专利名称：：粮食作物深加工制品高通量五重巢式pcr转基因检测方法
技术领域：
：本发明是一种用于主要粮食作物深加工产品高通量转基因检测方法.(二)技术背景随着各国有关转基因生物(geneticallymodifiedorganism,GMO)标签法的建立和不断完善，转基因成分的准确检测也显得日趋重要，很多国家不但要求对转基因产品进行定性检测，还需要对产品中的GMO含量进行定量检测，以便标识。欧盟等国家和地区先后出台转基因产品的标签制度，出入境产品必须出具是否含有转基因成分的检测报告。近年来，我国大量进口转基因大豆用于加工，由于市场标识不够,使我国加工产品出口贸易遭受损失。为了加强对农业转基因生物的安全管理，保障人体健康，规范转基因产品的销售行为，引导和保护消费者的知情权，农业部颁布了《农业转基因生物标识管理办法》，该办法规定了在中国境内需要标识的第一批转基因生物及其产品，即大豆、玉米、油菜、棉花和番茄等5类17种产品。目前国内的相关标准较为混乱，出现了一些技术标准不一致、法规滞后、与国际惯例不接轨等现象，致使某些产品实行国际、国内市场"双重标准"，没有依照中国有关转基因食品的规定贴上相关标识，侵害了中国消费者的利益。大豆、玉米和水稻深加工制品己越来越多，如卵磷脂、大豆蛋白质粉、巧克力饮品、婴儿米粉、大豆油、玉米油、玉米蛋白质粉、玉米淀粉、麦片等食品，其加工呈现复杂化和多元化的特点，在国内外仍然没有适合的标准依据进行检测。"乐之事件"以及"雀巢食品含转基因"事件都表明，我国在转基因市场的管理上确实存在漏洞，对转基因食品的监督力度不足，造成了企业有法律空子可钻。要完善、健全我国的转基因产品管理制度，首要问题是要解决我国尚未统一的检测标准问题，同时要提高转基因检测的精确度，以保证我国消费者的利益。目前，欧盟率先倡导并实行转基因标识并要求产品成分中转基因含量大于1%时必须进行标识，因此其检测技术早己经成熟，检测下限达0.1%。国内一些机构，尤其进出口检疫局也相继建立检测实验室，技术趋于成熟，但还只限于对转基因原料的检测，在深加工产品的检测技术的研究上还很不成熟，没有统一的检测标准，检测结果不稳定。深加工产品转基因检测所需的DNA提取技术在国外尚处于研究阶段，并没有形成系列化技术，商品化的提取试剂盒种类单一。由于深加工产品种类繁多，生产工艺复杂，而深加工品DNA提取技术应该是一系列技术，提取试剂盒也应该是多样化，不同产品采用不同试剂盒，缺乏针对不同深加工转基因产品的DNA提取技术。因此，急需建立了一整套简便、精确、快捷、成熟、可信度高的转基因粮食作物深加工制品检测技术体系，为我国粮食作物转基因产品检测标准化提供技术平台，为GMO标签制度进一步发展提供技术保证。
发明内容本发明的目的在于提供一种有效地防止假阴性结果的出现，而且可以提高检测效率、縮短检测周期，具有高效、快速、低成本、高灵敏度的粮食作物深加工制品高通量五重巢式PCR转基因检测方法。本发明的目的是这样实现的检测方法的检测过程为材料阳性标准品转基因大豆、玉米、水稻；阴性标准品非转基因大豆、玉米、水稻；待检样品深加工产品大豆蛋白质粉、巧克力饮品、婴儿米粉、大豆卵磷脂、大豆油、大豆色拉油、玉米油、玉米淀粉、玉米蛋白粉、营养麦片、玉米泥；试剂WizardMagneticDNAPurificationSystemforFood试剂盒；r-TaqDNA聚合酶、dNTP、10xPCR缓冲液(含MgCl2)和DLDNA2000分子质量标准。(1)DNA提取(1.1)DNA提取将大豆、玉米、水稻标准品粉末及其它待检样品根据Wizard艮MagneticDNAPurificationSystemforFood试剂盒操作说明分别进行DNA提取。(1.2)DNA样品浓度检测DNA浓度通过核酸蛋白分析仪和电泳-EB染色的荧光强度双重测定。(2)引物设计利用PrimerPremierV5.0软件进行五重巢式PCR的引物设计，用OligoV6.22软件筛选出引物之间互相干扰最小的引物。引物所扩增目的片段及扩增产物大小如下表。