星虫胶原蛋白及其制备方法

专利名称：星虫胶原蛋白及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物胶原蛋白，具体涉及星虫胶原蛋白及其制备方法。
背景技术：
胶原蛋白是动物的结构蛋白，由于其结构或其水解物的结构与人皮肤的胶原结构相 似，其分子的氨基和羧基基团具有很高的表面活性和良好的生物相容性，因此用于化妆 品时对皮肤无刺激作用。由于胶原蛋白富含有羟基等亲水性基团而具吸水性和持水性， 因此用于化妆品中可以增强肌肤的保水能力，防止水分从皮肤表面蒸发，进而改善皮肤 粗糙、无光泽的状况。另外胶原蛋白还具有低免疫原性和与宿主细胞及组织之间有良好 的生物相容性，能促进血小板凝聚和促进血浆结块的止血作用，因此胶原蛋白是一类具 有多种优良特性的生物医学材料，在医学领域中已得到广泛应用。
胶原蛋白与水结合的能力很强，既具有凝胶性又有乳化性，这一性质使胶原在食品 中可以用作填充剂和凝胶，也可在酸性和碱性介质中乳化膨胀，故可应用于制备化工原 料。目前胶原蛋白制品主要是从猪、牛等畜产品的皮肤和骨骼中提取，而近年由于疯牛 病和口蹄疫的爆发，畜产来源的产品存在隐患；因此开始寻求从水产品中提取胶原蛋白。 如授权公告号为CN100345867C，公告日为2007年10月31日，名称为"一种酸溶性 鱼皮胶原蛋白及其制备方法"的发明专利，就公开了以鱼皮为原料，通过切碎、除去非 胶原蛋白和杂质、脱脂、提取、盐析、纯化、干燥后得到洁白呈海绵状的鱼皮胶原蛋白， 其分子量大于60000，含三条异种a链，在低温下可溶于中性盐溶液或酸性溶液，同源胶
原具有相同的形状、大小及氨基酸组成，鱼皮胶原蛋白中含有丰富的甘氨酸、脯氨酸和 羟脯氨酸，其水解产物还含有生理活性肽。其公开的制备方法为由0.1mol/L拧檬酸与 0.5mol/L醋酸以1: 0.1 10的配制得到浸提液，用鱼皮重量5 25倍的浸提液浸提鱼 皮，在4 1(TC温度条件下，浸提10 24小时，经离心、盐析、再离心、纯化干燥后得 到鱼皮胶原蛋白。授权公告号为CN100369929C，公告日为2008年2月20日，名称为 "海蜇胶原蛋白及其制备方法"的发明专利，也公开了从海蜇的中胶层提取得到白色或 浅黄色固体粉沫的海蜇胶原蛋白，其堆密度为0.11 0.645g/ml，单链分子量为10 30 万道尔顿，糖含量为2.5 5%，氨基酸含量为80 95%mg/100mg，其中天门冬氨酸占 7.9 8.3%，谷氨酸占10.0 12.9%。其制备方法是把海蜇中胶层用蛋白酶解离，蛋白酶 用量为0.2 1%，解离温度为10 30°C，解离时间为10 48小时。
各种天然提取的胶原蛋白己广泛应用于化妆品、医药、食品等领域中，但是从不同 的动物体中提取得到的胶原蛋白的组成基团、螺旋结构等不同，其理化特性也不同，因 此生理功能就有所区别，应用领域及作用就各有侧重点。
星虫门(Sipunculoidea)分为两个纲、4个目、6个科和17个属，约300禾中；我国 有60余种，现仅发现40余种。我国沿海分布主要为革囊星虫、管体星虫属、方格星 虫。星虫的体壁由上皮、角质层、表皮附属物、胶原纤维层、基底膜、环肌层、纵肌层 和体腔膜组成，胶原纤维层在星虫的全身体表都有分布，而且排列整齐有序，因此胶原 蛋白较发达，含量高，尤其是触手的胶原蛋白的含量非常高。

发明内容
本发明所要解决的问题是提供一种星虫胶原蛋白，该胶原蛋白具有动物胶原的普遍 特性生物相容性、低免疫原性、凝胶性、吸水性、持水性和乳化性，还具有高度分散 性和低粘着性，能用于医药、化妆品、食品等领域，对伤口愈合具有明显的促进作用。
