖并充满整个培养瓶，把含有新增殖出 的细胞的培养液吸出放入新培养瓶中，并加入等量(1-2mL)新的细胞培养液。 细胞系建立初步成功。在细胞开始传代的第7天后开始第二次分瓶传代，以后 传代时间逐渐縮短，传到第8代时，细胞生长开始稳定，最终该细胞系被命名 为Hycu I 。
实施例3:春尺蠖细胞系的实现
在无菌操作台内(以下操作都在无菌条件下，所使用器具都要经过灭菌或 消毒处理)将产下约四天的春尺蠖c/y7ersn7AS Erschoff)受精 卵片放入10ml试管中，然后用10%次氯酸钠溶液浸没约2-5分钟并轻振荡， 倒掉次氯酸钠溶液并用无菌水清洗卵粒，倒掉无菌水后用75%乙醇溶液消毒卵 粒10-20分钟，期间不断轻轻振荡，倒掉乙醇后用Ringer' s清洗卵粒；将卵粒倒入或用移液器移入装有1-2ml的昆虫细胞培养液中(以T画-FH为主，含 100U/mL的青霉素，100U/mL的链霉素和10% (v/v)的胎牛血清，pH=6. 5)，在 解剖镜下用弯头眼科镊逐一轻挤卵粒释放出胚胎；用移液器轻轻转移胚胎入另 一装有0.5mL昆虫细胞培养液的培养皿中，用眼科剪将胚胎剪碎，长度约 l-2mm。用移液器将胚胎组织块转入含有0. 5mL细胞培养液润洗过的250012细胞 培养瓶中，盖紧瓶盖，放入27"C无光照的细胞培养箱中培养24小时；加入适 量的细胞培养液，使组织块完全或大部分浸没在该培养液中，放入同样条件下 培养。以后每7-10天左右吸出半量的培养液，并同时换入半量的新培养液。 在此操作第15天后可以观察到组织块周围游离出大量单个的细胞，并逐渐向 外围扩展。第35天后见到细胞不断增殖并充满整个培养瓶，把含有新增殖出 的细胞的培养液吸出放入新培养瓶中，并加入等量(l-2mL)新的细胞培养液。 细胞系建立初步成功。在细胞开始传代的第10天后开始第二次分瓶传代，以 后传代时间逐渐縮短，传到第8代时，细胞生长开始稳定，最终该细胞系被命 名为Apci I 。
上述各实施例可在不脱离本发明的范围下加以若干变化，而非用以限制本 发明的申请专利范围。
权利要求
1、一种用昆虫卵建立细胞系的方法，方法步骤如下1)将产下90—100小时的昆虫受精卵片用次氯酸钠溶液或甲醛溶液浸泡5一10分钟后用无菌水清洗，再将卵粒用乙醇溶液消毒后用生理盐水Ringer’s清洗；2)将上述步骤处理后的卵粒倒入昆虫细胞培养液中，逐一轻挤压卵粒释放出胚胎；3)将步骤2)得到的胚胎剪碎成组织块，转入密闭培养瓶中，放入25～28℃无光照的细胞培养箱中培养20～30小时；4)加入细胞培养液，使胚胎的组织块完全或超半部分浸没在该培养液中，在与步骤3)同样条件下培养；5)每7—15天更换培养液，直至观察到不断扩展并开始增殖的细胞充满了整个培养瓶；6)从培养瓶中吸出半量的细胞培养液，其中含有新增殖出的单个细胞，放入新培养瓶中，并加入等量的新细胞培养液；而原培养瓶中再加入同吸出量同样多新的细胞培养液；将两个培养瓶再放回培养箱中与步骤3)同样条件下培养；得到昆虫胚胎第一代传代细胞，细胞系建立成功；整个过程都是在无菌条件下进行的。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于继续得到昆虫卵胚胎后一 代传代细胞的方法步骤如下周期重复权利要求2所述的步骤5)及步骤6)。
3、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤l)中用5% — 20% 的次氯酸钠溶液浸泡昆虫受精卵片2-15分钟，或用0.2°/。一1%的甲醛溶液浸泡 10-30分钟，用次氯酸钠溶液或甲醛溶液浸泡及用乙醇溶液消毒期间均可不断 轻轻振荡。
4、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于胚胎剪碎成卜2mm组织块， 所述步骤5)中更换培养液的具体方法是每7—15天吸出半量的培养液，并同时换入半量新的细胞培养液。
5、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于其中所述的细胞培养液是昆虫细胞培养液与青霉素、链霉素和胎牛血清的混合物，配成的细胞培养液pH 在6. 2-6. 6之间，其中细胞培养液中的青霉素与链霉素的总含量不超200U/mL; 胎牛血清的体积容量占细胞培养液体积容量的5 % — 15 % 。
6、 根据权利要求5所述的方法，其特征在于其中细胞培养液中的青霉 素与链霉素的含量分别为0 100U/mL;胎牛血清的体积容量占细胞培养液体积容量的5% 15%。
7、 根据权利要求1所述的昆虫细胞的构建方法，其特征在于其中所述的昆虫细胞培养液选自商品化的昆虫细胞培养液T丽-FH， Grace， s， TC-100， IPL-41，或Ex-Cell 405。
8、 根据权利要求1或2所述的昆虫细胞的构建方法，其特征在于对得 到的昆虫卵胚胎后一代传代细胞进行冻存处理，以保存细胞的种资供使用时再复苏。
9、根据权利要求1所述的昆虫细胞的构建方法，其特征在于其中所述 的昆虫卵可以是杨扇舟蛾卵或美国白蛾卵、春尺蠖卵。
全文摘要
一种用昆虫卵建立细胞系的方法，步骤如下1)将产下90～100小时的昆虫受精卵片用次氯酸钠溶液或甲醛溶液浸泡后再消毒；2)处理后的卵粒倒入昆虫细胞培养液中，逐一挤压卵粒释放出胚胎；3)将胚胎剪碎成组织块放入培养箱中培养；4)加入细胞培养液继续培养；5)定时更换培养液，直至增殖的细胞充满整培养瓶；6)吸出半量的细胞培养液，其中含有新增殖出的单个细胞，放入新培养瓶中并加入等量的新细胞培养液，继续放回培养箱中培养；7)周期重复步骤5)及6)，细胞开始传代，细胞系建立成功；整过程在无菌下进行。所述的昆虫卵可以是鳞翅目昆虫卵；本发明方法由传统耗时1.5-2年缩减到1-3个月，优势非常明显，且重复性很强。
文档编号C12N5/06GK101423817SQ200810118629
公开日2009年5月6日 申请日期2008年8月20日 优先权日2008年8月20日
发明者张永安, 曲良建, 温发园, 王文欢, 王玉珠 申请人:中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所