表1多重巢式PCR所用引物序列及扩增片段大小Tab.ListofprimersinmultiplenestedPCR<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>PCR引物AATCTTCTACTGGTACATGGATheprimerofthefirstRbclWFRbclWRCTCATCATCTTTGGTAAAATCARBCL433multipleAGPCRGGACAACAACCCAAACATCACryWFCryWRACTTGGTACAGGTTGCTCAGGCCCTCCrylA(B)322BarWFBarWRGTCTGCACCATCGTCAACCACTCGGCCGTCCAGTCGTABAR201PatWFPatWRAGATTAGGCCAGCTACAGCAGCGCAACCAACCAAGGGTATCPAT160AATCTTCTACTGGTACATGGARbclNFRbclNRCGACCGTACTTGTTCAACTTATRBCL321第一轮多CC重PCR引物CP4NFCP4NRGGCGACGCCTCGCTCACAAGCGTCATGATCGGCTCGATGCP4-EPSPS240TheprimeroftheBarNFBarNRACAAGCACGGTCAACTTCCACTCGGCCGTCCAGTCGTABARH5secondmultipleCryNFCryNRGGACAACAACCCAAACATCAACCrylA(B)152PCRGCACGAACTCGCTGAGCAGPatNFPatNRAGATTAGGCCAGCTACAGCAGCACTCTTGTGGTGTTTGTGGCPAT100(3)五重巢式PCR反应体系(3.1)第一轮五重PCR反应体系及反应条件在第一轮五重PCR反应体系中，加DNA模板(500ng)，dNTP各0.2mmol/L，2xPCR缓冲液，引物混合液I10pL，DNA聚合酶4U，补水至50nL。扩增条件为95'C预变性10min，IO个循环(95°C，30sec;65°C，60s;72°C，60s);IO个循环(95。C，30sec;62°C，60s;72°C，60s);IO个循环(95°C，30sec;60°C，60s;72°C，60s);10个循环(95°C，30sec;58°C，60s;72°C，60s);最后72。C延伸lOmin。(3.2)第二轮五重PCR反应体系及反应条件取第一轮五重PCR产物lpL作为模板，进行五重巢式PCR第二轮扩增。反应体系加引物混合液ni0^iL，DNA聚合酶3U，其余同前。扩增条件同第一轮反应条件。(4)扩增产物检测两轮扩增产物用琼脂糖电泳检测。琼脂糖胶浓度为3%，胶中溴化乙锭浓度为0.5^g/mL，电泳缓冲液为lxTAE，DL-2000DNA做分子质量标准，电泳条件为以100V/cm电压，电泳30min。(5)结果判定(5.1)对照样品结果分析阳性对照PCR反应中，RBCL内标准基因和外源基因均得到了扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，而阴性对照中仅扩增出RBCL基因片段，空白对照中没有任何扩增片段，表明PCR反应体系正常工作，否则重新检测。(5.2)试样检测结果分析a)RBCL内标准基因和外源基因均得到了扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，表明试样中检测该外源基因，该样品中含有转该外源基因成分。b)RBCL内标准基因片段得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，而外源基因未得到扩增，或扩增片段大小与预期片段大小不一致，表明试样中未检测出CP4-EPSPS、CrylA(B)、PAT和BAR基因，该样品不含有转CP4-EPSPS、CrylA(B)、PAT和BAR基因成分。本发明方法的有益效果在于多重巢式PCR是近几年兴起的检测技术，它结合了巢式PCR的灵敏度高和多重PCR的操作简单、特异性高的特点，这两种方法的结合不但可以减少假阳性的出现，可以同时检测多个目的片段，而且可以使检测的下限下降几个数量级。