本发明还提供了该胶原蛋白的制备方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为用除去非胶原蛋白的星虫体壁为原
料，通过酸性蛋白酶或摩尔浓度为0.2 2.0md/L的酸提取，经离心、盐析、再离心、 透析、冻干步骤得到，该星虫胶原蛋白为白色或淡黄色粉沫，其热收縮温度为53.00 55.00°C，等电点平均值为4.60 4.卯，该星虫胶原蛋白的分子量为116KD 200KD (千 道尔顿)，糖含量为0.50 0.90 mg/100 mg，氨基酸含量为90 95mg/100 mg，所述氨 基酸中羟脯氨酸含量为9.5% 11.5% (重量)，该星虫胶原蛋白为三种肽链组成的三螺 旋结构，在红外光谱的1235cm-' 1450cm-'的范围内存在吸收，在红外光谱的1651.42 cm—'处出现较强的吸收。
所述肽链的其中一种为两条a肽链的二聚体。
所述的星虫胶原蛋白的制备方法之一，包括下述步骤
a将除去非胶原蛋白的星虫体壁均匀磨碎，加入到终浓度为0.5mol的醋酸缓冲液中
配制成均质液，醋酸缓冲液与星虫体壁的体积比100: 1;
b在均质液中加入酸性蛋白酶，酸性蛋白酶与星虫体壁的重量比为1: 50 400，在
0 10(TC温度条件下酶解10 60小时；
c酶解完成后灭酶，将灭酶的均质液在4'C温度条件下，用8000rpm离心10min，
得第一上清液，沉淀物按步骤b的方法再次酶解，然后同样离心，得第二上清液，合并
第一上清液和第二上清液为总上清液；
d在总上清液加入NaCl溶液，使其终浓度达到2mol/L，静置至胶原蛋白完全沉淀； e再在4'C温度条件下，用8000 rpm离心20 min，得到胶原蛋白沉淀； f将胶原蛋白沉淀反复溶于0.1 0.5mol/L的透析液中，置于透析袋中流水透析，至
AgN03溶液检测不出透析外液存在Cl—为止，得到透析内液；
h将透析内液冷冻干燥，得到酸溶性星虫胶原蛋白。
所述酸性蛋白酶为胃蛋白酶，胃蛋白酶与星虫体壁的重量比为1: 50 350，在35 40'C温度条件下酶解20 40小时；胃蛋白酶的最适pH在1.5-2.2之间；也可以用木瓜 蛋白酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶或复合蛋白酶代替胃蛋白酶。
所述的星虫胶原蛋白的制备方法之二，包括下述步骤
1) 将除去非胶原蛋白的星虫体壁均匀磨碎，加入到终浓度为0.5mol的醋酸缓冲液 中配制成均质液，醋酸缓冲液与星虫体壁的体积比100: 1;
2) 在均质液中加入摩尔浓度为0.2 2.0mol/L的酸，酸与星虫体壁的重量比为1: 50 400，在0 100。C温度条件下酸解10 60小时；
3) 酸解完成后，将均质液在4。C用8000 rpm离心10min，得第一上清液，沉淀物 按步骤b的方法再次酸解，然后同样离心，得第二上清液，合并第一上清液和第二上清 液为总上清液；
4) 在总上清液加入NaCl溶液，使终浓度达到2mol/L，静置至胶原蛋白完全沉淀；
5) 再在4。C用8000rpm离心20min，得到胶原蛋白沉淀；
6) 将胶原蛋白沉淀反复溶于0.1 0.5mol/L的透析液中，置于透析袋中流水透析， 至Ag冊3溶液检测不出透析外液存在Cl—为止，得到透析内液；
7) 将透析内液冷冻干燥，得到酸溶性星虫胶原蛋白。
在步骤2)中，所述酸为醋酸，所述醋酸的摩尔浓度为0.8 1.4mol/L。 在步骤2)中，所述酸为柠檬酸，所述柠檬酸的摩尔浓度为0.8 2.0mol/L。 在步骤2)中，所述酸为盐酸，所述盐酸的摩尔浓度为0.2 0.8mol/L 与现有技术相比，本发明的优点在于用星虫体壁为原料，通过酸性蛋白酶或摩尔浓 度为0,2 2.0mol/L的酸提取，经离心、盐析、再离心、透析、冻干步骤得到，其为白色 或淡黄色粉沫，热收縮温度为53.00 55.00'C，等电点平均值为4.60 4.90，其分子量为 116KD 200KD，糖含量为0.50 0.90 mg/100 mg，氨基酸含量为卯 95mg/100 mg， 所述氨基酸中羟脯氨酸含量为9.5% 11.5% (重量)，该星虫胶原蛋白为三种肽链组成的 三螺旋结构，在红外光谱的1235 cm—' 1450cm—'的范围内存在吸收，在红外光谱的 1651.42cm—'处出现较强的吸收。该星虫胶原蛋白具有动物胶原的普遍特性，如生物相 容性、低免疫原性、凝胶性、吸水性、持水性和乳化性等，还具有高度分散性和低粘着 性，2(TC温度下该星虫胶原蛋白凝胶的粘着性为-6.00 -6.16。本发明的星虫胶原蛋白能 用于医药、化妆品、食品等领域，尤其对伤口愈合具有明显的促进作用。用酸性蛋白酶 提取该星虫胶原蛋白，提取率可以达到50%以上，用胃蛋白酶可以达到70%以上，用酸 提取该星虫胶原蛋白，提取率较低， 一般为20%左右。


图1为实施例1的星虫胶原蛋白红外光谱图2为实施例1的星虫胶原蛋白电泳图； 图3为实施例2的星虫胶原蛋白电泳图； 图4为实施例2的星虫胶原蛋白红外光谱图。
具体实施例方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。 实施例1
将星虫体壁洗净后除去非胶原蛋白，然后均匀磨碎，加入到终浓度为0.5md的醋
酸缓冲液中配制成均质液，醋酸缓冲液与星虫体壁的体积比100: 1;在均质液中加入胃
蛋白酶，胃蛋白酶与星虫体壁的重量比为1: 150，在35 4(TC温度条件下酶解30小时 左右；酶解完成后灭酶，将灭酶的均质液在4'C温度条件下，用8000rpm离心10min， 得第一上清液，沉淀物再次同样酶解，然后同样离心，得第二上清液，合并第一上清液 和第二上清液为总上清液；在总上清液加入NaCl溶液，使其终浓度达到2mol/L，静置 至胶原蛋白完全沉淀；再在4。C温度条件下，用8000 rpm离心20 min，得到胶原蛋白 沉淀；将胶原蛋白沉淀反复溶于0.1 0.5mol/L的透析液中，置于透析袋中流水透析， 至AgN03溶液检测不出透析外液存在Cl—为止，得到透析内液；将透析内液冷冻干燥， 得到呈白色粉沫状的酸溶性星虫胶原蛋白，提取率达到75%以上，提取率为提取得到的
胶原蛋白的量/星虫体壁中胶原蛋白总量xiooy。。测定该星虫胶原蛋白红外光谱，从图
1中可以看出在1235 cm—' 1450 cm—'范围内具有吸收带(N-H和C-H变形、伸縮振动)， 在红外光谱的1651.42 cm—'处出现较强的吸收峰(0=0伸缩振动)；红外光谱用红外光 谱仪测定，扫描范围为4000cm—' 400cm—1。电泳该星虫胶原蛋白，从图2中可以看出 在116KD 200KD附近存在三条清晰的条带分别为ct、 P、 Y组分，表示该胶原蛋白 的分子量在116KD 200KD，具有完整的三螺旋结构，且P组分较多，测定得e组分 为两条a肽链的二聚体；电泳方法为SDS-PAGE垂直板电泳，用考马斯亮蓝染色。
用常规生化方法测得该星虫胶原蛋白的热收縮温度为53.30°C，等电点平均值为 4.70，糖含量为0.58 mg/100 mg，氨基酸含量为92.33mg/100 mg，氨基酸中羟脯氨酸 含量为10.99% (重量)。用粘度测量仪并计算得到该星虫胶原蛋白制得的凝胶在2(TC温 度下的粘着性为-6.04。
实施例2