多重巢式PCR的检测，提高了检测效率、减少了检测时间和检测成本，并可以有效减少假阳性的结果，因此，可以应用于对大豆、玉米和水稻的转基因深加工食品进行DNA检测，具有实际意义。本发明检测方法的灵敏度为0.005%，即多重巢式PCR检测体系可检出转CP4基因、CrylA(B)基因、BAR基因和PAT基因的量达0.005%以上的样品。此检测体系灵敏度高于Zimmermann等人用巢式PCR方法对转基因玉米进行检测所得灵敏度(0.01%);而与Forte等灵敏度0.5%)，Germini等(灵敏度0.25%)，Delano等(灵敏度0.1%)应用多重PCR进行转基因产品检测相比，本实验所用检测技术的灵敏度远远高于多重PCR。0.005%的灵敏度已经达到国际领先水平，可以完全满足大豆、玉米和水稻深加工产品的检测需要。另外，本发明方法对同一目的基因在不同品种和不同品系中的序列进行分析，在保守区域设计多对引物，筛选出了可以在不同品种和不同品系中通用的引物进行检测，大大提高了检测通量，提高了检测效率。此外，本发明方法选用了大豆、玉米和水稻中通用的内参照基因RBCL基因作为内源参照基因进行转基因检测，克服现行的"一种植物一种检测内对照"的弊病，不但可有效地防止假阴性结果的出现，而且还可以提高检测效率、縮短检测周期。综上所述，本发明方法具有高效、快速、低成本、高灵敏度等优点，为转基因检测技术提供了一个有效的检测方法，具有重要的实用价值。本检测方法有很高的经济价值采用本发明方法进行深加工制品的转基因检测，通过2次PCR反应即可检测出样品中是否含有转基因玉米BTll、BT176、Mon810、转BT基因水稻和转CP4-EPSPS基因大豆，而用传统的检测方法需要8次PCR反应才能完成，成本降低4倍。另外，该方法将为转基因农产品的进出口贸易提供有利的技术支撑，一方面，可以合理利用目前许多国家使用的，以转基因安全设置的贸易技术壁垒，保护我国的农产品市场；另一方面，也可以保障我国的农产品出口贸易可以根据不同国家对转基因标识管理的要求，为企业提供准确有效的检测参数，促进农产品和食品的国际贸易。为此，可以产生数亿元的经济效益；此外，该方法还可以直接为农业转基因生物安全管理提供技术支持，可以在农业转基因生物研究阶段、生产应用和监测中得到广泛的应用。农业转基因生物的安全研究、生产和商业化后的监测是农业转基因生物安全生产和管理的重要保证，是农业转基因生物可持续发展不可缺少的。该技术成果对保证转基因农产品的研究、生产、销售、加工在有序的管理要求下进行，其将为人民健康、环境安全和生物多样性产生重要的影响。(四)图1-图2为待测样品多重巢式PCR检测示意图。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明1、实验材料(1)阳性标准品转基因大豆、玉米、水稻；阴性标准品非转基因大豆、玉米、水稻；待检样品深加工产品大豆蛋白质粉、巧克力饮品、婴儿米粉、大豆卵磷脂、大豆油、大豆色拉油、玉米油、玉米淀粉、玉米蛋白粉、营养麦片、玉米泥；(2)试剂WizardMagneticDNAPurificationSystemforFood试剂盒；r-TaqDNA聚合酶、dNTP、10xPCR缓冲液(含MgC12)和DL-2000分子质量标准。2、主要仪器设备高速离心机(上海安亭，TDL-40B)、PCR仪(德国Biometra，BiometraTgradient)、核酸电泳仪(杭州大合，GE-IOO)、紫外分光光度仪(美国BECKMAN，DU640)、凝胶成像系统(美国UVP，G8000)。3、样品检测(1)样品DNA提取将大豆、玉米、水稻标准品粉末及其它待检样品根据WizardMagneticDNAPurificationSystemforFood试剂盒操作说明分别进行DNA提取，通过核酸蛋白分析仪和电泳-EB染色的荧光强度双重测定样品DNA浓度。(2)五重巢式PCR反应在第一轮五重PCR反应体系中，加样品DNA模板1^L(500ng)，dNTP各0.2mmol/L，2xPCR缓冲液，引物混合液I10pL，DNA聚合酶4U，补水至50pL。