与实施例l基本相同，所不同的只是用貯檬酸代替胃蛋白酶对星虫体壁酸解，柠檬 酸的摩尔浓度为1.6mol/L，柠檬酸与星虫体壁的重量比为1: 200，得到呈淡黄色粉沫 状的酸溶性星虫胶原蛋白，提取率达到22%以上。测定该星虫胶原蛋白红外光谱，从图 4中可以看出星虫胶原蛋白在1235cm—' 1450cm—1范围内具有吸收带，在红外光谱的 1651.42 cm—'处出现较强的吸收峰。电泳该星虫胶原蛋白，从图3中可以看出在116KD 200KD附近存在三条清晰的条带分别为a 、 e、 Y组分，也表示该胶原蛋白的分子量
在116KD 200KD，具有完整的三螺旋结构，且P组分较多，测定得P组分为两条a 肽链的二聚体。
用常规生化方法测得该星虫胶原蛋白的热收縮温度为54.50°C，等电点平均值为 4.85，糖含量为0.75 mg/100 mg，氨基酸含量为91.45mg/100 mg，氨基酸中羟脯氨酸 含量为10.35% (重量)。用粘度测量仪并计算得到该星虫胶原蛋白凝胶在2(TC温度下的 粘着性为-6.15。
星虫胶原蛋白的氨基酸中甘氨酸占31.0% 35.0% (重量)；丙氨酸占11.0% 15.0%;谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸和丝氨酸的各占5%，四种之和约占27%;其余 为含量较低的组氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸等。
试验例
用本发明的星虫胶原蛋白对实验动物的愈伤能力进行试验
l模型建立、对实验动物用手术形成创面，使创面出血和周围组织水肿，待创面血 液凝固，随机分成空白组和用药组，空白组是让其创面自然愈伤，用药组是用本发明的 星虫胶原蛋白均匀薄涂在创面的表面，每天一次直至痂皮脱落，观察两组各自创面愈伤情 况和愈伤后创面疤痕；
2创面愈伤、术后2d，空白组创面几乎全部为血凝块覆盖，颗粒状肉芽很少，创面 周围组织水肿仍较为明显；用药组创面周围组织水肿有所减轻，肉芽组织生长明显，局 部己长出薄层或点状上皮，创缘皮肤收縮明显；术后4d，空白组有1/3的伤口湿润，仍 有渗出物，伤口收縮不明显，仅见薄层肉芽，未见明显的新生上皮，用药组全部伤口无 感染，表皮下及肌层内均有大量肉芽组织增生修补伤口；术后6d，空白组创面仅80% 被肉芽组织充填，上皮生长较少，毛发长出较少，用药组创面均完全被肉芽组织充填， 大部分有上皮生长，可见有较多毛发长出；术后8d，用药组创面的痂皮开始自然脱落， 而空白组要过3-5日，才开始脱落。
3疤痕、待两组伤口痂皮全部脱落后，用药组创面形成的疤痕不明显，皮肤表面较 平整，空白组创面形成的疤痕明显，疤痕凸凹不平，大部分凹进皮肤面。
权利要求
1、星虫胶原蛋白，其特征在于用除去非胶原蛋白的星虫体壁为原料，通过酸性蛋白酶或摩尔浓度为0.2～2.0mol/L的酸提取，经离心、盐析、再离心、透析、冻干步骤得到，该星虫胶原蛋白为白色或淡黄色粉沫，其热收缩温度为53.00～55.00℃，等电点平均值为4.60～4.90，该星虫胶原蛋白的分子量为116KD～200KD，糖含量为0.50～0.90mg/100mg，氨基酸含量为90～95mg/100mg，所述氨基酸中羟脯氨酸含量为9.5％～11.5％(重量)，该星虫胶原蛋白为三种肽链组成的三螺旋结构，在红外光谱的1235cm-1～1450cm-1的范围内存在吸收，在红外光谱的1651.42cm-1处出现较强的吸收。
2、 如权利要求l所述的星虫胶原蛋白，其特征在于所述肽链的其中一种为两条a 肽链的二聚体。
3、 权利要求l所述的星虫胶原蛋白的制备方法，其特征在于包括下述步骤 a将除去非胶原蛋白的星虫体壁均匀磨碎，加入到终浓度为0.5mol的醋酸缓冲液中配制成均质液，醋酸缓冲液与星虫体壁的体积比100: 1;b在均质液中加入酸性蛋白酶，酸性蛋白酶与星虫体壁的重量比为h 50 400，在0 10(TC温度条件下酶解10 60小时；c酶解完成后灭酶，将灭酶的均质液在4'C温度条件下，用8000 rpm离心10 min，得第一上清液，沉淀物按步骤b的方法再次酶解，然后同样离心，得第二上清液，合并第一上清液和第二上清液为总上清液；d在总上清液加入NaCl溶液，使其终浓度达到2mol/L，静置至胶原蛋白完全沉淀； e再在4'C温度条件下，用8000ipm离心20min，得到胶原蛋白沉淀； f将胶原蛋白沉淀反复溶于0.1 0.5mol/L的透析液中，置于透析袋中流水透析，至AgN03溶液检测不出透析外液存在cr为止，得到透析内液；h将透析内液冷冻干燥，得到酸溶性星虫胶原蛋白。
4、 如权利要求3所述的星虫胶原蛋白的制备方法，其特征在于在步骤b中所述酸 性蛋白酶为胃蛋白酶，胃蛋白酶与星虫体壁的重量比为1: 50 350，在35 4(TC温度 条件下酶解20 40小时。
5、 权利要求l所述的星虫胶原蛋白的制备方法，其特征在于包括下述步骤1) 除去非胶原蛋白的星虫体壁均匀磨碎，加入到终浓度为0.5mol的醋酸缓冲液中配制成均质液，醋酸缓冲液与星虫体壁的体积比100: 1;2) 在均质液中加入摩尔浓度为0.2 2.0mol/L的酸，酸与星虫体壁的重量比为h 50 400,在0 10(TC温度条件下酸解10 60小时；3) 酸解完成后，将均质液在4。C用8000 rpm离心10min，得第一上清液，沉淀物 按步骤b的方法再次酸解，然后同样离心，得第二上清液，合并第一上清液和第二上清 液为总上清液；4) 在总上清液加入NaCl溶液，使终浓度达到2mol/L，静置至胶原蛋白完全沉淀;5) 再在4。C8000rpm用离心20min，得到胶原蛋白沉淀；6) 将胶原蛋白沉淀反复溶于0.1 0.5mol/L的透析液中，置于透析袋中流水透析， 至AgN03溶液检测不出透析外液存在Cl —为止，得到透析内液；7) 将透析内液冷冻干燥，得到酸溶性星虫胶原蛋白。
6、 如权利要求5所述的星虫胶原蛋白的制备主法，其特征在于在步骤2)中，所述 酸为醋酸，所述醋酸的摩尔浓度为0.8 1.4mol/L。
7、 如权利要求5所述的星虫胶原蛋白的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述 酸为柠檬酸，所述柠檬酸的摩尔浓度为0.8 2.0mol/L。
8、 如权利要求5所述的星虫胶原蛋白的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述 酸为盐酸，所述盐酸的摩尔浓度为0.2 0.8mol/L。
全文摘要
本发明公开了星虫胶原蛋白及其制备方法，用星虫体壁为原料通过酶或酸提取得到的白色或淡黄色粉沫，其热收缩温度为53.30～54.50℃，等电点平均值为4.65～4.90，分子量为116KD～200KD，糖含量为0.50～0.90mg/100mg，氨基酸含量为90～95mg/100mg，所述氨基酸中羟脯氨酸含量为9.5％～11.5％(重量)，其为三种肽链组成的三螺旋结构，在红外光谱的1235cm^-1～1450cm^-1的范围内存在吸收，在红外光谱的1651.42cm^-1处出现较强的吸收。该星虫胶原蛋白具有动物胶原的普遍特性，如生物相容性、低免疫原性、凝胶性、吸水性、持水性和乳化性等，还具有高度分散性和低粘着性，用于医药、化妆品、食品等领域，尤其对伤口愈合具有明显的促进作用。
文档编号C12P21/06GK101381411SQ200810121148
公开日2009年3月11日 申请日期2008年9月28日 优先权日2008年9月28日
发明者蓓 孙, 李太武, 李妍妍, 苏秀榕 申请人:宁波大学