扩增条件为95'C预变性10min，IO个循环(95°C，30sec;65°C，60s;72°C，60s);IO个循环(95°C，30sec;62°C，60s;72°C，60s);IO个循环(95°C，30sec;60。C，60s;72。C，60s);IO个循环(95。C，30sec;58°C，60s;72°C，60s);最后72。C延伸10min。反应结束后，取第一轮五重PCR产物lpL作为模板，进行五重巢式PCR第二轮扩增。反应体系加引物混合液IIl(HiL，DNA聚合酶3U，其余同前。扩增条件同第一轮反应条件。(3)扩增产物检测两轮扩增产物用琼脂糖电泳检测。琼脂糖胶浓度为3%，胶中溴化乙锭浓度为0.5pg/mL，电泳缓冲液为lxTAE，DL-2000DNA做分子质量标准，电泳条件为以100V/cm电压，电泳30min。结果如图显示，阴性对照中仅扩增出RBCL基因，阳性对照的CP4-EPSPS基因、RBCL基因、CrylA(B)基因、BAR基因和PAT基因扩增片段大小与预期结果一致。阴性对照结果表明实验过程中无假阳性结果，排除转基因成分污染的可能；阳性对照结果说明扩增体系正常，可以扩增出目的基因；空白对照无扩增条带说明PCR反应体系无污染。样品卵磷脂、大豆蛋白质粉、巧克力饮品、婴儿米粉扩增出RBCL基因和CP4-EPSPS基因片段，即以上4种样品含有转CP4-EPSPS基因成分；大豆精炼油大豆色拉油和玉米油未检出任何条带，即未从这3种样品中提取出DNA;玉米淀粉和玉米泥扩增出RBCL基因、CrylA(B)基因和PAT基因片段，即以上两种样品含有转CrylA(B)基因和PAT基因成分；玉米蛋白粉扩增出RBCL基因、CrylA(B)基因和BAR基因片段，即含有转CrylA(B)基因和BAR基因成分；营养麦片扩增出RBCL基因和CrylA(B)基因片段，即含有转CrylA(B)基因成分。结合图1-图2，图1为第一轮扩增结果的电泳图，图2为第二轮扩增结果的电泳图，其中A，第一轮PCR扩增；B，第二轮PCR扩增；M，DL-2000分子质量标准；1，空白对照；2，阴性对照；3，阳性对照；4，卵磷脂；5，大豆蛋白质粉；6，巧克力饮品；7，婴儿米粉;8，大豆精炼油；9，大豆色拉油；10，玉米油；11，玉米淀粉；12，玉米蛋白粉；13，营养麦片；14，玉米泥。4、结果判定(1)对照样品结果分析阳性对照PCR反应中，RBCL内标准基因和外源基因均得到了扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，而阴性对照中仅扩增出RBCL基因片段，空白对照中没有任何扩增片段，表明PCR反应体系正常工作，否则重新检测。(2)试样检测结果分析a)RBCL内标准基因和外源基因均得到了扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，表明试样中检测该外源基因，该样品中含有转该外源基因成分。b)RBCL内标准基因片段得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，而外源基因未得到扩增，或扩增片段大小与预期片段大小不一致，表明试样中未检测出CP4-EPSPS、CrylA(B)、PAT和BAR基因，该样品不含有转CP4-EPSPS、CrylA(B)、PAT和BAR基因成分。权利要求1.一种粮食作物深加工制品高通量五重巢式PCR转基因检测方法，其特征在于其检测方法为材料阳性标准品转基因大豆、玉米、水稻；阴性标准品非转基因大豆、玉米、水稻；待检样品深加工产品大豆蛋白质粉、巧克力饮品、婴儿米粉、大豆卵磷脂、大豆油、大豆色拉油、玉米油、玉米淀粉、玉米蛋白粉、营养麦片、玉米泥；试剂id="icf0001"file="A2008101374610002C1.tif"wi="13"he="3"top="82"left="42"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>MagneticDNAPurificationSystemforFood试剂盒，r-TaqDNA聚合酶、dNTP、10×PCR缓冲液(含MgCl2)和DLDNA2000分子质量标准；(1)DNA提取(1.1)DNA提取将大豆、玉米、水稻标准品粉末及其它待检样品根据id="icf0002"file="A2008101374610002C2.tif"wi="13"he="3"top="113"left="124"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>MagneticDNAPurificationSystemforFood试剂盒操作说明分别进行DNA提取；(1.2)DNA样品浓度检测DNA浓度通过核酸蛋白分析仪和电泳-EB染色的荧光强度双重测定；(2)引物设计利用PrimerPremierV5.0软件进行五重巢式PCR的引物设计，用OligoV6.22软件筛选出引物之间互相干扰最小的引物，引物所扩增目的片段及扩增产物大小如下表表多重巢式PCR所用引物序列及扩增片段大小<tablesid="tabl0001"num="0001"></tables><tablesid="tabl0002"num="0002"></tables>(3)五重巢式PCR反应体系(3.1)第一轮五重PCR反应体系及反应条件在第一轮五重PCR反应体系中，加DNA模板1μL(500ng)，dNTP各0.2mmol/L，2×PCR缓冲液，引物混合液I10μL，DNA聚合酶4U，补水至50μL，扩增条件为95℃预变性10min，10个循环(95℃，30sec；65℃，60s；72℃，60s)；10个循环(95℃，30sec；62℃，60s；72℃，60s)；10个循环(95℃，30sec；60℃，60s；72℃，60s)；10个循环(95℃，30sec；58℃，60s；72℃，60s)；最后72℃延伸10min；(3.2)第二轮五重PCR反应体系及反应条件取第一轮五重PCR产物1μL作为模板，进行五重巢式PCR第二轮扩增，反应体系加引物混合液II10μL，DNA聚合酶3U，其余同前。扩增条件同第一轮反应条件；(4)扩增产物检测两轮扩增产物用琼脂糖电泳检测，琼脂糖胶浓度为3％，胶中溴化乙锭浓度为0.5μg/mL，电泳缓冲液为1×TAE，DL-2000DNA做分子质量标准，电泳条件为以100V/cm电压，电泳30min；(5)结果判定(5.1)对照样品结果分析阳性对照PCR反应中，RBCL内标准基因和外源基因均得到了扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，而阴性对照中仅扩增出RBCL基因片段，空白对照中没有任何扩增片段，表明PCR反应体系正常工作，否则重新检测；(5.2)试样检测结果分析a)RBCL内标准基因和外源基因均得到了扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，表明试样中检测该外源基因，该样品中含有转该外源基因成分；b)RBCL内标准基因片段得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，而外源基因未得到扩增，或扩增片段大小与预期片段大小不一致，表明试样中未检测出CP4-EPSPS、Cry1A(B)、PAT和BAR基因，该样品不含有转CP4-EPSPS、Cry1A(B)、PAT和BAR基因成分。全文摘要本发明公开一种粮食作物深加工制品五重巢式PCR转基因检测方法，其检测方法为1.DNA提取和浓度检测；2.引物设计；3.第一、二轮五重巢式PCR反应体系及反应条件；4.扩增产物检测；5.结果判定。本发明技术具有高通量、快捷、准确、灵敏、经济的诸多优点，不仅可以用来检测转基因大豆、玉米和水稻的单一深加工制品，还可以检测转基因大豆、玉米和水稻的混合深加工制品。本发明提高了检测效率、减少了检测时间和检测成本，并可以有效减少假阳性的结果，因此，可以应用于对主要粮食作物如大豆、玉米和水稻豆油等转基因深加工食品进行DNA检测，具有实际意义。文档编号C12Q1/68GK101402996SQ20081013746公开日2009年4月8日申请日期2008年11月6日优先权日2008年11月6日发明者仇有文,营刘,敖金霞,波曲,李庆章,袁肖寒,高学军申请人:东北农业大学